El trasplante ortotópico aórtica en los ratones para el Estudio de la Enfermedad Vascular

El objetivo de este procedimiento es trasplantar la aorta abdominal de un ratón donante a un ratón receptor alogénico. Esto se logra primero obteniendo la aorta del donante. A continuación, se construye el sitio de injerto en el animal receptor.

Posteriormente, se disecciona y divide la aorta nativa del animal receptor. El paso final consiste en utilizar dos anastomosis vasculares extremo a extremo para implantar la aorta donante. En última instancia, este procedimiento puede emplearse para estudiar el desarrollo de enfermedades vasculares post-trasplante en combinaciones de cepas alogénicas.

La ventaja de este método frente a, por ejemplo, el trasplante cardíaco heterotópico, es que resulta más sencillo realizar un análisis morfométrico debido a que los vasos tienen un tamaño uniforme. Además, el vaso no está rodeado por tejido parenquimatoso, que podría estar rodeado por infiltrados celulares y otros elementos que podrían complicar el análisis de los datos generados. El uso de esta técnica puede ser especialmente útil para ilustrar los mecanismos implicados en la enfermedad vascular postrasplante, un problema intratable en el trasplante clínico humano.

Para minimizar los efectos del estrés y maximizar sus reservas de energía, mantenga a los animales en el vivario durante al menos 72 horas antes de la cirugía. El día de la cirugía, coloque una placa metálica de operaciones sobre una almohadilla térmica ajustada a 35-38 grados Celsius. Luego, tras la anestesia, retire el vello del abdomen ventral del animal.

Utilice cinta de laboratorio para colocar al animal en posición de rana sobre la mesa de operaciones, y luego sane la zona afeitada del animal tres veces con un desinfectante seguido de etanol utilizando tijeras estériles. A continuación, realice una incisión a través de la pared corporal para exponer las vísceras abdominales. Luego, utilice un hisopo de algodón estéril para desplazar las vísceras hacia un lado y colocarlas sobre un trozo de gasa estéril humedecida con solución salina tibia, exponiendo así los grandes vasos del abdomen.

Ahora, disecar muy cuidadosamente por empuje romo la aorta abdominal del tejido circundante, incluyendo la vena cava inferior, y luego levantar con cuidado y cauterizar la arteria lumbar. La sección de la aorta para la disección debe estar por debajo de los vasos renales y por encima de la bifurcación de la aorta en las arterias femorales. Después de identificar el área, colocar una sutura justo por debajo de las arterias renales y otra justo por encima de la bifurcación.

A continuación, use tijeras para dividir la aorta y luego sostenga con mucho cuidado un extremo del vaso y gotee solución salina heparinizada para que fluya a través del vaso por gravedad. A continuación, manipule los extremos del vaso lo menos posible. Retire el injerto e inmediatamente colóquelo en un recipiente con solución salina fría con hielo.

Después de administrar anestesia y analgesia al animal receptor, afeite el abdomen ventral como se acaba de mostrar. Aplique pomada oftálmica de gentamicina en los ojos para evitar que se sequen, y luego sane el abdomen como se acaba de demostrar para garantizar una desinfección adecuada. A continuación, realice una incisión media a través de la piel y la pared corporal en etapas.

Luego, inserte un separador para mantener abierta la incisión abdominal, orientando el ensamblaje del tornillo hacia el extremo posterior del animal para mantener la mayor parte de la pinza fuera del camino. A continuación, coloque una gasa estéril empapada en solución salina sobre los intestinos. Después, sostenga suavemente la gasa en su lugar con un dedo.

Introduzca un hisopo estéril debajo de los intestinos y refléjelos suavemente para que los intestinos queden apoyados sobre la gasa. Coloque otra pieza de gasa estéril sobre los intestinos y humedézcala con solución salina. Después de retirar cuidadosamente cualquier tejido adiposo que cubra su ATA y la vena cava inferior, use pinzas para diseccionar cuidadosamente la aorta infrarrenal de la vena cava inferior.

Ahora limpie un área lo suficientemente grande para alojar dos pinzas y con suficientes vasos de modo que, al dividirlos, haya suficiente vaso al que se pueda suturar el injerto. Tenga en cuenta que la sutura negra puede utilizarse para sentir su peso a lo largo del vaso. Al disecar, busque ramas vasculares y cauterice las ramas con un cauterizador de baja temperatura según sea necesario.

A continuación, inserte una pinza vascular justo por debajo de la arteria renal y otra pinza vascular justo por encima de la bifurcación. Luego corte la aorta. En este caso, el corte se realiza más cerca de la bifurcación porque se cauterizó un vaso colateral cerca del punto medio entre las dos pinzas, creando así un sitio de anastomosis; los extremos de la aorta generalmente se retraerán, dejando un espacio de aproximadamente cinco milímetros.

Verifique la hemostasia. Si los pinzas están funcionando correctamente, solo debería escapar una pequeña cantidad de sangre después del corte. A continuación, enjuague los extremos cortados de la aorta con solución salina heparinizada y luego retire con un hisopo la solución sobrante.

Ahora sujete el injerto en su lugar utilizando tres suturas discontinuas en cada extremo. Luego, sutúre un lado de la anastomosis en cada extremo y complete el resto con siete u ocho suturas discontinuas. Si se prefiere una sutura continua, tenga cuidado de que las paredes del vaso permanezcan relajadas y de no provocar estenosis en la anastomosis.

Ahora retire cuidadosamente la pinza en el extremo craneal de la aorta y busque fugas en las líneas de sutura. A continuación, presione suavemente la aorta por encima del sitio de anastomosis con un aplicador de algodón humedecido y retire la segunda pinza. Presione y suelte ligeramente la aorta varias veces para verificar que el vaso esté permeable. El injerto se perfundirá inmediatamente y debería observarse un pulso.

Ahora, retire la gasa que cubre los intestinos y colóquelos de nuevo en su lugar, manteniendo su orientación anatómica normal y evitando torsiones. Utilice una sutura de Vicryl cinco ceros para cerrar la capa muscular y luego cierre la piel con una sutura de prolina cinco ceros o seis ceros. Trate al ratón subcutáneamente con carprofeno para potenciar la analgesia antes de finalizar la anestesia, y luego administre al ratón de 0,5 a 0,8 mililitros de solución salina por la misma vía.

Finalmente, coloque el ratón en una jaula calentada para la recuperación y supervise cuidadosamente al animal. A las 12 y 24 horas posteriores a la operación, administre buprenorfina y carprofeno por vía subcutánea al animal, respectivamente. Esta primera figura muestra un injerto aórtico.

Observe las líneas de sutura indicadas por las flechas blancas aquí. Se muestra un experimento típico en el que la supervivencia de los receptores se siguió durante un período de 56 días. El grupo control consistió en ratones receptores de tipo silvestre C57BL/6 × FVB trasplantados con aortas de intestino.

El grupo experimental consistió en receptores C57BL6xFVB deficientes en la expresión de la hemo oxigenasa uno. Este knockout provoca trombosis de los injertos en menos de 24 horas. Nótese que esto provocó la muerte de todos los receptores.

Esta última figura muestra las mediciones ecográficas de la vena cava inferior y de la aorta abdominal en un animal normal y en un receptor de trasplante. Obsérvese que el injerto está permeable y es similar en apariencia a la aorta no trasplantada. Como se ha visto, los tejidos son muy delicados y pequeños, por lo que debe tenerse en cuenta que este procedimiento es sin duda una habilidad adquirida y, por tanto, se necesitará una buena cantidad de práctica antes de poder realizarlo con éxito de forma rutinaria. Una vez dominado.

Esta técnica puede realizarse en menos de una hora si se lleva a cabo correctamente.