Name: El efecto sinérgico de la luz visible y gentamicina en Pseudomona aeruginosa Microorganismos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Descubre el efecto sinérgico de la luz visible y gentamicina contra Pseudomonas aeruginosa. Este método combina fototerapia con antibióticos para reducir la viabilidad bacteriana en ocho órdenes de magnitud.

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1. Cultura bacteriana <ol><li> P. Gram-negativas aeruginosa cepa PAO1 se cultivaron en caldo Luria (LB) a 37 ° C durante 18 hr. </li><li> El cultivo de células se centrifugó a 7.500 rpm (revoluciones por minuto) durante 5 min y el sobrenadante se eliminó. </li><li> Las bacterias se resuspendieron en 10% LB y volver a crecer durante otras 2 h para permitir la cultura para volver a entrar fase estacionaria. </li><li> La suspensión de bacterias se dividió entonces en dos grupos: en el primer grupo (2 tubos) se añadieron ningún antibiótico, en el segundo grupo hemos añadido el antibiótico gentamicina (50 mg / ml). </li></ol> 2. Determinación de unidades formadoras de colonias (UFC) <ol><li> Para determinar la viabilidad celular 20 l se tomaron muestras a partir del experimento aproximadamente cada 2 horas dentro del marco de tiempo de 24 horas. Dilución en serie de las muestras se hizo y se sembró en placas de agar LB y se incubó durante la noche a 37 ° C. </li><li> Para cada tratamiento, las UFC por plataformae se determinó y se hizo una comparación entre los períodos de tiempo y diversos tratamientos. La reducción log en UFC se calculó como se describe en la ecuación. (1): Iniciar reducción = Logu-logC [UFC / ml] Donde U es el valor de unidades formadoras de colonias en cada punto de tiempo; UFC es la unidad formadora de colonias, mientras que las unidades de UFC / ml igual a: UFC / ml = (número de colonias x factor de dilución) / (volumen inoculado) Y C es el UFC encontrado en la muestra de control en el tiempo de inicio. Tenga en cuenta que U designa el factor de formación de colonias en el instante de medición. </li><li> El factor de dilución es el número de diluciones, mientras que en cada uno de ellos la concentración de las bacterias se redujo por un factor de 10. El volumen inoculado fue siempre 200 litros micro y está relacionado con el tamaño de nuestra tubo de ensayo. </li></ol> Por lo tanto, para resumir el punto de vista de la concentración, el antibiótico gentamicina fue a una concentración de 50 g / ml. En cuanto a las bacterias, hasta el final deel proceso que tuvo en general 8 diluciones. Cada dilución fue en un factor de 10 y se hizo en tubos de 200 l. El punto de partida fue 20 l de muestras añadido en el tubo 200 l (y por lo tanto la concentración inicial era 20/200C 0 0.1C0 con C = 0 es la concentración inicial en la 20 l de muestras) y la concentración final fue reducido en un 8 órdenes de magnitud debido a las 8 diluciones. 3. Iluminación <ol><li> CW láser Nd: YAG (longitud de onda de 532 nm y potencia óptica media de 200 mW) se dividió en dos trayectorias ópticas usando óptica 50% / 50% divisor de haz. El diámetro del haz era de aproximadamente 10 mm. El tiempo de exposición fue de 24 horas. </li><li> Q-switched pulsos láser Nd: YAG (longitud de onda de 532 nm, potencia media de 300 mW y potencia de pico óptica de 2,5 MW) también se dividió en dos caminos usando óptica 50% / 50% divisor de haz. El diámetro de la mancha era de 6 mm. El ancho de pulso del láser de conmutación de Q fue de 6 ns y la tasa de repetición era 15Hz. Ladensidad de potencia promedio fue de 106 mW / cm 2 y la densidad de potencia pico fue de 8,83 kW / mm 2. El tiempo de exposición fue de 24 horas. </li></ol> Tenga en cuenta que la suspensión bacteriana se agitó durante la irradiación y se mantuvo bajo condiciones de cultivo apropiadas para el crecimiento bacteriano (en todos los tubos no había medio de Caldo Luria para permitir que las bacterias crezcan).

<ol><li>Feuerstein, O., Persman, N., Weiss, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxic+Effect+of+Visible+Light+on+Porphyromonas+gingivalis+and+Fusobacterium+nucleatum%3A+An+In+Vitro+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Phototoxic Effect of Visible Light on Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum: An In Vitro Study.</a> Photochemistry and Photobiology. 80, 412-415 (2004).</li>
<li>Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+470-nm+light+kills+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+%28MRSA%29+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Photomed.+Laser+Surg%22%5BJournal%5D)">Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro.</a> Photomed. Laser Surg. 27, 221-226 (2009).</li>
<li>Guffey, J. S., Wilborn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+bactericidal+effects+of+405-nm+and+470-nm%5BTitle%5D)+AND+%22Photomed.+Laser+Surg%22%5BJournal%5D)">In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm.</a> Photomed. Laser Surg. 24, 684-688 (2006).</li>
<li>Lipovsky, A., Nitzan, Y., Friedman, H., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+Staphylococcus+aureus+strains+to+broadband+visible+light%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of Staphylococcus aureus strains to broadband visible light.</a> Photochem. Photobiol. 85, 255-260 (2008).</li>
<li>Lipovsky, A., Nitzan, Y., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+possible+Mechanism+for+visible+light+induced+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">A possible Mechanism for visible light induced wound healing.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 40, 509-514 (2008).</li>
<li>Lipovsky, A., Nitzan, Y., Gedanken, A., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visible+light-induced+killing+of+bacteria+as+a+function+of+wavelength%3A+Implication+for+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Visible light-induced killing of bacteria as a function of wavelength: Implication for wound healing.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 42, 467-472 (2010).</li>
<li>Feuerstein, O., Ginsburg, I., Dayan, E., Veler, D., Weiss, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Visible+Light+Phototoxicity+on+Porphyromonas+gingiwalis+and+Fusobacferium+nucleaturn%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Visible Light Phototoxicity on Porphyromonas gingiwalis and Fusobacferium nucleaturn.</a> Photochemistry and Photobiology. 81, 1186-1189 (2005).</li>
<li>Nussbaum, E. L., Lilge, L., Mazzulli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+630-%2C+660-%2C+810-%2C+and+905-nm+laser+irradiation+delivering+radiant+exposure+of+1-50+J%2Fcm2+on+three+species+of+bacteria+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Laser+Med.+Surg%22%5BJournal%5D)">Effects of 630-, 660-, 810-, and 905-nm laser irradiation delivering radiant exposure of 1-50 J/cm2 on three species of bacteria in vitro.</a> J. Clin. Laser Med. Surg. 20, 325-333 (2002).</li>
<li>Dadras, S., Mohajerani, E., Eftekhar, F., Hosseini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+Photoresponses+of+Staphylococcus+aureus+and+Pseudomonas+aeruginosa+to+514%2C+532%2C+and+633+nm+Low+Level+Lasers+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Different Photoresponses of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa to 514, 532, and 633 nm Low Level Lasers In Vitro.</a> Current Microbiology. 53, 282-286 (2006).</li>
<li>Stover, C. K., Pham, X. Q., Erwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1%2C+an+opportunistic+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen.</a> Nature. 406, 952-964 (2000).</li>
<li>Hamblin, M. R., Demidova, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+low+level+light+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+SPIE%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of low level light therapy.</a> Proc. SPIE. 6140, 1-12 (2006).</li>
<li>Krespi, Y. P., Stoodley, P., Hall-Stoodley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+disruption+of+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Laser disruption of biofilm.</a> Laryngoscope. 118, 1168-1173 (2008).</li>
<li>Reznick, Y., Banin, E., Lipovsky, A., Lubart, R., Zalevsky, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+laser+light+enhancement+of+susceptibility+of+bacteria+to+gentamycin+antibiotic%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct laser light enhancement of susceptibility of bacteria to gentamycin antibiotic.</a> Opt. Commun. 284, 5501-5507 (2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La fototerapia ha sido un campo de investigación multidisciplinar avanzado en los últimos años emergentes como un enfoque prometedor para el tratamiento de numerosas enfermedades. En este contexto, el uso de la luz en el rango visible ha sido ampliamente estudiado. Por ejemplo, se ha encontrado que las heridas infectadas pueden ser curadas con mayor eficacia mediante la exposición a la luz visible intensa para fines de esterilización. El mecanismo de acción de este enfoque ha demostrado ser a través de la inducción de r...

<table><tbody><tr><td>Caldo Lauria</td><td>Difco</td><td>241420</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma</td><td>G1914</td><td></td></tr><tr><td>Agar Bacto</td><td>Difco</td><td>231710</td><td></td></tr></tbody></table>

el efecto sinérgico de la luz visible y gentamicina en<em&gt; pseudomona aeruginosa</em&gt; microorganismos

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

Recientemente hubo varias publicaciones sobre el efecto bactericida de la luz visible, la mayoría de ellos afirmando que parte azul del espectro (400 nm-500 nm) es responsable de matar a varios patógenos 1-5. El efecto fototóxico de la luz azul se propuso ser el resultado de las especies reactivas de oxígeno inducidas por la luz (ROS) de formación de fotosensibilizadores bacterias endógenas que en su mayoría absorben luz en la región azul 4,6,7. También hay informes de efectos biocidas de infrarrojos y zona de Red 8, así como la luz verde 9. En el presente estudio, hemos desarrollado un método que nos ha permitido caracterizar el efecto de la luz Q-switched continua (CW) y pulsada (QS) de alta potencia verde (longitud de onda de 532 nm) de Pseudomonas aeruginosa. El uso de este método también estudiamos el efecto de la luz verde se combina con el tratamiento con antibióticos (gentamicina) en la viabilidad de las bacterias. P. aeruginosa es de corriente alternaommon noscomial patógeno oportunista que causa diversas enfermedades. La variedad es bastante resistente a varios antibióticos y contiene muchos predijeron tipo Mex AcrB / RND a múltiples sistemas de flujo de salida 10. El método utilizado fase bacterias Gram-negativas estacionarias de vida libre (cepa P. aeruginosa PAO1), cultivadas en caldo Luria (LB) expuesto a la conmutación de Q y / o láseres de CW con y sin la adición del antibiótico gentamicina. La viabilidad celular se determinó en diferentes puntos de tiempo. Los resultados obtenidos mostraron que el tratamiento con láser solo no redujo la viabilidad celular en comparación con el control no tratado y que el tratamiento con gentamicina sola sólo dio lugar a una reducción de 0,5 log en el recuento de viables para P. aeruginosa. El láser combinado y tratamiento con gentamicina, sin embargo, dieron lugar a un efecto sinérgico y la viabilidad de P. aeruginosa se ​​redujo en un 8 registro de. El método propuesto puede ser más implementado a través del desarrollo de catéter como dispositivo capaz de inyectar una solución de antibiótico en el órgano infectado, mientras que al mismo tiempo que ilumina la zona de luz.

La configuración basada en láser se presenta esquemáticamente en la Figura 1. La primera condición experimental utiliza un CW láser de Nd: YAG que tiene longitud de onda de 532 nm (el segundo armónico de la Nd: YAG) y la potencia óptica media de 200 mW. Este haz se divide en dos trayectorias ópticas usando 50% / 50% divisor de haz óptico de tal manera que cada haz dividido tenía potencia de 100 mW. El diámetro del haz era de aproximadamente 10 mm y por lo tanto la densidad de potencia fue de 100 mW / cm...

Se demuestra que un dispositivo biomédico desarrollado que implica el tratamiento basado en láser visible continuo o pulsado que se combina con el tratamiento con antibióticos (gentamicina), da como resultado un efecto sinérgico estadísticamente significativa que conduce a una reducción en la viabilidad de los<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; PAO1, el 8 de registro es en comparación con el tratamiento antibiótico solo.

El efecto sinérgico de la luz visible y gentamicina en<em&gt; Pseudomona aeruginosa</em&gt; Microorganismos

Recientemente se han realizado diversas publicaciones sobre el efecto bactericida de la luz visible, la mayoría de las cuales afirman que la parte azul del espectro (400 nm-500...

El objetivo general del siguiente procedimiento es validar experimentalmente el aumento de la eficacia de la gentamicina por la luz visible sobre Pseudomona aerogen en solución. Esto se logra primero cultivando la cepa bacteriana experimental. En el segundo paso, las bacterias se iluminan en presencia o ausencia de tratamiento con antibiótico.Finalmente, las muestras se recogen del cultivo durante un período de 24 horas, y luego se cuantifican las unidades formadoras de colonias dentro del cultivo celular en cada punto temporal. En última instancia, puede evaluarse el efecto de la iluminación sobre la susceptibilidad bacteriana a la eliminación mediante tratamiento con antibióticos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia in vivo de infecciones, ya que la iluminación mejora la eficacia del tratamiento con antibióticos.La demostración del procedimiento será realizada por Anna Resnick, estudiante de maestría en mi laboratorio. Comience por cultivar la cepa bacteriana de interés en el medio de crecimiento adecuado. Aquí, la cepa gramnegativa P. aeruginosa PAO1 se cultiva en caldo Luria a 37 grados Celsius durante catorce horas.A continuación, centrifugue las células durante cinco minutos a aproximadamente 3.145 ×g y temperatura ambiente. Luego, retire el sobrenadante y re suspenda las bacterias en caldo Lauria al 10%. Reincube las células durante otras dos horas en caldo Lauria a 37 grados Celsius para permitir que la cultura reingrese a la fase estacionaria. A continuación, divida la suspensión bacteriana en dos grupos, añadiendo gentamicina a uno de los grupos.Ahora coloque cada uno de los cultivos sobre agitadores magnéticos y enciéndalos. A continuación, divida un láser de onda continua nd YAG, o alternativamente un láser pulsado nd YAG con conmutación Q, en dos trayectorias ópticas para iluminar los cultivos cuando haya comenzado la iluminación. Comience a retirar muestras de 20 microlitros de los grupos control y tratados con antibiótico aproximadamente cada dos horas durante 24 horas.Al día siguiente, diluya seriamente las muestras obtenidas. Por ejemplo, para este experimento, las bacterias se diluyeron ocho veces por un factor de 10 en volúmenes de inoculación de 200 microlitros. Luego, siembre la dilución en placas de agar con caldo luria e incube las muestras durante la noche a 37 grados Celsius la mañana siguiente.Determine el número de unidades formadoras de colonias o UFC por placa para cada tratamiento, y luego calcule la reducción logarítmica en UFC como se ilustra aquí. Tenga en cuenta que y denota los valores de unidades formadoras de colonias en cada punto de tiempo exactamente en el momento de la medición. UFC denota la unidad formadora de colonias y C denota la UFC encontrada en la muestra control al tiempo inicial.Además, las unidades de UFC por mililitro equivalen al número de colonias multiplicado por el factor de dilución dividido por el volumen de inoculación. A continuación se muestra una representación esquemática del montaje basado en láser, en la que un láser de onda continua NDA o un láser con conmutación Q se divide en dos trayectorias mediante un divisor de haz óptico 50/50. Ambas muestras se colocan sobre un agitador.Esta imagen muestra el montaje experimental en el que el láser se divide entre dos tubos con el fin de eliminar ambos tubos en condiciones idénticas. Una cultura se trata con antibióticos y la otra, la de control, no se trata. Luego, las bacterias se exponen a los láseres durante 24 horas.Este gráfico muestra la iluminación efectiva sobre el crecimiento de p aerogen con luz láser de onda continua o con láser de conmutación Q, respectivamente, en presencia o ausencia de tratamiento con antibióticos en las muestras de control sin exposición a la luz. No hubo reducción en la viabilidad celular, independientemente de si los cultivos recibieron antibióticos, lo que sugiere que las bacterias son resistentes a la gentamicina, ni el tratamiento con el láser por sí solo afectó el crecimiento celular. Sin embargo, en los cultivos tratados con el láser y el antibiótico, la viabilidad bacteriana se redujo en varios órdenes de magnitud.El efecto más destacado se midió tras 24 horas, en el que la combinación de láser de onda continua o conmutado Q redujo la viabilidad de las células bacterianas en ocho órdenes de magnitud en comparación con los grupos control de antibiótico solo o luz sola. Estos datos sugieren una solución para el tratamiento de bacterias resistentes a los antibióticos. Por lo tanto, los puntos en esta figura representan los puntos de dispersión de luz para facilitar la administración dual de iluminación láser difusa y tratamiento con antibiótico mediante un catéter colocado en el tejido infectado por bacterias.Esta figura final del espectro de absorción alrededor de 532 demuestra claramente que tanto la cepa bacteriana p aerogen como el antibiótico gentamicina son transparentes a esta longitud de onda, lo que convierte a esta longitud de onda en una opción viable para el tratamiento combinado. La técnica presentada allanó el camino para que los investigadores en el campo de la microbiología y la medicina exploren la eficacia de este método, así como su aplicación en biopelículas y sistemas orgánicos. No olvide que trabajar con microorganismos pseudomona orgen puede ser extremadamente peligroso, por lo que siempre se debe utilizar una técnica estéril adecuada, así como un entorno y equipo esterilizados al realizar este procedimiento.

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