La perfusión intravascular de Carbono Negro Tinta fiable permite la visualización de los vasos cerebrales

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la anatomía vascular cerebral de ratones de manera reproducible. Primero, los vasos cerebrales se tiñen con látex de color para su posterior comparación con la tinción de tinta negra de carbón. A continuación, se mezclan las tintas negras de carbón y los animales se perfunden con P-B-S-P-F-A y la mezcla de tinta negra de carbón a través del ventrículo izquierdo.

En la etapa final, se recolecta el cerebro y se toman fotografías para comparación y análisis de los vasos cerebrales teñidos. Finalmente, se utiliza el software ImageJ para analizar los puntos anastomóticos entre las arterias cerebrales media y anterior. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de enfermedades cerebrovasculares, particularmente el accidente cerebrovascular, ya que puede utilizarse para analizar la densidad vascular y la angiogénesis.

Ahora, este método puede proporcionar información sobre el sistema vascular del cerebro y también puede aplicarse a otros sistemas, como para la visualización de microvasos en el corazón, el hígado o el riñón. Después de combinar la látex con tinta de negro de humo en un tubo EP, caliente la mezcla a 37 grados Celsius en un baño de agua. Utilice una aguja de calibre 23 a 25 para recoger la látex calentada en una jeringa de dos mililitros.

Luego, disuelva 12,5 miligramos de polvo de papina clorhidrato en un mililitro de solución salina normal estéril y, tras agitar en vórtex, recoga la solución resultante en una jeringa para insulina. A continuación, rompa la aguja de otra jeringa estéril para insulina y coloque la aguja separada en el extremo de un tubo PE 10 de 20 centímetros de longitud. Luego, conecte el tubo PE 10 a la aguja de la jeringa para insulina que contiene la solución de papina clorhidrato.

Ahora llene dos jeringas de insulina más con un mililitro de solución salina y luego lleve todas las jeringas junto con los instrumentos de disección esterilizados al área operatoria antes de la anestesia. Pese al ratón, luego coloque al ratón continuamente anestesiado en posición supina. Fije las extremidades y corte la piel sobre la vena femoral izquierda.

Ahora localice la vena femoral e inserte la punta de la aguja conectada al tubo PE 10. Luego inyecte lentamente la solución de papina clorhidrato a una velocidad de aproximadamente 100 microlitros por minuto y una dosis de 50 miligramos por kilogramo de peso corporal. Tras la inyección, abra la cavidad abdominal y luego perfore el diafragma.

Luego, corte las costillas para exponer el corazón y pinza la aorta torácica descendente con fórceps arterial. A continuación, realice un corte preciso sobre la aurícula derecha para drenar la sangre venosa. Luego, inyecte dos mililitros de solución salina en el ventrículo izquierdo.

La presencia de aire en las soluciones Profil o en la mezcla de tinta combinada puede provocar áreas vasculares del cerebro sin teñir. Para asegurar el éxito, revise cuidadosamente que todas sus jeringas estén completamente libres de burbujas de aire. A continuación, administre suavemente el contenido de las jeringas precargadas, una tras otra, para la inyección manual del látex coloreado durante un período de 18 a 20 segundos, y deje al animal durante cinco minutos.

Luego de decapitar al animal, retire el hueso del cráneo y las meninges teniendo cuidado de no lesionar la corteza ni la arquitectura vascular, y a continuación extraiga cuidadosamente todo el cerebro. Coloque el cerebro en una placa de cultivo celular de 60 milímetros que contenga de seis a ocho mililitros de PFA al 4 %, y luego coloque una regla graduada debajo de la placa utilizando una cámara conectada al microscopio quirúrgico. Tome fotografías con un aumento de 25 x de las superficies dorsal y ventral del cerebro, con un ángulo de 90 grados entre el objetivo del microscopio y la placa de Petri.

Para cuantificar la distancia original, inicie el procedimiento de tinción con tinta de negro de humo mezclando dos alícuotas de 100 microlitros de tinta herts stemple farba o CB uno con dos alícuotas de 900 microlitros de tinta pelican scribal schwartz o CB dos en dos tubos EP separados de 1,5 mililitros. Recoja las mezclas de tinta en dos jeringas de insulina separadas de un mililitro. Luego tape las jeringas y colóquelas en un baño de agua a 37 grados Celsius, junto con otras dos jeringas de insulina que contengan un mililitro de solución salina cada una.

Después de tratar el ratón como se acaba de demostrar, use una ligera presión para inyectar ambas soluciones de tinta negra de carbón en el ventrículo izquierdo durante 18 a 20 segundos por mililitro. Después de extraer el cerebro y tomar fotografías como se acaba de demostrar, coloque el cerebro en PFA al 4 % durante la noche, seguido de una incubación en concentraciones crecientes gradualmente de sacarosa hasta que el cerebro flotante se sumerja completamente. Comience este paso induciendo una isquemia cerebral focal transitoria.

De acuerdo con un protocolo estándar de oclusión intraluminal de la arteria cerebral media, al final del período de reperfusión, tiña la vasculatura con las tintas CB uno y CB dos como se acaba de demostrar, y luego tiña todo el cerebro con una solución de TTC al 2% a 37 grados Celsius durante cinco a 10 minutos. Para la identificación del volumen de infarto, el área infartada permanecerá blanca, mientras que el área no isquémica se volverá roja. Recolecte imágenes como se acaba de demostrar para analizar la anatomía macroscópica de los vasos cerebrales; comience abriendo una imagen de la superficie teñida del cerebro.

Con el software Image J, los cerebros perfundidos con látex coloreado pueden mostrar grados variables de tinción vascular localizados en la superficie ventral. Mientras que la perfusión de CB1 más CB2 tiñe todos los vasos sanguíneos en las superficies ventral y dorsal. Establezca la escala en milímetros, marque los puntos anastomóticos entre la arteria cerebral anterior o aCA y la arteria cerebral media o MCA para crear una línea imaginaria que conecte todos estos puntos anastomóticos.

Ahora, mida la distancia entre la línea anastomótica y la línea media a cuatro y luego seis milímetros caudales al polo frontal del cerebro. Después de analizar de tres a cuatro imágenes por animal, calcule el valor medio. Compare los valores entre los diferentes grupos de animales para identificar la variación dentro de la anatomía cerebrovascular.

En animales C57 black six J, la línea anastomótica entre la aCA y la ACM puede rastrearse más cerca de la línea media a cuatro milímetros que a seis milímetros, caudalmente desde el polo frontal, mientras que los ratones deficientes en la apolipoproteína E no presentan una diferencia significativa a este respecto. Por el contrario, la línea anastomótica en ratones SV129 se sitúa más alejada y más paralela a la línea media, tanto a cuatro milímetros como a seis milímetros, caudalmente desde el polo frontal, para el análisis de la anatomía vascular. Bajo condiciones isquémicas, identifique el borde del infarto como el margen del tejido de color rojo y blanco, que representa el tejido metabólicamente activo y el tejido necrótico, respectivamente; mida la distancia del borde del infarto desde la línea media a cuatro milímetros y al nivel del milímetro sexto caudal desde el polo frontal del cerebro.

El protocolo descrito aquí supera las limitaciones técnicas de la visualización convencional basada en látex de la vasculatura cerebral de roedores. Como muestra esta primera imagen tras la perfusión con látex coloreado, solo los vasos grandes de la superficie ventral quedan teñidos, dejando toda la superficie dorsal sin teñir. Por el contrario, la perfusión con CB uno más CB dos da como resultado un llenado suficiente tanto de los vasos pequeños como de los grandes, de manera uniforme.

La tinción es estable durante siete días sin ningún cambio en la calidad. Mediante el uso del programa Image J, se puede analizar la distancia de los puntos anastomóticos entre la A CA y la MCA respecto a la línea media en todos los grupos diferentes de ratones, que han sido perfundidos con tintas para evaluar las diferencias en la anatomía vascular regional. Aunque la eliminación de un POE no afecta la estructura anatómica de los vasos cerebrales en ratones C57 black six J, se puede observar una diferencia significativa entre las cepas C57 black six J y SV129.

En modelos experimentales de accidente cerebrovascular en roedores, la tinción con TTC se utiliza ampliamente para la visualización del volumen de infarto. La tinción con CB uno más CCB dos también es aplicable en condiciones isquémicas para observar los cambios estructurales en la vasculatura y demuestra una alta estabilidad cuando se combina con la tinción con TTC. Téngase en cuenta la visualización simultánea de los vasos cerebrales y del volumen de infarto en cerebros isquémicos inducidos por diferentes duraciones de isquemia cerebral y puntos temporales de reperfusión.

El análisis de los puntos anastomóticos entre la a c y la MCA tras 45 o 90 minutos de isquemia, combinados con períodos de reperfusión de un día o cinco días, muestra, como se esperaba, que la diferencia media entre la línea media y los puntos anastomóticos no presentó diferencias significativas entre los grupos. Además, la distancia media se encontraba en el mismo rango que en los animales no isquémicos. Sin embargo, la distancia desde la línea media hasta el borde de la infartación difiere significativamente entre los grupos, reflejando un mayor volumen de infarto con grados más altos de lesión por isquemia-reperfusión.

Esta técnica tiene el potencial de allanar el camino para investigadores en el campo del accidente cerebrovascular experimental, con el fin de explorar las territorios vasculares en el cerebro del ratón. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar la anatomía del sistema vascular cerebral en ratones mediante la perfusión del cerebro con tintas laxantes o negras de carbón, y de cómo analizar el tejido cerebral teñido resultante con la ayuda del software Image J.