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El objetivo general de este procedimiento es registrar la actividad eléctrica de los nervios, músculos y neuronas, así como los movimientos correspondientes del aparato bucal durante los programas motores de alimentación. Esto se logra primero extrayendo la masa bucal de una pleurobranchia anestesiada y colocando electrodos de gancho en nervios y músculos clave. El segundo paso consiste en colocar la masa bucal en una placa de registro y preparar los ganglios para la grabación extracelular.

A continuación, se localizan las neuronas diana utilizando electrodos extracelulares. El paso final consiste en inducir y registrar programas motores de alimentación, como morder, tragar y rechazar. En última instancia, se utiliza la preparación de la masa bucal suspendida para mostrar la actividad de los nervios, los músculos y las neuronas individuales durante diferentes movimientos similares a la alimentación de la masa bucal.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como los estudios de ganglios aislados es que las grabaciones de nervios, músculos y neuronas individuales pueden relacionarse directamente con los movimientos del aparato alimentario. Quien ayudará a demostrar el procedimiento será huu, un estudiante de posgrado de nuestro laboratorio. Para comenzar el procedimiento, anestesie una plejía sana de 200 a 300 gramos en una bandeja de disección inyectando aproximadamente el 50 % del peso corporal en cloruro de magnesio isotónico. Después de la primera inyección cerca de la cola del animal, masajee suavemente la superficie del animal para distribuir el cloruro de magnesio.

Administre inyecciones adicionales cerca de la cabeza del animal según sea necesario. Después de que el animal deje de responder a estímulos táctiles suaves, fíjelo en la bandeja con el lado dorsal hacia arriba. Coloque un alfiler en la cola y un alfiler en cada tentáculo anterior.

Luego, use la pinza para pellizcar y levantar la piel del animal en la parte media de la cabeza. Detrás de los cuernos del rinoceronte, realice una incisión coronal a través de la cabeza del animal, justo detrás del punto que se está sujetando. Después de eso, haga una incisión sagital media entre los cuernos del rinoceronte hacia la boca para exponer la masa bucal.

A continuación, separe la aleta de piel del macizo bucal y corte los nervios y el tejido conectivo que se adhieren a la pared corporal. Para separar completamente esta aleta de piel del macizo bucal, asegúrese de no cortar ningún nervio ni tejido intrínseco del macizo bucal. Posteriormente, tome y sostenga el esófago.

Corte el esófago por detrás del punto que se está sujetando. Tire hacia arriba del esófago y levante la masa bucal detrás de la masa bucal. Los ganglios cerebral, pleural y pedal forman un anillo, con el ganglio cerebral unido a los ganglios bucales mediante los conectivos cerebro-bucales.

Deje estos ganglios anulares adheridos a la masa bucal y corte todos los nervios que se proyectan desde estos ganglios hacia otras partes del cuerpo. Luego, corte el tejido conectivo alrededor de la masa bucal y continúe levantando la masa bucal a medida que se desprende del cuerpo. Una vez que la masa bucal solo esté adherida a la boca, sostenga el esófago y la masa bucal.

Directamente hacia arriba. Realice un corte final justo anterior a las mandíbulas para liberar la masa bucal del cuerpo. Coloque la masa bucal en una solución de 50% de cloruro de magnesio isotónico y 50% de solución salina SIA para mantener una anestesia parcial mientras se colocan los electrodos.

Posteriormente, coloque la masa bucal con la solución en una placa de Petri con fondo de cigarro, cortando a través de la arteria bucal en la superficie ventral de la masa bucal. Luego, retire los ganglios pleurales y pedales cortando sus conexiones con el ganglio cerebral. Deje el ganglio cerebral unido a los ganglios bucales y a la masa bucal mediante los CBC y seccione las demás conexiones entre el ganglio cerebral y la masa bucal.

Recorte el esófago y las glándulas salivales a longitudes cortas. En este paso, fije los electrodos con gancho al nervio ocular ular, a los dos nervios musculares bucales dos y tres, y a la rama A del nervio bucal dos. Utilice un procedimiento similar al demostrado en la publicación de JoVE por Collins y Shield, y resumido brevemente aquí.

Para cada desprendimiento de electrodo, coloque el electrodo cerca del nervio o músculo, introduzca el nervio objetivo en el gancho y levántelo suavemente utilizando un manipulador. Luego seque la sección del nervio con una toallita Kim. Aplique una gota de pegamento rápido tipo gel al nervio enganchado y asegúrese de que el gancho quede completamente cubierto con pegamento y que la punta del alambre de referencia no esté cubierta con pegamento.

A continuación, utilice una jeringa con una fijación de tubo de polietileno para aplicar la solución desde el recipiente sobre el adhesivo, lo que inducirá al adhesivo a solidificarse en su superficie. El siguiente paso consiste en preparar un recipiente redondo de grabación de Pyrex de 100 por 50 milímetros para usarlo como cámara de registro; aplique una capa delgada de grasa de vacío en la muesca entre las cámaras cerebral y dorsal con la punta de una pipeta, con el fin de minimizar las fugas. Luego, llene la cámara frontal con una solución salina de plescia.

Transfiera cuidadosamente la masa bucal desde la placa de Petri a la cámara frontal del recipiente redondo de Pyrex, y asegúrese de que ninguno de los electrodos quede estirado con fuerza, lo cual podría romper los nervios. Tenga mucho cuidado con los electrodos en forma de gancho si es necesario trasladar el recipiente a otro microscopio estereoscópico. Para adelgazar la vaina.

Agrupe los electrodos en cada lado de la masa bucal. Sostenga cuidadosamente los electrodos agarrando la cinta de laboratorio que cubre los pasadores del conector, y nuevamente, asegúrese de que ninguno de los electrodos quede tensado. Cuando el recipiente esté colocado bajo el microscopio, los electrodos deben colgar suavemente sobre los bordes del recipiente y descansar sobre la plataforma durante las pausas y entre las etapas del experimento; airee la solución salina en la cámara de la masa bucal utilizando una piedra aireadora para acuario.

A continuación, sujete el ganglio cerebral en la cámara posterior con los CBC pasando por la muesca. Aplique más grasa de vacío sobre los CBC. Luego, añada más solución salina SIA a ambas partes del recipiente para que los ganglios queden completamente sumergidos.

Asegúrese de que el nivel de salino esté por debajo de la altura de la grasa al vacío entre las cámaras cerebral y bucal para que no ocurra ninguna fuga entre las cámaras. En esta etapa, la masa bucal debe quedar en el fondo de la cámara frontal. A continuación, sujete con alfileres los ganglios bucales en la plataforma intermedia para evitar dañar los nervios que aún están unidos a la masa bucal.

Coloque las agujas únicamente en la vaina entre dos nervios. Luego añada dos agujas más en el lateral de las CBC para estirarlas y fijarlas. Mantenga los ganglios bucales planos o girados según la ubicación de las neuronas de interés.

Para rotar el ganglio bucal, utilice un par de pinzas finas para agarrar un exceso de la vaina del CBC y fíjelo entre el nervio bucal dos y el nervio bucal tres. Luego, la mayor parte de los cuerpos celulares que están próximos a la cámara posterior y no se pueden acceder fácilmente desde la parte superior del ganglio bucal ahora pueden verse. Por último, coloque dos alfileres en la vaina del ganglio bucal cercanos al lado de la masa bucal.

Para minimizar el movimiento del ganglio bucal, sujete la vaina del ganglio bucal próxima a la cámara posterior y corte el exceso de vaina con tijeras finas sin exponer los cuerpos celulares. Con el fin de minimizar daños, retire únicamente la cantidad de vaina necesaria para visualizar los cuerpos celulares una vez finalizado el adelgazamiento de la vaina. Conecte todos los pines de los electrodos a sus conectores en los cables que se unen a los amplificadores.

Asegúrese de que los electrodos no estén tensos y que estén correctamente conectados a sus cables correspondientes, y de que las polaridades sean correctas para lavar cualquier resto de cloruro de magnesio. Reemplace la salina SIA en la cámara del mase bucal con salina SIA fresca. A continuación, pase un hilo de seda a través del tejido blando en la parte frontal del mase bucal y dorsal al cartílago de la mandíbula.

Utilice dos piezas de arcilla modelable para sujetar la sutura al borde del platillo, suspendiendo así la masa bucal desde su posición en el extremo anterior. Un manipulador sostiene un electrodo extracelular de vidrio de forma que la punta del electrodo esté cerca del ganglio bucal. Para localizar e identificar una neurona, baje suavemente la punta del electrodo extracelular sobre la vaina.

Sobre el soma neuronal. Aplique una corriente estimulante y luego cambie el canal que se está utilizando para excitar el soma a modo de grabación, con el fin de registrar la actividad en el electrodo extracelular y la actividad correspondiente en los nervios para inducir el rechazo. Como los programas motores estimulan el nervio bucal dos A con una larga serie de pulsos de dos hercios y un milisegundo para generar patrones de ees.

Los patrones continúan durante toda la duración de la estimulación y pueden persistir hasta poco después de que finalice la estimulación. Para inducir programas motores similares a la mordedura, coloque unos pocos cristales de caracol sólido directamente sobre el ganglio cerebral.

Los patrones repetitivos generalmente comienzan dentro de los cinco minutos y duran aproximadamente de 10 a 15 minutos antes de empezar a disminuir para inducir la deglución. Al igual que con los programas motores, aplique caracol y espere hasta que la masa bucal genere mordidas fuertes. Luego, durante una mordida, coloque una tira de alga marina en la boca del animal de modo que esta atrape el alga marina.

Aquí se muestra la estimulación y grabación del motoneurona identificado B nueve y la grabación de la misma neurona, el músculo I dos y varios nervios durante programas motores de alimentación. Aquí se presentan las imágenes de video tomadas de la misma serie de programas motores. Se indujeron patrones de deglución mediante la aplicación de carbacol al ganglio cerebral y la posterior colocación de una tira de alga en el órgano de prensión durante la mordida inducida por carbacol.

En esta imagen, la rádula se ha protruido para agarrar el alga, y en esta imagen, la rádula se ha retraído, introduciendo el alga en la boca. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar la masa bucal suspendida y obtener grabaciones de los programas motores de alimentación in vitro.