El uso de microscopía lapso de tiempo para Visualizar anoxia inducida animación suspendida en C. elegans Los embriones

El objetivo general de este procedimiento es describir una técnica in vivo para obtener imágenes de la dinámica subcelular en embriones de elegancia marina expuestos a anoxia utilizando un flujo de gas en un microscopio de alta potencia. Esto se logra preparando primero una muestra de animales transgénicos adultos jóvenes para generar una población adecuada de embriones jóvenes para la obtención de imágenes. A continuación, prepare portaobjetos finos de almohadilla agros para su uso en la cámara de microincubación.

A continuación, los colores del mar se anestesian adecuadamente y se cubren con aceite de carbono halo para evitar la desecación al exponerse al flujo de gas. Finalmente, el cubreobjetos redondo con los animales anestesiados se coloca en la cámara de microincubación. A continuación, la cámara se coloca en la platina del microscopio y se llena de gas nitrógeno para producir un entorno anóxico mientras se obtienen imágenes del uso de un flujo de gas a través de la cámara de microincubación.

Junto con la microscopía de fluorescencia in vivo, permite videos e imágenes detallados de alta resolución de la detención del ciclo celular en respuesta a la anoxia. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la inmunofluorescencia indirecta, es que los cambios subcelulares se pueden documentar in vivo mientras los animales están expuestos a condiciones específicas. Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre la animación suspendida inducida por la anoxia en embriones de elegans.

También se puede aplicar a otros sistemas como levaduras, cultivos celulares u otros pequeños embriones de invertebrados o vertebrados. También se pueden aplicar condiciones adicionales como hiperoxia, temperatura, estrés o tratamiento con moléculas pequeñas. Anastacia García y Mary Latt, dos estudiantes graduadas de mi laboratorio, están demostrando este procedimiento para comenzar con una cepa transgénica C Elgan apropiada de interés en este estudio, la cepa transgénica TH 32 se utilizará para visualizar cromosomas y centrosomas como marcadores para la división celular.

Genere una población sincronizada mediante la desintegración de adultos por gravedad en una solución de hipoclorito y utilice los embriones restantes recogiendo adultos por gravedad en una placa y un huevo sembrados, poniendo una o dos horas, o recogiendo L cuatro larvas de una población mixta en una nueva placa sembrada. Cultive nematodos a 20 grados Celsius hasta la adultez temprana, lo que tomará aproximadamente 96 horas desde la eclosión, 72 horas desde las larvas L uno o 24 horas después de la muda L cuatro. Esta metodología proporciona un medio para generar una población de adultos jóvenes que contiene un número abundante de embriones jóvenes, que contienen blasfemos grandes y núcleos que son óptimos para obtener imágenes de cambios subcelulares y subnucleoidales.

Para configurar una cámara húmeda para contener los portaobjetos preparados, coloque una toalla de papel húmeda dentro de una placa de Petri grande o un contenedor cubierto con una tapa de tamaño suficiente. Prepare 2%aros fundidos en agua desionizada calentando la mezcla en cristalería a través de un microondas o baño de agua. A continuación, coloque de una a tres gotas de aros calientes en un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio, coloque inmediatamente un segundo portaobjetos invertido perpendicularmente encima de las gotas de aros y presione ligeramente para que la almohadilla resultante sea delgada y libre de burbujas de aire.

Después de que el aros se haya enfriado, separe lentamente los dos portaobjetos del microscopio, dejando intacta la almohadilla del aros en uno de los portaobjetos. Es importante asegurarse de que la almohadilla aros sea lo suficientemente delgada como para no interferir con la capacidad de enfocar el microscopio. Más tarde. Use una hoja de afeitar limpia para dar forma a la almohadilla Aros en una pequeña tienda cuadrada.

Se desliza en la cámara húmeda preparada hasta que esté listo para usar. Con la misma hoja de afeitar limpia, tome con cuidado el borde de la almohadilla aros y transfiéralo de la corredera a un micro cubreobjetos redondo de 25 milímetros. Para evitar la acumulación de burbujas de aire debajo de la cubierta redonda, el vidrio debe caber adecuadamente en la microincubadora.

Agregue una gota de anestésico en la almohadilla aros. Escoge de cinco a 10 gusanos y colócalos en la gota de anestésico. Espere de uno a tres minutos para que los gusanos dejen de moverse.

Con la punta de una pipeta, agregue una gota de aceite de carbón sagrado encima de las lombrices para evitar que se deshidraten a medida que el gas fluye a través de la cámara. A continuación, conecte un extremo del tubo de plástico flexible a la cámara. Separe las dos mitades de la microincubadora de perfusión cerrada y coloque con cuidado el cubreobjetos en posición vertical sobre el anillo inferior.

Cierre bien los dos lados de la cámara. A continuación, conecte la cámara al depósito de gas nitrógeno a través del tubo de plástico flexible y colóquela en la platina del microscopio. Verifique si hay fugas asegurándose de que los tubos y los tapones de los puertos estén seguros a lo largo del costado de la cámara para obtener imágenes de los embriones.

Primero, ubique a los animales con un aumento más bajo. A continuación, pase a la ampliación superior adecuada. Para obtener imágenes de blasfemos embrionarios en adultos, utilice el láser de 488 nanómetros para localizar la proteína de fusión GFP en las células de interés.

Para visualizar una etapa específica de la detención del ciclo celular, por ejemplo, la profase tardía, identifique a un blasfemo en una etapa previa de la división celular, como la interfase tardía o la profase temprana. Perfunda la cámara con gas nitrógeno y continúe monitoreando los blasfemos a medida que el nitrógeno llena la cámara, ajustando el plano focal según sea necesario. Realice imágenes de lapso de tiempo para capturar el fenómeno deseado de interés en este caso.

Detención de la profase y acoplamiento de los cromosomas a la membrana nuclear interna. Tome imágenes una vez cada 10 segundos durante un máximo de 30 minutos. Por lo general, la detención de la profase inducida por anoxia ocurre dentro de los 20 a 30 minutos posteriores al inicio del flujo de gas nitrógeno.

Para documentar la recuperación del estado detenido inducido por la anoxia, apague el gas y permita que la cámara vuelva a la normoxia mientras graba una serie de lapso de tiempo. La reanudación del ciclo celular y el deshecho de los cromosomas suelen producirse en un plazo de cinco a 20 minutos. Utilice erris image J o Photoshop para procesar imágenes y vídeos e importarlos a QuickTime para su visualización.

Dentro del embrión expuesto a la anoxia, los cromosomas de la profase. Los blasfemos se condensarán y se alinearán con la periferia nuclear interna. Un fenómeno conocido como acoplamiento cromosómico en la reoxigenación se reanudará la progresión del ciclo celular y los cromosomas de la profase.

La blasfemia se moverá de la periferia nuclear a la placa ecuatorial, lo que indica la progresión a la metafase. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres o cuatro horas utilizando animales adecuadamente escenificados. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que solo se deben usar animales adultos jóvenes sanos para reservar el tiempo suficiente para completar el experimento y tener paciencia al aprender a elegir blasfemos con la puesta en escena adecuada.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo capturar eventos subcelulares inducidos por anoxia in vivo utilizando embriones de GaN y un flujo de gas a través de la cámara en un microscopio de alta potencia.