3 de diciembre de 2012
Descrito aquí es un In vivo Técnica de imagen sub-estructuras celulares en animales expuestos a la anoxia usando un flujo de gas a través de la cámara de microincubation en conjunción con un microscopio confocal de disco giratorio. Este método es sencillo y lo suficientemente flexible como para adaptarse a una variedad de parámetros experimentales y los sistemas del modelo.
El objetivo general de este procedimiento es describir una técnica in vivo para visualizar la dinámica subcelular en embriones de Caenorhabditis elegans expuestos a anoxia, utilizando un sistema de flujo de gas en un microscopio de alta potencia. Esto se logra primero preparando una muestra de animales transgénicos jóvenes adultos para obtener una población adecuada de embriones jóvenes para la observación. A continuación, prepárense portaobjetos con almohadillas delgadas de agarosa para su uso en la cámara de microincubación.
Luego, los erizos de mar se anestesian adecuadamente y se cubren con aceite de halo carbono para evitar la desecación cuando se exponen al flujo de gas. Finalmente, el cubreobjetos redondo con los animales anestesiados se coloca en la cámara de microincubación. La cámara se coloca entonces en la platina del microscopio y se llena con gas nitrógeno para crear un entorno anóxico durante la adquisición de imágenes, utilizando finalmente un flujo de gas a través de la cámara de microincubación.
En combinación con la microscopía de fluorescencia in vivo, permite obtener videos e imágenes detalladas con alta resolución de la detención del ciclo celular en respuesta a la anoxia. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la inmunofluorescencia indirecta es que los cambios subcelulares pueden documentarse in vivo mientras los animales están expuestos a condiciones específicas. Aunque este método puede proporcionar información sobre la animación suspendida inducida por anoxia en embriones de elegans.
También puede aplicarse a otros sistemas como levaduras, cultivos celulares u otros embriones de invertebrados o vertebrados pequeños. También pueden aplicarse condiciones adicionales como hiperoxia, temperatura, estrés o tratamiento con moléculas pequeñas. Demostrando este procedimiento están Anastacia Garcia y Mary Latt, dos estudiantes de posgrado de mi laboratorio. Comience con una cepa transgénica adecuada de C. elegans de interés; en este estudio, se utilizará la cepa transgénica TH32 para visualizar cromosomas y centrosomas como marcadores de la división celular.
Genere una población sincronizada desintegrando adultos por gravedad en solución de hipoclorito y utilice los embriones restantes seleccionando adultos por gravedad en una placa sembrada y dejando que pongan huevos durante una a dos horas, o seleccione larvas L4 de una población mixta y colóquelas en una nueva placa sembrada. Cultive los nematodos a 20 grados Celsius hasta alcanzar la juventud adulta en estado GR, lo que tomará aproximadamente 96 horas desde la eclosión, 72 horas desde las larvas L1 o 24 horas posteriores a la muda L4. Esta metodología proporciona un medio para generar una población de adultos jóvenes que contengan un gran número de embriones jóvenes, los cuales poseen blastómeros grandes y núcleos óptimos para la obtención de imágenes de cambios subcelulares y subnucleares.
Para preparar una cámara húmeda que contenga las laminillas preparadas, coloque una toalla de papel húmeda dentro de una placa de Petri grande o recipiente con tapa de tamaño adecuado. Prepare agarosa al 2% fundida en agua desionizada calentando la mezcla en material de vidrio mediante un microondas o baño de agua. A continuación, coloque de una a tres gotas de agarosa tibia sobre una laminilla de microscopio limpia, coloque inmediatamente una segunda laminilla invertida perpendicularmente encima de las gotas de agarosa y presione ligeramente para que la almohadilla resultante sea delgada y libre de burbujas de aire.
Después de que el aros se haya enfriado, separen lentamente las dos laminillas de microscopio, dejando la almohadilla de aros intacta en una de las laminillas. Es importante asegurarse de que la almohadilla de aros sea lo suficientemente delgada como para no interferir con la capacidad de enfocar el microscopio. Posteriormente, utilicen una cuchilla limpia para darle forma de un pequeño cuadrado a la almohadilla de aros y guárdenla.
Coloque las láminas en la cámara húmeda preparada hasta que estén listas para usar. Utilizando la misma cuchilla limpia, tome cuidadosamente el borde de la almohadilla de aros y transfiérala desde la lámina a un cubreobjetos micro redondo de 25 milímetros. Evite la acumulación de burbujas de aire debajo del cubreobjetos redondo; este debe ajustarse adecuadamente en el microincubador.
Agregue una gota de anestésico sobre el disco de aros. Seleccione cinco a diez gusanos y colóquelos en la gota de anestésico. Espere de uno a tres minutos hasta que los gusanos dejen de moverse.
Con la punta de una pipeta, agregue una gota de aceite de carbono hueco encima de los gusanos para evitar que se deshidraten mientras el gas fluye a través de la cámara. A continuación, conecte un extremo del tubo plástico flexible a la cámara. Separe las dos mitades del microincubadora de perfusión cerrada y coloque cuidadosamente el cubreobjetos en posición vertical sobre el anillo inferior.
Cierre firmemente los dos lados de la cámara. Luego conecte la cámara mediante el tubo plástico flexible al tanque de gas nitrógeno y colóquela sobre la platina del microscopio. Verifique posibles fugas asegurando la fijación segura del tubo y los tapones del puerto a lo largo del costado de la cámara para observar los embriones.
Primero, localice los animales con un aumento bajo. Luego, pase al aumento superior adecuado. Para obtener imágenes de blasfemos embrionarios en adultos, utilice el láser de 488 nanómetros para localizar la proteína de fusión GFP en las células de interés.
Para visualizar una etapa específica de la detención del ciclo celular, por ejemplo, profase tardía, identifique un blasfemo en una etapa previa de la división celular, como interfase tardía o profase temprana. Perfunda la cámara con gas nitrógeno y continúe monitoreando los blasfemos mientras el nitrógeno llena la cámara, ajustando el plano focal según sea necesario. Realice imágenes de lapso de tiempo para capturar el fenómeno de interés deseado en este caso.
Arresto en profase y anclaje de los cromosomas a la membrana nuclear interna. Tome imágenes una vez cada 10 segundos durante un máximo de 30 minutos. Por lo general, el arresto en profase inducido por anoxia ocurre dentro de los 20 a 30 minutos posteriores al inicio del flujo de gas nitrógeno.
Para documentar la recuperación del estado de arresto inducido por anoxia, apague el gas y permita que la cámara regrese a normoxia mientras registra una serie de imágenes cronológicas. La reanudación del ciclo celular y la desaparición de los cromosomas generalmente ocurren dentro de los cinco a veinte minutos. Utilice ImageJ o Photoshop para procesar imágenes y videos e impórtelos a QuickTime para su visualización.
Dentro del embrión expuesto a anoxia, los cromosomas en profase se condensarán y se alinearán con la periferia interna del núcleo. Un fenómeno conocido como anclaje cromosómico; al restablecerse el oxígeno, la progresión del ciclo celular se reanudará y los cromosomas en profase continuarán su desarrollo.
La blasfemia se moverá desde la periferia nuclear hacia la placa ecuatorial, indicando la progresión a metafase. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres a cuatro horas utilizando animales adecuadamente estadiados. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar únicamente animales adultos jóvenes sanos, reservar suficiente tiempo para completar el experimento y tener paciencia al aprender a seleccionar blasfemadores adecuadamente estadiados.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo capturar eventos subcelulares inducidos por anoxia in vivo utilizando embriones de GaN y una cámara de flujo de gas en un microscopio de alto poder.
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Este artículo describe una técnica in vivo para obtener imágenes de la dinámica subcelular en embriones de Caenorhabditis elegans expuestos a anoxia. El método utiliza un flujo de gas a través de una cámara de microincubación en conjunto con un microscopio confocal de disco giratorio de alto rendimiento.
Esta técnica permite la visualización en tiempo real de la dinámica subcelular en embriones vivos bajo condiciones anóxicas controladas, proporcionando información mecanicista sobre la detención del ciclo celular inducida por estrés. Al capturar la detención reversible en profase y la anclaje cromosómico en C. elegans, apoya la validación de dianas en vías que regulan la animación suspendida y la latencia metabólica. El enfoque ofrece un sistema relevante para enfermedades que permite investigar mecanismos de detección de oxígeno con confianza predictiva en la reducción de riesgos preclínicos.
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar datos de imágenes en células vivas que informan sobre estudios de interacción con el blanco y modulación de vías antes de la identificación del fármaco líder.