Antígeno Artificial célula presentadora (AAPC) La activación mediada y expansión de linfocitos T citolíticos naturales

El objetivo general de este procedimiento es generar células presentadoras de antígeno artificiales basadas en CD1D o A APC para la expansión de células NKT. Esto se logra primero añadiendo proteínas para funcionalizar las perlas magnéticas. En el segundo paso, se enriquece la población inicial de células NKT a partir de sangre periférica.

A continuación, los linfocitos T enriquecidos se cultivan en cocultivo con las APC A A. En la etapa final, se evalúa el fenotipo y la función de la población de células APC A A. En última instancia, la pureza de los subconjuntos de linfocitos T expandidos puede determinarse mediante análisis citométrico de flujo. La ventaja principal de las APC frente a los métodos actuales que utilizan células dendríticas es que las células dendríticas pueden presentar una alta variabilidad entre donantes.

Las APC proporcionan un método reproducible, listo para usar y estandarizado para la expansión de células T NK. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando trabajaba con el Dr. Schneck y Oaky en Johns Hopkins. Ellos han sido pioneros en el campo del uso de complejos artificiales de presentación de antígenos para la expansión de subpoblaciones clásicas de linfocitos T CD8.

El procedimiento será demostrado por el Dr. James East, investigador postdoctoral, y el hijo de la Dra. Wendy, un asociado de investigación de mi laboratorio. Comience transfiriendo un mililitro de perlas Dyna Bead M-450 con epoxi a un vial roscado de vidrio borosilicato transparente de cinco mililitros. Luego, enjuague las perlas con tres mililitros de tampón Bore 8 estéril en un tubo microcentrífuga separado de 1,5 mililitros.

Añada 100 microgramos del dímero de CD1D IG humano y 20 microgramos de las moléculas coestimuladoras deseadas a un mililitro de PBS sin calcio ni magnesio. A continuación, coloque el vial de vidrio con las perlas sobre un imán y aspire el tampón borato. Luego, agregue la mezcla de proteínas al vial de vidrio y vuelva a colocar la tapa.

Mezcle inmediatamente la solución invirtiendo el vial, luego cubra la tapa con paraformo y colóquelo en un rotador durante la noche a cuatro grados Celsius al día siguiente. Coloque el vial de vidrio sobre el imán nuevamente y retire cuidadosamente la mezcla de proteínas evitando tocar las perlas. Lave las perlas tres veces añadiendo tres mililitros de tampón de lavado de perlas e incubándolas en el rotador a cuatro grados Celsius durante cinco minutos.

Para confirmar que las proteínas están cargadas de manera estable en las perlas, tiña una alícuota de las perlas con anticuerpos y analícelas mediante análisis citométrico de flujo. Ahora transfiera cinco veces 10 a la séptima perlas a un pequeño vial de vidrio de 1,5 mililitros y enjuague las perlas con un mililitro de PBS estéril. Luego, 48 a 72 horas antes del uso.

Cargue las perlas lavadas con antígeno en un mililitro de PBS estéril mientras las perlas se están cargando con el antígeno. Recolecte los PBMC diluyendo primero la sangre del donante heparinizada con un volumen igual de PBS a temperatura ambiente. Luego agregue 15 mililitros de PHI a temperatura ambiente, transfiera a tubos cónicos de 50 mililitros y superponga lentamente 25 mililitros de la mezcla sanguínea diluida encima del PHI.

Llame entonces tras centrifugar las muestras durante 30 minutos a 700 ×g y temperatura ambiente con la frenada desactivada. Utilice una pipeta Pasteur para transferir cuidadosamente la interfase de linfocitos a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, lave los linfocitos con 50 mililitros de PBS, deseche el sobrenadante y combine los tubos de un mismo donante en un solo tubo.

Después de lavar nuevamente los PBMC con 20 mililitros de PBS, cuente las células y luego resuspenda en una concentración de cinco por 10 a la séptima células por mililitro en tampón max. Para aislar la fracción de linfocitos T, incube 100 microlitros de la solución de enriquecimiento de linfocitos T PAN del kit de enriquecimiento de linfocitos T humanos EP con dos mililitros de PBMC durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego, incube la solución con 100 microlitros de microesferas magnéticas a temperatura ambiente durante otros 10 minutos.

Lleve el volumen final del disolvente a 2,5 mililitros y luego coloque el tubo en el imán. Después de cinco minutos, vierta rápidamente la fracción positiva de CD3 en un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, lave las células con 5 mililitros de tampón Max frío y cuente las células viables.

Retire un alícuota para tinción de marcadores para seleccionar primero las células positivas para CD161. Re_suspenda los linfocitos T enriquecidos en 980 microlitros de tampón Max frío con hielo y luego incube las células con 10 microgramos de anticuerpo monoclonal anti-CD161 durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Después de lavar las células, reconstituya el sedimento en 800 microlitros de tampón Max y 200 microlitros de microesferas de anti-IgG de rata.

Incube esta solución a cuatro grados Celsius durante otros 10 minutos. Mientras las células se incuban con las microesferas, agregue tres mililitros de tampón max para equilibrar una columna LS. Después de lavar esta fracción celular, pipetee lentamente las células en tres mililitros de tampón max hacia la columna.

Ahora lave la columna tres veces con tres mililitros de tampón máximo fresco. A continuación, agregue tres mililitros más de tampón máximo fresco a la columna y transfiera la columna a un tubo cónico de 15 mililitros. Empluje las células positivas para CD161 y positivas para CD3 purificadas, y luego cuente la fracción enriquecida en células NKT.

Inicie este paso co-cultivando 10 a la sexta de células T CD161 positivas CD3 positivas enriquecidas y 10 a la sexta de APC en 16 mililitros de medio completo en una placa. Añada 160 microlitros por pocillo de la co-cultura a una placa de poliestireno con fondo en U, tratada para cultivo de tejidos de 96 pocillos, con tapa de baja evaporación. Entre el día 12 y 14, recolecte y cuente las células. Analice las poblaciones mediante análisis citométrico de flujo, luego repita y co-cultive.

Las células NKT expandidas, tal como se acaba de demostrar, congelan las células NKT adicionales tras la segunda ronda de expansión. Para probar la funcionalidad de las células A A PC, realice primero un cultivo conjunto de cinco veces 10 a la cuarta células NKT por pocillo con cinco veces 10 a la quinta A A PC, en un volumen final de 200 microlitros de medio completo y en una placa de 96 pocillos con fondo redondo. Tras 24 a 48 horas, recolecte el sobrenadante del cultivo celular para su análisis mediante ELISA. Esta primera figura demuestra que las proteínas CD 1D IG se inmovilizan de manera estable sobre la superficie de las perlas magnéticas, tal como se muestra aquí.

Los anticuerpos CD1d-Ig y anti-CD28 se expresan ambos en la superficie de las perlas magnéticas, como se demuestra en este gráfico. El hibridoma de células NK T del ratón positivo para Vα14, DN3A2-D3, se cultivó conjuntamente con antígeno soluble en medio alfa-GalCer no cargado en APC-AA o con alfa-GalCer cargado en APC-AA. Luego se recolectaron los sobrenadantes del cultivo y se midió la producción de IL-2 mediante ELISA, proporcionando un método sencillo para probar cada lote de células presentadoras de antígenos. En este experimento, las células T periféricas positivas para CD161 y positivas para CD3 de origen humano se enriquecieron mediante separación con perlas magnéticas.

A continuación, las células se estimularon una vez por semana durante 14 días con A APC cargado con alfa galera y se analizó la expresión de V alfa 24 y V beta 11. Es importante destacar que se encontró que, incluso con una población inicial relativamente baja de células NKT del 0,03 %, las células pudieron expandirse hasta alcanzar aproximadamente una población del 67 % positiva para V alfa 24 y positiva para V beta 11. Aquí, las células C uno R CD 1D se incubaron con células NKT en las proporciones indicadas en presencia o ausencia del antígeno alfa Gal SER en placas de 96 pozos con fondo en U durante 20 a 24 horas.

La lisis celular mediada por linfocitos NKT de la línea de linfoma B se evaluó entonces mediante un ensayo de liberación de cromo. Linfocitos NKT expandidos en PC fueron capaces de lisar esta línea celular de linfoma. En presencia o ausencia de alfa galera, los linfocitos NKT se han expandido a partir de los PBMC de voluntarios sanos y de pacientes con cáncer, y se cargaron con alfa galera.

Se ha podido amplificar las poblaciones de células NKT a partir de ambos grupos mediante un PC. Al utilizar una población inicial de 2 millones de células T CD161 positivas y CD3 positivas, se pueden obtener más de 10⁷ células tras dos rondas de expansión. Las células NKT expandidas pueden utilizarse para estudios funcionales, como se demuestra aquí.

Las células NKT expandidas ex vivo siguen respondiendo a la estimulación con Alpha GAL y son productoras potentes de IL-17A, TNF-alfa e interferón gamma. Cabe señalar que si la población inicial de linfocitos T enriquecidos es baja y no puede realizarse el segundo paso de enriquecimiento mediante CD161, la expansión mediada por APC-A podría no producir los resultados esperados. Sin embargo, si el porcentaje de células NKT circulantes es superior al 0,1 %, aún debería poder obtenerse una expansión significativa de células NKT invariantes.

En conjunto, estos datos demuestran que el A A PC basado en CD1D puede utilizarse para expandir y estimular eficazmente linfocitos T NK humanos primarios siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la PCR cuantitativa, con el fin de responder preguntas adicionales, tales como cuáles son la cinética de activación de los linfocitos T NK tras su desarrollo. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la hepatología exploren el papel de las células T NK en la enfermedad del hígado graso.