Citometría de flujo El aislamiento de células primarias murino tipo II alveolares epiteliales de Estudios funcionales y moleculares

El objetivo general de este procedimiento es aislar células epiteliales alveolares de tipo dos neuronales primarias puras y viables para análisis funcionales y moleculares posteriores. Primero, se instila la solución de DYS y luego agarosa en el pulmón y la tráquea de un ratón sacrificado. A continuación, se extrae el pulmón después de permitir que la dispa digiera el tejido pulmonar.

El tejido se desintegra manualmente. La suspensión resultante se filtra a través de una serie de mallas con tamaños de poro decrecientes. Luego se tiñe y las células epiteliales alveolares de tipo dos se aíslan mediante selección negativa por citometría de flujo.

Finalmente, las células epiteliales alveolares de tipo dos aisladas pueden utilizarse para realizar ensayos funcionales y moleculares con el fin de estudiar su papel en infecciones respiratorias y enfermedades autoinmunes pulmonares. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología pulmonar, especialmente en el contexto de enfermedades pulmonares autoinmunes y de infecciones virales. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la preparación del órgano y de la suspensión celular es difícil de aprender.

El éxito general de este protocolo depende de varios detalles importantes durante estos pasos. Para cada ratón del experimento, precaliente un tubo de 15 mililitros que contenga cuatro mililitros de DYS bays en un baño de agua a 37 grados Celsius. Coloque alícuotas pequeñas de 1 % de Low Mel Aros en agua en un bloque calefactor a 95 grados Celsius hasta que se licúen. Luego enfríe a 45 grados Celsius y manténgalos a esta temperatura hasta su uso posterior.

Para preparar el pulmón de ratón, rocíe un ratón que ha sido sacrificado por asfixia con CO2. Con etanol. Realice un corte largo a lo largo de la línea media ventral del cuerpo.

Luego, tire suavemente de la piel ventral distal y corte y retire cuidadosamente el peritoneo. Después de exsanguinar al ratón, perfore y retire cuidadosamente el diafragma y a continuación corte las costillas. Para exponer el corazón y los pulmones, tenga especial cuidado en no dañar los pulmones con una cánula de calibre 26 y una jeringa de 10 mililitros llena de líquido frío.

Perfusione con PBS el ventrículo derecho del corazón y perfunda el pulmón con PBS hasta que quede libre de sangre. Corte y retire las glándulas salivales para exponer la tráquea. Asimismo, corte cuidadosamente los músculos que rodean la tráquea.

A continuación, inserte una cánula permanente de calibre 22 en la tráquea. Retire la aguja y empuje el catéter de plástico hacia el pulmón. Fije el catéter en su lugar atando un pequeño trozo de hilo alrededor de la tráquea y el catéter.

Si se desea, prepare una muestra de líquido de lavado broncoalveolar lavando los pulmones mediante el catéter insertado en la tráquea con PBS o medio. Almacene el líquido de lavado sobre hielo hasta su posterior análisis. El aspecto más difícil de este procedimiento es la digestión y la desintegración del tejido.

Para garantizar el éxito de este protocolo, debe asegurarse de que el dispa completo se introduzca en todos los lóbulos pulmonares tras la digestión del tejido. Debe desintegrar el tejido utilizando cuidadosamente una jeringa de dos mililitros, introduciendo un volumen máximo de dos mililitros del dispa preparado anteriormente en el pulmón a través del catéter, de modo que todos los lóbulos queden completamente expandidos. Cambie la jeringa por una de un mililitro que contenga 0,5 mililitros del aros licuado e instile el contenido en el pulmón.

Deje la jeringa en el catéter para prevenir el reflujo de los aros y cubra inmediatamente el pulmón con papel de laboratorio, papel y hielo. Deje que el gel aéreo repose durante unos minutos. Retire el papel de laboratorio, el hielo, la jeringa y el catéter.

Luego corte la tráquea y extirpe el pulmón, el corazón y el timo del tórax. Enjuague los órganos preparados en un recipiente con PBS. A continuación, corte el corazón, el timo y la tráquea restante del pulmón y deséchelos.

Coloque el pulmón en el tubo que contiene los dos mililitros restantes de displays e incube a temperatura ambiente durante 45 minutos. Modifique la incubación para garantizar un bloqueo eficiente de los receptores FC de las células fagocíticas antes del procedimiento de tinción. Transfiera el pulmón desde los displays a una placa que contenga siete mililitros de un microgramo por mililitro de anticuerpo anti CD 1632 y 100 microlitros de ADN en DMEM, utilizando dos pares de pinzas, desintegre completamente el tejido pulmonar tirando de él para separarlo.

Luego, incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente en un agitador ajustado a 200 RPM, si se desea. La suspensión celular puede almacenarse entonces a cuatro grados Celsius hasta el siguiente paso. Pipetear la suspensión celular a través de una serie de mallas de nailon.

Primero, vierta la suspensión a través de un filtro de 100 micrones colocado encima de un tubo de 50 mililitros. Si va a agrupar muestras, pase las suspensiones celulares de ratones del mismo grupo a través del mismo filtro. Si el filtro se obstruye, cámbielo por uno nuevo.

Repita este proceso con un filtro de malla de 70 micrones. Tenga cuidado de enjuagar bien cada malla, así como los tubos y las placas, con DMEM para minimizar la pérdida de células y maximizar el rendimiento. A continuación, pase la suspensión a través de una malla de filtro de 48 micrones colocada sobre un anillo de plástico o vidrio como se muestra aquí.

Recoger el flujo filtrado en una placa de Petri. Luego repetir este proceso con una malla de 30 micrones. Dependiendo del volumen, transferir el filtrado a uno o más tubos de 50 mililitros y centrifugar durante 15 minutos a 160 ×g a cuatro grados Celsius.

Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y resuspenda el botón celular en dos mililitros de tampón de lisis de eritrocitos. Luego detenga rápidamente la lisis mediante la adición de 13 mililitros de medio DMEM. Transfiera la solución a un tubo de 15 mililitros y centrifugue durante 12 minutos a 160 ×g y 4 °C.

Incube las células en tres mililitros de un cóctel de anticuerpos primarios que contiene anticuerpos contra CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD1632 y CD45. Incube las células durante 10 minutos a oscuras a cuatro grados Celsius o sobre hielo. Después de la incubación, lave las células llenando el tubo con DMEM y centrifugue durante 12 minutos a 160 × g y cuatro grados Celsius.

Re-suspender las células en un mililitro de DMEM y prefiltrar a través de un filtro de 50 micrones en un tubo para clasificación celular. Contar las células para obtener el número total de células en la suspensión pulmonar. Utilizar una boquilla de 100 micras para la obtención de células de un EC2 inmediatamente antes de la obtención.

Mezcle la suspensión celular mediante vortex en el fluido de envolvente. La presión del fluido y las longitudes de onda de emisión y detección del láser dependen del instrumento utilizado para la clasificación celular por citometría de flujo, así como de los fluorocromos empleados en el procedimiento de tinción con anticuerpos. En primer lugar, cree un gráfico de área de dispersión lateral frente a fluorescencia y seleccione todas las células con área de dispersión lateral Alta que sean negativas para los fluorocromos utilizados en la tinción.

A continuación, genere gráficos de área de dispersión lateral versus área de dispersión hacia adelante, altura de dispersión hacia adelante versus área de dispersión hacia adelante y altura de dispersión lateral versus área de dispersión lateral, y realice un agrupamiento para excluir dobletes o agregados celulares en un tubo que contenga DMEM. Al obtener suspensiones celulares pulmonares aisladas de ratones sanos, la puerta EC2 típicamente representará aproximadamente el 42 ± 10 % de todos los eventos. Para recoger las células ordenadas, centrifugue durante 20 minutos a 280 × g y 4 grados Celsius.

Re-suspender las células epiteliales alveolares de tipo dos o las a EC2 en cultivo, medio o tampón según sea necesario para el análisis posterior. Las células epiteliales alveolares de tipo dos primarias de ratón se aislaron mediante selección negativa por citometría de flujo como se describe en este video; el análisis de las células ordenadas se muestra aquí. Como se indica.

La pureza de las células aisladas es aproximadamente 92 más menos 5%. Los giros de A EC2 ordenados se tiñeron para la proteína C del surfactante; se muestra una imagen de contraste de fase a la izquierda y la inmunofluorescencia a la derecha. Casi el 100 % de las células resultaron positivas para la proteína C del surfactante, confirmando así el aislamiento exitoso de una población pura. Para evaluar los efectos de la infección in vivo por el virus de la influenza A, se aislaron A EC2 de ratones C 57 BL seis que habían recibido, por vía intranasal uno, dos o tres días antes, suero salino tamponado con fosfato o el virus de la influenza A PR ocho A 34.

Estos gráficos muestran suspensiones de células pulmonares de machos C57BL/6 no infectados y infectados durante tres días, teñidas para clasificación debido al reclutamiento de células inmunitarias al pulmón infectado. La proporción de células negativas para fluorescencia y con área alta de dispersión lateral se reduce considerablemente en la suspensión celular preparada a partir de los ratones infectados durante tres días en comparación con los no infectados. La expresión de la proteína nuclear del virus de la influenza A en células C2 clasificadas se analizó mediante tinción intracelular con un anticuerpo específico para la proteína nuclear.

El histograma muestra que un C dos aislado de ratones infectados in vivo produce una señal de fluorescencia específica tras la tinción intracelular para la proteína nucleocapsídica del virus de la influenza A. La tabla muestra la intensidad media de fluorescencia de la tinción de la proteína nuclear, la intensidad de la señal producida por la tinción intracelular de la proteína nuclear de un EC2 aislado de ratones infectados con el virus de la influenza. La infección viral aumenta con la duración de la infección viral para demostrar la viabilidad de un EC2 aislado de ratones sanos y para probar su susceptibilidad a la infección por el virus de la influenza A.

La expresión de la proteína nuclear del virus de la influenza también se analizó en células aisladas infectadas ex vivo, como se muestra aquí. Una proporción considerable de EC2 expresa la proteína nuclear viral seis horas después de la infección. Estos datos se resumen aquí.

El porcentaje de una EC2 positiva para la tinción intracelular de la proteína nuclear viral depende de la dosis viral utilizada para el experimento de infección ex vivo. Estos resultados muestran que la neurona primaria aislada, una EC2, es viable y susceptible a la infección y replicación viral evaluada mediante la expresión de la proteína viral observada. Al intentar este procedimiento, es muy importante recordar realizar cuidadosamente todos los pasos de digestión y desintegración del tejido.

Además, es muy importante recordar aplicar criterios estrictos en la selección de células negativas para la fluorescencia y en la región de alta dispersión lateral. Tras la clasificación siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como estudios moleculares y funcionales, para determinar el papel del tipo dos de células T del tercer tipo del pulmón en el contexto de infecciones virales y enfermedades pulmonares autoinmunes mediadas.