Name: Citometría de flujo El aislamiento de células primarias murino tipo II alveolares epiteliales de Estudios funcionales y moleculares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Aprende a aislar células epiteliales alveolares tipo II murinas primarias mediante citometría de flujo con selección negativa. Este método eficiente proporciona alta viabilidad y pureza celular para estudios funcionales y moleculares en enfermedades respiratorias.

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Nos gustaría dar las gracias a M. Höxter para la asistencia técnica en la clasificación AECII murino primaria de bioseguridad de nivel 2 muestras. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Alemana de Investigación (DFG) a DB (SFB587, B12 y BR2221/1-1 TP) y una beca de la Escuela de Investigación Biomédica de Hannover (DFG GSC 108) a AA. DB con el apoyo de la Iniciativa del Presidente y del Fondo de Redes de la Asociación Helmholtz de Centros de Investigación alemán (HGF), bajo contrato W2/W3-029 número.

Los detalles relativos a los reactivos y materiales necesarios se enumeran en la tabla al final del protocolo a continuación. Antes de empezar el trabajo, preparar tubos de 15 ml (una por ratón) que contienen 4 ml de dispasa y pre-calentamiento a 37 ° C en un baño de agua. En un bloque de calentamiento, poco calentar pequeñas alícuotas de bajo punto de fusión al 1% de agarosa (en agua) a 95 ° C hasta que la miel y, posteriormente, enfriar a 45 ° C hasta su uso. 1. Preparación del pulmón de ratón <ol><li> Sacrificar el ratón por asfixia de CO 2. Nota: No realice dislocación cervical, ya que esto lesionar la tráquea de modo que siguiendo los pasos del protocolo, como la instalación de los pulmones con líquido, no se puede realizar con éxito. Asegúrese de que la pérdida de los reflejos nociceptivos. </li><li> Pulverizar el ratón con etanol y hacer un corte largo a lo largo de la línea media ventral del cuerpo. Tire de la piel y la piel ventral y posteriormente también cuidadosamente cortar y quitar el peritoneo. </li><li> Exsanguinate laratón cortando la vena yugular izquierda y la derecha (Vena yugular), así como la arteria renal (renalis Arteria). Quite la sangre que fluye con el tejido. </li><li> Con cuidado, punción y retire el diafragma para exponer el corazón y los pulmones cortando las costillas. Tenga especial cuidado de no lesionar el pulmón. </li><li> Con una cánula 26G y una jeringa de 10 ml llena con solución salina tamponada con fosfato fría (PBS), la punción del ventrículo derecho del corazón y perfundir el pulmón con PBS hasta que esté libre de sangre. </li><li> Corte y retire las glándulas salivales para exponer la tráquea. También con cuidado corte el músculo que rodea la tráquea. </li><li> Insertar una cánula permanente 22G en la tráquea, retirar la aguja y empujar el catéter de plástico hacia el pulmón. Fijar el catéter mediante la vinculación de una pequeña pieza de lana alrededor de la tráquea y el catéter. </li></ol> 2. La digestión enzimática del tejido pulmonar Si se desea, una muestra de líquido de lavado broncoalveolar puede serpreparado por el lavado de los pulmones a través del catéter insertado en la tráquea con PBS o medio antes de la siguiente etapa. <ol><li> Usando una jeringa de 2 ml, cuidadosamente infundir un volumen máximo de 2 ml de dispasa (de la alícuota ml 4) en el pulmón a través del catéter de modo que todos los lóbulos están totalmente expandido. Intercambiar la jeringa con una jeringa de 1 ml que contiene 0,5 ml de la agarosa licuada y también infundir en el pulmón. </li><li> Deje la jeringa en el catéter para evitar el flujo de retorno de la agarosa y cubrir inmediatamente el pulmón con papel de laboratorio del tejido y hielo. Deje que el gel de agarosa durante un par de minutos. </li><li> Quitar el papel de seda, hielo, jeringas y catéteres, cortar la tráquea y escindir el pulmón, corazón y timo del pecho. Luego enjuague el pulmón en un plato con PBS y quitar el corazón, el timo y la tráquea restante. </li><li> Ponga el pulmón hacia el restante 2 ml de dispasa y se incuba a temperatura ambiente durante 45 min. </li></ol> 3. Preparación del pulmónSuspensión celular <ol><li> Retire el pulmón de la dispasa y la transfiere en un plato que contiene 7 ml de anticuerpo anti-CD16/32 (1 mg / ml concentración final) en medio DMEM y 100 l DNasa. </li><li> Utilizando fórceps, se desintegran completamente el tejido pulmonar tirando de él aparte y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente mientras agitando suavemente en un agitador ajustado a 200 rpm. Si se desea, la suspensión de células se pueden almacenar a 4 º C hasta el siguiente paso. </li><li> Se filtra la suspensión celular a través de mallas de nylon primero con 100 micras y 70 micras, posteriormente con 48 micras y 30 micras poros. Tomar cuidado de enjuagar cada malla, así como los tubos y las placas concienzudamente con DMEM para minimizar la pérdida de células y maximizar el rendimiento. Si está puesta en común de muestras, esto se puede lograr aquí pasando posteriormente por suspensiones de células de ratones de un grupo a través del mismo filtro. Cambiar el filtro en caso de obstrucción. </li><li> Dependiendo del volumen, transferir el filtrado a uno o más tubos de 50 ml ycentrifugar durante 15 min a 160 xg y 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el pellet de células en 2 ml de tampón de lisis de eritrocitos (0,15 M NH 4 Cl, 0,01 M de KHCO 3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2) y terminar rápidamente la lisis por adición de 13 ml de medio DMEM. Transferir la solución a un tubo de 15 ml y centrifugar durante 12 min a 160 xg y 4 ° C. </li></ol> 4. Antibody tinción para citometría de flujo en células de clasificación <ol><li> Resuspender las células en 3 ml de cóctel de anticuerpos primaria, preparado en medio DMEM en diluciones adecuadas para la citometría de flujo. (Los anticuerpos fueron ajustado previamente para diluciones de trabajo óptimas mediante la tinción de 1 x 10 6 esplenocitos en un volumen de 100 l. Uso 3 ml del cóctel de anticuerpo primario que contiene las concentraciones óptimas para cada uno de los anticuerpos utilizados para células agrupadas de hasta cinco ratones. Si más ratones se agruparon para una muestra, ajustar el volumen). </li><li> Para la tinción, incubar las células durante 10 min en la oscuridada 4 ° C. </li><li> Se lavan las células por el tubo de llenado 15 ml con medio DMEM y centrifugación durante 12 min a 160 xg y 4 º C. </li><li> En el caso de anticuerpos biotinilados o no acoplados se utilizaron en 4,1: Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 2 a 3 ml de cóctel de anticuerpo secundario. Teñir durante 10 min a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Se lavan las células a través de rellenar el tubo con DMEM y centrifugación durante 12 min a 160 xg y 4 ° C. </li><li> Resuspender las células en 1 ml de DMEM y pre-filtro a través de un filtro de 50 micras en un tubo para la clasificación de células. Opcional: Contar las células para obtener el número total de células en la suspensión de células de pulmón. </li></ol> 5. De clasificación de células <ol><li> Mezclar las células mediante agitación en vórtex antes de la clasificación. Use una boquilla de 100 micras para la célula de clasificación de AECII. La presión de fluido de funda, así como de emisión láser y longitudes de onda de detección dependen del instrumento utilizado para la citometría de flujo de clasificación de células, así como los fluorocromos utilizados en la antibody procedimiento de tinción. </li><li> Puerta en las células SSC altos que son negativos para los fluorocromos utilizados para la tinción y ordenar en un tubo que contiene DMEM. Utilice altura dispersión hacia adelante (FSC-H) vs área (FSC-A) y la altura de dispersión lateral (SSC-H) vs área (SSC-A) de Windows para excluir los dobletes o agregados celulares (ver detalles de la estrategia de puerta en Figura 1 a). </li><li> Con el fin de recoger la centrífuga ordenados células durante 20 min a 280 xg y 4 º C. </li><li> Resuspender las células en medio de cultivo o tampón como se requiere para su posterior análisis. </li></ol>

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El protocolo para el aislamiento de murino AECII por citometría de flujo ofrece una forma rápida de acceder a las células primarias del pulmón de ratón para toda una serie de estudios funcionales y moleculares. El procedimiento descrito se obtiene poblaciones altamente viables y puro de AECII que son suficientes en número para directos análisis posteriores, tales como el aislamiento de ARN (ver figura 2b) y transcriptome estudios. Para aplicaciones funcionales, también es posible cultivar las células ai...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> mora cánula 22G Introcan </td><td> Braun </td><td> REF 4252098B </td><td></td></tr><tr><td> Dispasa, 100 ml (5000 unidades caseinolíticas) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354235 </td><td> alícuota de 4 ml en tubos de 15 ml, almacenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Biozym placa de agarosa </td><td> Biozym </td><td> 840101 </td><td> 1% w / v en H 2 O </td></tr><tr><td> Desoxirribonucleasa I de páncreas bovino, 2000 unidades Kunitz / vial </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4263 </td><td> recién disolver el contenido de 1 vial en 300 l de DMEM </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 22320-022 </td><td> utilizado según lo previsto por el fabricante (Low Glucose, piruvato, HEPES) </td></tr><tr><td> coladores celulares (100 micras, 75 micras) </td><td> BD Falcon </td><td> 352360, 352350 </td><td></td></tr><tr><td> de malla de nylon (48 micras, 30 micras) </td><td> Buckmann GmbH </td><td> 03-48/26-1020, 03-30/18-108 </td><td></td></tr><tr><td> CellTrics 50 micras filtro </td><td> PARTEC </td><td> 04-0042-2317 </td><td></td></tr><tr><td> anti-ratón CD16/CD32 </td><td> BioLegend </td><td> 101302 </td><td> clon 93; purificada </td></tr><tr><td> anti-ratón de F4/80 </td><td> BioLegend </td><td> 123116 </td><td> clon BM8; APC acoplado </td></tr><tr><td> anti-ratón CD11b </td><td> BioLegend </td><td> 101208 </td><td> clon M1/70; PE acoplado </td></tr><tr><td> anti-ratón CD11c </td><td> BioLegend </td><td> 117310 </td><td> clon N418; APC acoplado </td></tr><tr><td> anti-ratónCD45 </td><td> BioLegend </td><td> 103102 </td><td> clon 30-F11; purificada </td></tr><tr><td> anti-ratón CD19 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0193-83 </td><td> eBIO 1D3; PE acoplado </td></tr><tr><td> policlonal de cabra anti-IgG de rata </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550767 </td><td> policlonal, PE acoplado </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Anticuerpos acoplados a fluorocromos alternativos pueden ser utilizados, dependiendo del citómetro de flujo y los láseres disponibles. </td></tr></tbody></table>

citometría de flujo el aislamiento de células primarias murino tipo ii alveolares epiteliales de estudios funcionales y moleculares

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

A lo largo de los últimos años, la contribución de las células alveolares de tipo II epiteliales (AECII) a diversos aspectos de la regulación inmune en el pulmón se ha reconocido cada vez más. AECII se han mostrado participar en la producción de citoquinas en las vías respiratorias inflamadas y actuar incluso como células presentadoras de antígeno tanto en la infección de células T y la autoinmunidad mediada por 1-8. Por lo tanto, son especialmente interesantes también en contextos clínicos como la hiper-reactividad de las vías respiratorias al exterior y de auto-antígenos, así como infecciones que directa o indirectamente se dirigen AECII. Sin embargo, nuestra comprensión de las funciones inmunológicas detalladas servidos por células alveolares de tipo II epiteliales en el pulmón sano, así como en la inflamación sigue siendo fragmentaria. Muchos estudios sobre la función AECII se realizan a través del ratón o humano líneas de células epiteliales alveolares 9-12. Trabajo con líneas de células sin duda ofrece una serie de beneficios, tales como la disponibilidad de un gran número of células para análisis extensos. Sin embargo, creemos que el uso de AECII murino primaria permite una mejor comprensión de la función de este tipo de células en procesos complejos tales como la infección o inflamación autoinmune. AECII murino primaria se pueden aislar directamente a partir de animales que sufren de tales condiciones respiratorias, lo que significa que han sido objeto de todos los factores extrínsecos adicionales que juegan un papel en el ajuste analizado. Como ejemplo, AECII viable puede ser aislado de ratones por vía intranasal infectadas con virus de influenza A, que se dirige principalmente a estas células para la replicación 13. Es importante destacar que, a través de la infección ex vivo de AECII aislado de ratones sanos, los estudios de las respuestas celulares montados sobre la infección puede ser extendido. El protocolo para el aislamiento de AECII murino primario se basa en la digestión enzimática del pulmón de ratón seguido de etiquetado de la suspensión celular resultante con anticuerpos específicos para CD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 y CD16/CD32. AECII granulares se identifica entonces como la dispersión de alta sin marcar y lateral (SSC alta) población de células y son separadas por fluorescencia de células activadas por la clasificación 3. En comparación con otros métodos de aislamiento de células epiteliales primarias de los pulmones del ratón, nuestro protocolo de aislamiento de citometría de flujo de AECII por selección negativa produce intacta, altamente viable y puro AECII en tiempo relativamente corto. Además, y en contraste con los métodos convencionales de aislamiento por lavado en batea y el agotamiento de los linfocitos a través de la unión del anticuerpo acoplado-perlas magnéticas 14, 15, de citometría de flujo de clasificación de células permite la discriminación por medio de tamaño de celda y granularidad. Dado que la instrumentación para la clasificación de células por citometría de flujo está disponible, el procedimiento descrito se puede aplicar a costes relativamente bajos. Al lado de anticuerpos estándar y enzimas para la desintegración, pulmón, ausencia de reactivos adicionales tales como magnéticaperlas se requiere. Las células aisladas son adecuadas para una amplia gama de estudios funcionales y moleculares, que incluyen el cultivo in vitro de células T y ensayos de estimulación, así como transcriptoma, proteoma o análisis de secretoma 3, 4.

Al ordenar suspensiones celulares pulmonares aislados de los ratones sanos, la puerta AECII típicamente representan alrededor del 42 ± 10% de todos los eventos. Este porcentaje puede ser notablemente inferior cuando los ratones con enfermedades respiratorias tales como una infección viral se utilizan, como la suspensión de células inicial contendrá una proporción mucho mayor de los linfocitos y otras células inmunitarias reclutados para las vías respiratorias. Para AECII aisladas de los pulmones IAV infectados en el día...

Se describe el aislamiento rápido de células primarias de murino de tipo II alveolares epiteliales (AECII) por citometría de flujo negativo de selección. Estos AECII mostrar una alta viabilidad y pureza, y son adecuados para una amplia gama de estudios funcionales y molecular respecto a su función en condiciones respiratorias tales como enfermedades autoinmunes o infecciosas.

Citometría de flujo El aislamiento de células primarias murino tipo II alveolares epiteliales de Estudios funcionales y moleculares

A lo largo de los últimos años, la contribución de las células epiteliales alveolares tipo II (AECII) a diversos aspectos de la regulación inmunitaria en el pulmón ha sido...

El objetivo general de este procedimiento es aislar células epiteliales alveolares de tipo dos neuronales primarias puras y viables para análisis funcionales y moleculares posteriores. Primero, se instila la solución de DYS y luego agarosa en el pulmón y la tráquea de un ratón sacrificado. A continuación, se extrae el pulmón después de permitir que la dispa digiera el tejido pulmonar.El tejido se desintegra manualmente. La suspensión resultante se filtra a través de una serie de mallas con tamaños de poro decrecientes. Luego se tiñe y las células epiteliales alveolares de tipo dos se aíslan mediante selección negativa por citometría de flujo.Finalmente, las células epiteliales alveolares de tipo dos aisladas pueden utilizarse para realizar ensayos funcionales y moleculares con el fin de estudiar su papel en infecciones respiratorias y enfermedades autoinmunes pulmonares. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología pulmonar, especialmente en el contexto de enfermedades pulmonares autoinmunes y de infecciones virales. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la preparación del órgano y de la suspensión celular es difícil de aprender.El éxito general de este protocolo depende de varios detalles importantes durante estos pasos. Para cada ratón del experimento, precaliente un tubo de 15 mililitros que contenga cuatro mililitros de DYS bays en un baño de agua a 37 grados Celsius. Coloque alícuotas pequeñas de 1 % de Low Mel Aros en agua en un bloque calefactor a 95 grados Celsius hasta que se licúen. Luego enfríe a 45 grados Celsius y manténgalos a esta temperatura hasta su uso posterior.Para preparar el pulmón de ratón, rocíe un ratón que ha sido sacrificado por asfixia con CO2. Con etanol. Realice un corte largo a lo largo de la línea media ventral del cuerpo.Luego, tire suavemente de la piel ventral distal y corte y retire cuidadosamente el peritoneo. Después de exsanguinar al ratón, perfore y retire cuidadosamente el diafragma y a continuación corte las costillas. Para exponer el corazón y los pulmones, tenga especial cuidado en no dañar los pulmones con una cánula de calibre 26 y una jeringa de 10 mililitros llena de líquido frío.Perfusione con PBS el ventrículo derecho del corazón y perfunda el pulmón con PBS hasta que quede libre de sangre. Corte y retire las glándulas salivales para exponer la tráquea. Asimismo, corte cuidadosamente los músculos que rodean la tráquea.A continuación, inserte una cánula permanente de calibre 22 en la tráquea. Retire la aguja y empuje el catéter de plástico hacia el pulmón. Fije el catéter en su lugar atando un pequeño trozo de hilo alrededor de la tráquea y el catéter.Si se desea, prepare una muestra de líquido de lavado broncoalveolar lavando los pulmones mediante el catéter insertado en la tráquea con PBS o medio. Almacene el líquido de lavado sobre hielo hasta su posterior análisis. El aspecto más difícil de este procedimiento es la digestión y la desintegración del tejido.Para garantizar el éxito de este protocolo, debe asegurarse de que el dispa completo se introduzca en todos los lóbulos pulmonares tras la digestión del tejido. Debe desintegrar el tejido utilizando cuidadosamente una jeringa de dos mililitros, introduciendo un volumen máximo de dos mililitros del dispa preparado anteriormente en el pulmón a través del catéter, de modo que todos los lóbulos queden completamente expandidos. Cambie la jeringa por una de un mililitro que contenga 0,5 mililitros del aros licuado e instile el contenido en el pulmón.Deje la jeringa en el catéter para prevenir el reflujo de los aros y cubra inmediatamente el pulmón con papel de laboratorio, papel y hielo. Deje que el gel aéreo repose durante unos minutos. Retire el papel de laboratorio, el hielo, la jeringa y el catéter.Luego corte la tráquea y extirpe el pulmón, el corazón y el timo del tórax. Enjuague los órganos preparados en un recipiente con PBS. A continuación, corte el corazón, el timo y la tráquea restante del pulmón y deséchelos.Coloque el pulmón en el tubo que contiene los dos mililitros restantes de displays e incube a temperatura ambiente durante 45 minutos. Modifique la incubación para garantizar un bloqueo eficiente de los receptores FC de las células fagocíticas antes del procedimiento de tinción. Transfiera el pulmón desde los displays a una placa que contenga siete mililitros de un microgramo por mililitro de anticuerpo anti CD 1632 y 100 microlitros de ADN en DMEM, utilizando dos pares de pinzas, desintegre completamente el tejido pulmonar tirando de él para separarlo.Luego, incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente en un agitador ajustado a 200 RPM, si se desea. La suspensión celular puede almacenarse entonces a cuatro grados Celsius hasta el siguiente paso. Pipetear la suspensión celular a través de una serie de mallas de nailon.Primero, vierta la suspensión a través de un filtro de 100 micrones colocado encima de un tubo de 50 mililitros. Si va a agrupar muestras, pase las suspensiones celulares de ratones del mismo grupo a través del mismo filtro. Si el filtro se obstruye, cámbielo por uno nuevo.Repita este proceso con un filtro de malla de 70 micrones. Tenga cuidado de enjuagar bien cada malla, así como los tubos y las placas, con DMEM para minimizar la pérdida de células y maximizar el rendimiento. A continuación, pase la suspensión a través de una malla de filtro de 48 micrones colocada sobre un anillo de plástico o vidrio como se muestra aquí.Recoger el flujo filtrado en una placa de Petri. Luego repetir este proceso con una malla de 30 micrones. Dependiendo del volumen, transferir el filtrado a uno o más tubos de 50 mililitros y centrifugar durante 15 minutos a 160 ×g a cuatro grados Celsius.Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y resuspenda el botón celular en dos mililitros de tampón de lisis de eritrocitos. Luego detenga rápidamente la lisis mediante la adición de 13 mililitros de medio DMEM. Transfiera la solución a un tubo de 15 mililitros y centrifugue durante 12 minutos a 160 ×g y 4 °C.Incube las células en tres mililitros de un cóctel de anticuerpos primarios que contiene anticuerpos contra CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD1632 y CD45. Incube las células durante 10 minutos a oscuras a cuatro grados Celsius o sobre hielo. Después de la incubación, lave las células llenando el tubo con DMEM y centrifugue durante 12 minutos a 160 × g y cuatro grados Celsius.Re-suspender las células en un mililitro de DMEM y prefiltrar a través de un filtro de 50 micrones en un tubo para clasificación celular. Contar las células para obtener el número total de células en la suspensión pulmonar. Utilizar una boquilla de 100 micras para la obtención de células de un EC2 inmediatamente antes de la obtención.Mezcle la suspensión celular mediante vortex en el fluido de envolvente. La presión del fluido y las longitudes de onda de emisión y detección del láser dependen del instrumento utilizado para la clasificación celular por citometría de flujo, así como de los fluorocromos empleados en el procedimiento de tinción con anticuerpos. En primer lugar, cree un gráfico de área de dispersión lateral frente a fluorescencia y seleccione todas las células con área de dispersión lateral Alta que sean negativas para los fluorocromos utilizados en la tinción.A continuación, genere gráficos de área de dispersión lateral versus área de dispersión hacia adelante, altura de dispersión hacia adelante versus área de dispersión hacia adelante y altura de dispersión lateral versus área de dispersión lateral, y realice un agrupamiento para excluir dobletes o agregados celulares en un tubo que contenga DMEM. Al obtener suspensiones celulares pulmonares aisladas de ratones sanos, la puerta EC2 típicamente representará aproximadamente el 42 ± 10 % de todos los eventos. Para recoger las células ordenadas, centrifugue durante 20 minutos a 280 × g y 4 grados Celsius.Re-suspender las células epiteliales alveolares de tipo dos o las a EC2 en cultivo, medio o tampón según sea necesario para el análisis posterior. Las células epiteliales alveolares de tipo dos primarias de ratón se aislaron mediante selección negativa por citometría de flujo como se describe en este video; el análisis de las células ordenadas se muestra aquí. Como se indica.La pureza de las células aisladas es aproximadamente 92 más menos 5%. Los giros de A EC2 ordenados se tiñeron para la proteína C del surfactante; se muestra una imagen de contraste de fase a la izquierda y la inmunofluorescencia a la derecha. Casi el 100 % de las células resultaron positivas para la proteína C del surfactante, confirmando así el aislamiento exitoso de una población pura. Para evaluar los efectos de la infección in vivo por el virus de la influenza A, se aislaron A EC2 de ratones C 57 BL seis que habían recibido, por vía intranasal uno, dos o tres días antes, suero salino tamponado con fosfato o el virus de la influenza A PR ocho A 34.Estos gráficos muestran suspensiones de células pulmonares de machos C57BL/6 no infectados y infectados durante tres días, teñidas para clasificación debido al reclutamiento de células inmunitarias al pulmón infectado. La proporción de células negativas para fluorescencia y con área alta de dispersión lateral se reduce considerablemente en la suspensión celular preparada a partir de los ratones infectados durante tres días en comparación con los no infectados. La expresión de la proteína nuclear del virus de la influenza A en células C2 clasificadas se analizó mediante tinción intracelular con un anticuerpo específico para la proteína nuclear.El histograma muestra que un C dos aislado de ratones infectados in vivo produce una señal de fluorescencia específica tras la tinción intracelular para la proteína nucleocapsídica del virus de la influenza A. La tabla muestra la intensidad media de fluorescencia de la tinción de la proteína nuclear, la intensidad de la señal producida por la tinción intracelular de la proteína nuclear de un EC2 aislado de ratones infectados con el virus de la influenza. La infección viral aumenta con la duración de la infección viral para demostrar la viabilidad de un EC2 aislado de ratones sanos y para probar su susceptibilidad a la infección por el virus de la influenza A.La expresión de la proteína nuclear del virus de la influenza también se analizó en células aisladas infectadas ex vivo, como se muestra aquí. Una proporción considerable de EC2 expresa la proteína nuclear viral seis horas después de la infección. Estos datos se resumen aquí.El porcentaje de una EC2 positiva para la tinción intracelular de la proteína nuclear viral depende de la dosis viral utilizada para el experimento de infección ex vivo. Estos resultados muestran que la neurona primaria aislada, una EC2, es viable y susceptible a la infección y replicación viral evaluada mediante la expresión de la proteína viral observada. Al intentar este procedimiento, es muy importante recordar realizar cuidadosamente todos los pasos de digestión y desintegración del tejido.Además, es muy importante recordar aplicar criterios estrictos en la selección de células negativas para la fluorescencia y en la región de alta dispersión lateral. Tras la clasificación siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como estudios moleculares y funcionales, para determinar el papel del tipo dos de células T del tercer tipo del pulmón en el contexto de infecciones virales y enfermedades pulmonares autoinmunes mediadas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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Citometría de flujo El aislamiento de células primarias murino tipo II alveolares epiteliales de Estudios funcionales y moleculares (Video) | JoVE Journal

Citometría de flujo El aislamiento de células primarias murino tipo II alveolares epiteliales de Estudios funcionales y moleculares

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