El uso de microscopía lapso de tiempo para Visualizar anoxia inducida animación suspendida en
3 de diciembre de 2012
Descrito aquí es un In vivo Técnica de imagen sub-estructuras celulares en animales expuestos a la anoxia usando un flujo de gas a través de la cámara de microincubation en conjunción con un microscopio confocal de disco giratorio. Este método es sencillo y lo suficientemente flexible como para adaptarse a una variedad de parámetros experimentales y los sistemas del modelo.
El objetivo general de este procedimiento es describir una técnica in vivo para visualizar la dinámica subcelular en embriones de Caenorhabditis elegans expuestos a anoxia, utilizando un sistema de flujo de gas en un microscopio de alta potencia. Esto se logra primero preparando una muestra de animales transgénicos jóvenes adultos para obtener una población adecuada de embriones jóvenes para la observación. A continuación, prepárense portaobjetos con almohadillas delgadas de agarosa para su uso en la cámara de microincubación.
Luego, los erizos de mar se anestesian adecuadamente y se cubren con aceite de halo carbono para evitar la desecación cuando se exponen al flujo de gas. Finalmente, el cubreobjetos redondo con los animales anestesiados se coloca en la cámara de microincubación. La cámara se coloca entonces en la platina del microscopio y se llena con gas nitrógeno para crear un entorno anóxico durante la adquisición de imágenes, utilizando finalmente un flujo de gas a través de la cámara de microincubación.
En combinación con la microscopía de fluorescencia in vivo, permite obtener videos e imágenes detalladas con alta resolución de la detención del ciclo celular en respuesta a la anoxia. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la inmunofluorescencia indirecta es que los cambios subcelulares pueden documentarse in vivo mientras los animales están expuestos a condiciones específicas. Aunque este método puede proporcionar información sobre la animación suspendida inducida por anoxia en embriones de elegans.
También puede aplicarse a otros sistemas como levaduras, cultivos celulares u otros embriones de invertebrados o vertebrados pequeños. También pueden aplicarse condiciones adicionales como hiperoxia, temperatura, estrés o tratamiento con moléculas pequeñas. Demostrando este procedimiento están Anastacia Garcia y Mary Latt, dos estudiantes de posgrado de mi laboratorio. Comience con una cepa transgénica adecuada de C. elegans de interés; en este estudio, se utilizará la cepa transgénica TH32 para visualizar cromosomas y centrosomas como marcadores de la división celular.
Genere una población sincronizada desintegrando adultos por gravedad en solución de hipoclorito y utilice los embriones restantes seleccionando adultos por gravedad en una placa sembrada y dejando que pongan huevos durante una a dos horas, o seleccione larvas L4 de una población mixta y colóquelas en una nueva placa sembrada. Cultive los nematodos a 20 grados Celsius hasta alcanzar la juventud adulta en estado GR, lo que tomará aproximadamente 96 horas desde la eclosión, 72 horas desde las larvas L1 o 24 horas posteriores a la muda L4. Esta metodología proporciona un medio para generar una población de adultos jóvenes que contengan un gran número de embriones jóvenes, los cuales poseen blastómeros grandes y núcleos óptimos para la obtención de imágenes de cambios subcelulares y subnucleares.
Para preparar una cámara húmeda que contenga las laminillas preparadas, coloque una toalla de papel húmeda dentro de una placa de Petri grande o recipiente con tapa de tamaño adecuado. Prepare agarosa al 2% fundida en agua desionizada calentando la mezcla en material de vidrio mediante un microondas o baño de agua. A continuación, coloque de una a tres gotas de agarosa tibia sobre una laminilla de microscopio limpia, coloque inmediatamente una segunda laminilla invertida perpendicularmente encima de las gotas de agarosa y presione ligeramente para que la almohadilla resultante sea delgada y libre de burbujas de aire.
Después de que el aros se haya enfriado, separen lentamente las dos laminillas de microscopio, dejando la almohadilla de aros intacta en una de las laminillas. Es importante asegurarse de que la almohadilla de aros sea lo suficientemente delgada como para no interferir con la capacidad de enfocar el microscopio. Posteriormente, utilicen una cuchilla limpia para darle forma de un pequeño cuadrado a la almohadilla de aros y guárdenla.
Coloque las láminas en la cámara húmeda preparada hasta que estén listas para usar. Utilizando la misma cuchilla limpia, tome cuidadosamente el borde de la almohadilla de aros y transfiérala desde la lámina a un cubreobjetos micro redondo de 25 milímetros. Evite la acumulación de burbujas de aire debajo del cubreobjetos redondo; este debe ajustarse adecuadamente en el microincubador.
Agregue una gota de anestésico sobre el disco de aros. Seleccione cinco a diez gusanos y colóquelos en la gota de anestésico. Espere de uno a tres minutos hasta que los gusanos dejen de moverse.
Con la punta de una pipeta, agregue una gota de aceite de carbono hueco encima de los gusanos para evitar que se deshidraten mientras el gas fluye a través de la cámara. A continuación, conecte un extremo del tubo plástico flexible a la cámara. Separe las dos mitades del microincubadora de perfusión cerrada y coloque cuidadosamente el cubreobjetos en posición vertical sobre el anillo inferior.
Cierre firmemente los dos lados de la cámara. Luego conecte la cámara mediante el tubo plástico flexible al tanque de gas nitrógeno y colóquela sobre la platina del microscopio. Verifique posibles fugas asegurando la fijación segura del tubo y los tapones del puerto a lo largo del costado de la cámara para observar los embriones.
Primero, localice los animales con un aumento bajo. Luego, pase al aumento superior adecuado. Para obtener imágenes de blasfemos embrionarios en adultos, utilice el láser de 488 nanómetros para localizar la proteína de fusión GFP en las células de interés.
Para visualizar una etapa específica de la detención del ciclo celular, por ejemplo, profase tardía, identifique un blasfemo en una etapa previa de la división celular, como interfase tardía o profase temprana. Perfunda la cámara con gas nitrógeno y continúe monitoreando los blasfemos mientras el nitrógeno llena la cámara, ajustando el plano focal según sea necesario. Realice imágenes de lapso de tiempo para capturar el fenómeno de interés deseado en este caso.
Arresto en profase y anclaje de los cromosomas a la membrana nuclear interna. Tome imágenes una vez cada 10 segundos durante un máximo de 30 minutos. Por lo general, el arresto en profase inducido por anoxia ocurre dentro de los 20 a 30 minutos posteriores al inicio del flujo de gas nitrógeno.
Para documentar la recuperación del estado de arresto inducido por anoxia, apague el gas y permita que la cámara regrese a normoxia mientras registra una serie de imágenes cronológicas. La reanudación del ciclo celular y la desaparición de los cromosomas generalmente ocurren dentro de los cinco a veinte minutos. Utilice ImageJ o Photoshop para procesar imágenes y videos e impórtelos a QuickTime para su visualización.
Dentro del embrión expuesto a anoxia, los cromosomas en profase se condensarán y se alinearán con la periferia interna del núcleo. Un fenómeno conocido como anclaje cromosómico; al restablecerse el oxígeno, la progresión del ciclo celular se reanudará y los cromosomas en profase continuarán su desarrollo.
La blasfemia se moverá desde la periferia nuclear hacia la placa ecuatorial, indicando la progresión a metafase. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres a cuatro horas utilizando animales adecuadamente estadiados. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar únicamente animales adultos jóvenes sanos, reservar suficiente tiempo para completar el experimento y tener paciencia al aprender a seleccionar blasfemadores adecuadamente estadiados.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo capturar eventos subcelulares inducidos por anoxia in vivo utilizando embriones de GaN y una cámara de flujo de gas en un microscopio de alto poder.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este artículo describe una técnica in vivo para obtener imágenes de la dinámica subcelular en embriones de Caenorhabditis elegans expuestos a anoxia. El método utiliza un flujo de gas a través de una cámara de microincubación en conjunto con un microscopio confocal de disco giratorio de alto rendimiento.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Técnicas de imagen
Antecedentes
- La imagen subcelular es fundamental para comprender las respuestas celulares al estrés ambiental.
- La anoxia puede afectar significativamente la dinámica y viabilidad celulares.
- Caenorhabditis elegans sirve como organismo modelo para estudios de biología del desarrollo.
- Las técnicas de imagen de alta resolución son esenciales para observar procesos dinámicos en especímenes vivos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para la obtención de imágenes de estructuras subcelulares en embriones vivos bajo condiciones anóxicas.
- Mejorar la comprensión de las respuestas celulares a la privación de oxígeno.
- Proporcionar una técnica de imagen flexible adecuada para diversas configuraciones experimentales.
Métodos Utilizados
- Preparación de nematodos marinos transgénicos adultos jóvenes para generar embriones.
- Uso de portaobjetos con cojín de agar delgado en una cámara de microincubación.
- Anestesia de nematodos marinos con aceite de halo carbono para prevenir la desecación.
- Adquisición de imágenes mediante un microscopio confocal de disco giratorio bajo flujo de gas nitrógeno para crear un entorno anóxico.
Resultados principales
- La técnica permite la obtención de imágenes en tiempo real de la dinámica subcelular en embriones.
- Mantenimiento exitoso de condiciones anóxicas durante la obtención de imágenes.
- Flexibilidad demostrada para diversos parámetros experimentales.
- Proporcionó información sobre los efectos de la anoxia en los procesos celulares.
Conclusiones
- Este método es una herramienta valiosa para estudiar las respuestas celulares a la anoxia.
- Puede adaptarse a diferentes sistemas modelo y condiciones experimentales.
- Los hallazgos contribuyen a la comprensión de la dinámica subcelular en condiciones de estrés.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Esta técnica permite la visualización en tiempo real de la dinámica subcelular en embriones vivos bajo condiciones anóxicas controladas, proporcionando información mecanicista sobre la detención del ciclo celular inducida por estrés. Al capturar la detención reversible en profase y la anclaje cromosómico en C. elegans, apoya la validación de dianas en vías que regulan la animación suspendida y la latencia metabólica. El enfoque ofrece un sistema relevante para enfermedades que permite investigar mecanismos de detección de oxígeno con confianza predictiva en la reducción de riesgos preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la visualización in vivo del arresto del ciclo celular inducido por anoxia, aclarando la dinámica de las vías en la privación de oxígeno.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de objetivos mediante la observación directa de cambios subcelulares sin artefactos de fijación.
- Valor predictivo: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al vincular la exposición a anoxia con métricas cuantificables de progresión del ciclo celular.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Preparación del ensayo: Prepara sistemas biológicos validados utilizando reporteros marcados con GFP para obtener imágenes estandarizadas y reproducibles de la dinámica de la división celular.
- Resultados cuantitativos: Genera datos de lapso de tiempo que permiten medir el inicio, la duración y la cinética de recuperación del arresto bajo gradientes definidos de oxígeno.
- Escalabilidad de la plataforma: Se adapta a flujos de trabajo de cribado de alto contenido para moléculas pequeñas o modificadores genéticos que afectan las vías de respuesta al estrés.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela la lesión por isquemia-reperfusión y el estrés hipóxico en contextos del desarrollo, alineándose con el descubrimiento traslacional de biomarcadores.
- Continuidad preclínica: Conecta el descubrimiento con la validación preclín游戏副本ica mediante el monitoreo de respuestas celulares conservadas a la anoxia en diversos sistemas modelo.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Orienta los criterios de avance/no avance basándose en umbrales de arresto fenotípico reversible y recuperación.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar datos de imágenes en células vivas que informan sobre estudios de interacción con el blanco y modulación de vías antes de la identificación del fármaco líder.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre las vías de detección de oxígeno mediante la visualización directa de la detención y recuperación del ciclo celular en embriones.
- Selección: Ofrece sistemas listos para ensayos con lecturas cuantitativas sobre la progresión mitótica, permitiendo la selección de compuestos que modulen la animación suspendida.
- Análisis: Proporciona mediciones resueltas en el tiempo de la duración de la detención en profase y de la dinámica cromosómica, facilitando el análisis comparativo entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con estudios preclínicos mediante la modelización de respuestas al estrés hipóxico relevantes para la isquemia, el accidente cerebrovascular y los trastornos metabólicos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de imagenología reutilizable aplicable a levaduras, embriones de vertebrados y sistemas de cultivo celular bajo diversos agentes estresantes.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva en la validación de dianas al reducir la ambigüedad en los vínculos mecanicistas entre anoxia y la regulación del ciclo celular.
- Valor operativo: Garantiza la estandarización y la reproducibilidad mediante el control del flujo de gas y el diseño de la cámara ambiental.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al permitir la detección temprana de efectos citotóxicos o citostáticos en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de compuestos que dirigen sus efectos a las vías del factor inducible por hipoxia (HIF) o a las respuestas al estrés mitocondrial.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de cepas transgénicas, preparación de embriones y microscopía de fluorescencia en células vivas.
- Depende de la microscopía confocal de disco giratorio, sistemas de control de flujo de gas y mantenimiento de cámaras ambientales.
- Necesita la estandarización del tiempo de exposición a anoxia, control de temperatura y protocolos de recuperación entre diferentes equipos.
- Implica consideraciones de adaptación para distintos sistemas modelo, incluyendo la determinación de etapas embrionarias y compatibilidad de reporteros.
- Se encuentra limitado por la necesidad de etiquetas fluorescentes tolerantes al oxígeno y la posible fototoxicidad durante la adquisición prolongada de imágenes en intervalos de tiempo.
