Apetitivo aprendizaje asociativo olfativa en Drosophila Las larvas

El objetivo de este procedimiento es analizar funciones cerebrales superiores. En un modelo sencillo, larvas DFA mediante el apetito, aprendizaje olfativo asociativo. Esto se logra primero recolectando 30 larvas de tercer estadio alimentadas de un frasco de alimento.

A continuación, las larvas se entrenan durante cinco minutos en una placa de Petri con fructosa como recompensa y un recipiente de olor a cada lado que contiene un octanal como estímulo olfativo. Luego, se realiza una segunda fase de entrenamiento de cinco minutos en una placa sin la recompensa de fructosa y con recipientes de olor a cada lado que contienen acetato de amilo. Después de tres repeticiones de las dos fases de entrenamiento, las larvas se exponen a recipientes de olor en lados opuestos durante una prueba de cinco minutos sin recompensa.

En última instancia, la preferencia relativa de olor de un octal frente al acetato de Amal indica que las larvas de Drosophila pueden formar una asociación entre estímulos olfativos y una recompensa azucarada, lo cual puede utilizarse para estudiar el aprendizaje asociativo en un sistema genéticamente maleable. Este método, en combinación con la interferencia genética de la función neuronal, puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del aprendizaje y la memoria, como cuáles son las neuronas que señalan la recompensa, o cuáles son las neuronas necesarias o suficientes para la adquisición o la recuperación de una memoria repetitiva. Quien demostrará el procedimiento será anti a postop.

Un estudiante de doctorado de mi laboratorio primero prepare placas de Petri con aros al 2,5 % sin fructosa. Para preparar las placas con fructosa, añada la fructosa al aros disuelto y luego viértalo en la placa. A continuación, etiquete cada una de estas placas con un símbolo diferente que permita cegar al experimentador.

El plato que contiene fructosa es la recompensa condicionada, y el plato sencillo es la ausencia de recompensa. Para los estímulos condicionados, prepare un total de tres recipientes personalizados de teflón para olores con 10 microlitros de octanol puro. Las tapas tienen pequeños orificios que permiten la evaporación del olor.

Segundo, prepare otros tres recipientes de olor con 10 microlitros de acetato de amilo diluido uno a 50 en aceite de parafina. Esta dilución es tan atractiva como los 10 microlitros de uno octal puro; comience recolectando 30, alimentando, sin deambular. Tercero, desde un frasco de alimento.

Este protocolo puede realizarse en cualquier momento del día. Es independiente de los ritmos circadianos. Transfiera la lava a una placa de Petri que contenga unas gotas de agua del grifo y muévala cuidadosamente hacia adelante y hacia atrás con un pincel.

Luego, transfiera la lava a una segunda placa de Petri que también contenga algunas gotas de agua del grifo. Inspeccione las larvas para verificar la presencia de pasta alimenticia en sus paredes corporales. A continuación, coloque la placa de Petri en el montaje experimental para entrenar a las larvas a asociar olores con una señal específica de azúcar.

Coloque un recipiente con olor en el lado izquierdo y en el lado derecho de uno de los dos tipos de placa utilizados para los estímulos. Aquí se usa uno octal, pero la elección es arbitraria ya que el experimentador está ciego respecto a la recompensa. A continuación, coloque el grupo de larvas thi en el centro de la placa.

Cierre la tapa y espere cinco minutos mientras los animales están expuestos a los estímulos. Asegúrese de que las larvas puedan superar la tensión superficial de la gota de agua para que no queden atrapadas y puedan explorar libremente. Coloque un nuevo recipiente de acetato de amilo en una placa de Petri fresca.

Después de cinco minutos, utilice un pincel húmedo para transferir la larva al tipo opuesto de placa con los estímulos opuestos ubicados en sus lados izquierdo y derecho. Así, el olor aquí es acetato de amilo. Una vez transferidas las larvas, cierre la tapa y permita que los animales exploren durante cinco minutos.

Una vez transcurrido este tiempo, se habrá completado la primera ronda de entrenamiento. Realice otras dos rondas de entrenamiento de la misma manera que la primera. Transfiera los animales con un pincel húmedo y expóngalos a cada combinación de estímulos y recompensas tres veces en total.

Para el lugar del ensayo experimental, coloque recipientes frescos de olor, uno de cada estímulo en sitios opuestos de una placa de Petri solo con agros sin recubrir. Transfiera los animales entrenados al centro del plato. Cierre la tapa y espere cinco minutos.

Después de cinco minutos, utilice una plantilla debajo del plato que defina claramente tres zonas del plato: izquierda, derecha y central; cuente el número de larvas en cada zona. La zona central representa una puntuación de no preferencia y hace que el análisis sea más restrictivo y menos susceptible a sesgos. Finalmente, para completar el experimento, seleccione 30 nuevas larvas de tercer estadio en fase de alimentación y repita el entrenamiento y la prueba con la combinación opuesta de recompensa y estímulos.

Continúe utilizando los mismos recipientes de olor. Se requieren varias pruebas control para determinar si los animales transgénicos tienen un procesamiento normal de los odoríferos para los estímulos de recompensa. La prueba de preferencia de olor en animales no entrenados comienza con la recolección y lavado de 30 larvas, tal como se realiza para el entrenamiento y las pruebas.

A continuación, coloque las larvas en una placa de Petri agro rosa con un solo vial de estímulo en un lado. Cierre la tapa y espere cinco minutos. Posteriormente, utilizando la plantilla, cuente el número de larvas en el lado cercano, en el centro y en el lado opuesto de la placa con respecto al estímulo.

Realice esta prueba para cada estímulo utilizado en el experimento para evaluar la preferencia inicial por el azúcar. Prepare placas de Petri divididas por la mitad cortando la mitad del agar de una placa y rellenando el espacio vacío con agar fundido del otro tipo. Tenga cuidado de que ambas mitades coincidan en volumen y no formen un borde definido.

Esto puede requerir práctica con el medio preparado a la mitad y a temperatura ambiente, colocado en un recipiente limpio y sin alimento. Coloque tres larvas estrella en el centro del recipiente. Cierre la tapa y espere cinco minutos.

Posteriormente, utilizando la plantilla, cuente el número de larvas en cada lado y cuente también las que se encuentran en el centro. El procedimiento descrito se utilizó para entrenar y probar la lava trenchgénica. Utilizando los estímulos de ejemplo, los datos se registraron como el número de larvas en diferentes regiones de las placas de Petri.

Después de cinco minutos fuera de esta preferencia de datos, se calcularon los índices y se derivaron los índices de rendimiento a partir de los grupos entrenados recíprocamente. Debido a que las larvas analizadas eran transgénicas, también se ofreció una elección entre un recipiente de olor lleno y aire, así como una elección entre aromas puros y aromas más azúcar. Un examen de los índices calculados en el diagrama de caja reveló que los animales fueron capaces de aprender a distinguir un octano del acetato de metilo utilizando aromas con fructosa como refuerzo apetitivo.

Los animales reconocieron ambos estímulos como atrayentes y mostraron una preferencia inicial por el aroma de fructosa frente al aero. Este paradigma experimental se ha utilizado con éxito con una amplia variedad de estímulos olfativos y visuales, así como con una amplia gama de estímulos recompensantes y aversivos. Este paradigma, combinado con las numerosas manipulaciones genéticas potentes disponibles en *Drosophila*, es particularmente útil para desentrañar redes neuronales; por ejemplo, mediante la manipulación genética de conjuntos específicos de neuronas, definidos por patrones de expresión de gal cuatro, se puede evaluar el papel funcional de esas neuronas en el aprendizaje del apetito.

Tras seguir este procedimiento, junto con la interferencia genética de la función neuronal, se puede analizar las redes neuronales del cerebro larvario implicadas en el aprendizaje y la memoria. Debido a la simplicidad del cerebro larvario, esto puede lograrse hasta el nivel de célula individual.