La identificación de los compuestos volátiles olfativas utilizando cromatografía de gases-de varias unidades Grabaciones (GCMR) en el lóbulo antenal insectos

El objetivo general de este procedimiento es identificar odorantes biológicamente efectivos en mezclas complejas mediante grabaciones en el cerebro del abejorro. Esto se logra primero recolectando mezclas con efecto conductual, y segundo, preparando el cromatógrafo de gases y los sistemas de grabación multicanal para el experimento. El tercer paso consiste en preparar y diseccionar el cerebro del abejorro para las grabaciones neuronales en el lóbulo antenal.

A continuación, se realiza el experimento insertando los electrodos en un lóbulo antenal y midiendo las respuestas a los compuestos volátiles aplicados mediante el análisis de la actividad neuronal en respuesta a mezclas olfativas complejas y a sus constituyentes individuales. Pueden identificarse odorantes biológicamente activos mediante cromatografía de gases. Así, la principal ventaja de esta técnica en comparación con otras, como la G-C-E-A-G, es la sensibilidad de las neuronas de la antena y la capacidad de caracterizar cómo responden las neuronas del cerebro a volátiles florales específicos.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos combinados de análisis electrofisiológico y análisis químico son difíciles de aprender debido a la técnica de grabación del preparado electrofisiológico y a los pasos necesarios para recolectar los volátiles del espacio de cabeza. Aunque esta técnica puede proporcionar información sobre el procesamiento olfativo de los abejorros, también puede aplicarse a otros sistemas, como factores de enfermedades en mosquitos o chinches asesinas, o plagas agrícolas como áfidos o polillas. Para este procedimiento, tenga preparado un electrodo de referencia hecho de alambre de tungsteno sobre un micromanipulador en un segundo.

El micromanipulador tiene un electrodo multicanal, como un alambre enrollado, un electrodo tede o un electrodo multicanal de silicio conectado a un preamplificador, y un cromatógrafo de gases con una salida en una mesa BNC blindada. La salida del detector del CG se conecta al amplificador y al sistema de adquisición de datos de forma que las señales neuronales y del CG estén sincronizadas. En este ejemplo, el gas portador del CG es helio y se utiliza una columna DB-5 para el CG.

El CG utiliza una entrada con división de flujo y una temperatura ajustada a 200 grados Celsius, y el detector de ionización de llama tiene una temperatura establecida a 230 grados Celsius. Después de que las muestras se calientan en el CG, el efluente de la columna se divide en una proporción uno a uno entre el detector de ionización de llama y la antena B mediante un conector de vidrio en forma de Y. En este ejemplo, el CG se utiliza para entregar volátiles recolectados mediante absorción dinámica de flores de Mimus Lewis eye, una planta silvestre alpina nativa de California.

Alternativamente, en lugar de utilizar el cromatógrafo de gases (gc), se pueden administrar compuestos volátiles individuales o mezclas de compuestos mediante pulsos de aire. Se inyectan a través de una jeringa de vidrio separada que contiene un trozo de papel de filtro sobre el cual se han depositado los compuestos. Los pulsos de aire se desvían de una corriente de aire constante mediante una válvula activada por solenoide controlada por una computadora.

Comience las preparaciones cortando aproximadamente un centímetro del extremo de una punta de pipeta de un mililitro. Coloque un abejorro en la base de la punta de pipeta y empuje suavemente hacia el extremo opuesto de la punta hasta que solo quede expuesta la cabeza. Utilizando cera dental derretida, haga un molde alrededor de la cabeza expuesta.

La cera debe adherirse a los ojos compuestos para inmovilizar completamente la cabeza, pero no debe tocar la antena si es necesario. Utilice alfileres pequeños para inmovilizar las antenas. A continuación, realice una incisión en forma de ventana cuadrada en la cápsula cefálica utilizando una hoja afilada, como un escalpelo microscópico.

Comience a cortar directamente detrás de la antena y adyacente a uno de los ojos compuestos. Realice una línea recta entre los ojos. A continuación, corte dorsalmente hasta que la cápsula cefálica se curve hacia el tórax.

Continúe el corte hasta el extremo opuesto de la cápsula cefálica. Finalmente, corte de regreso al punto inicial para completar el cuadrado. Utilice pinzas para retirar la cutícula.

Debe eliminarse la cutícula adyacente a la antena, ya que obstaculizará el electrodo tan pronto como se exponga el cerebro. Inmediatamente, sature el tejido con solución salina para insectos. Asegúrese de que los lóbulos antenales queden bien expuestos.

Luego, use con cuidado un par de pinzas muy finas para retirar la vaina perineural inmediatamente por encima de los lóbulos antenales. Tenga mucho cuidado de no perforar el cerebro de la abeja con las pinzas. La preparación de la abeja ya está lista para el registro electrofisiológico.

Comience fijando la abeja preparada a una pinza que está sujeta a una base magnética. Manténgala sobresaturada con solución salina para insectos suministrada desde un depósito con un controlador de flujo. A continuación, inserte el electrodo de referencia en el tejido cerebral contralateral.

A continuación, inserte el electrodo multicanal en los lóbulos antenales de la abeja. Cuando los electrodos estén en su lugar, espere de 30 a 60 minutos para que las grabaciones se estabilicen.

Durante este tiempo, prepárese para detectar los picos extracelulares de las neuronas mediante umbralización. Puede ser necesaria la umbralización manual en algunos canales debido al ruido en los canales de grabación. A continuación, verifique que la rampa de temperatura del análisis en GC sea correcta.

En este ejemplo, la temperatura comienza a 50 grados Celsius durante cuatro minutos y luego aumenta 10 grados por minuto hasta alcanzar una temperatura final de 220 grados Celsius, o se mantiene durante seis minutos. Cuando las formas de onda de las unidades en los canales de grabación se han vuelto consistentes, se considera que las grabaciones neuronales son estables. Una vez estabilizadas, cargue la jeringa con el olor del espacio aéreo floral e inyecte el olor en el puerto de inyección del cabezal del gc.

Luego, comience inmediatamente a registrar las señales de los electrodos después de que finalice la corrida de GC. Deje reposar la preparación durante cinco a 15 minutos. A continuación, inyecte otra muestra en el GC o estimule la preparación utilizando compuestos volátiles individuales o mezclas de compuestos.

Si en algún momento la actividad espontánea se detiene o cambia repentinamente, verifique la perfusión de salino y deje que la preparación descanse durante 15 minutos. Si la actividad no recupera su nivel previo, deseche la preparación. Después del experimento, fije el cerebro con las sondas aún en el tejido, luego extraiga el cerebro, elimine el fijador y deshidrate el cerebro.

Las ubicaciones de los canales de grabación pueden identificarse entonces mediante microscopía confocal a partir del aroma floral de mimus Luci. El número total de volátiles está escapando. El CG suele estar entre 60 y 70 compuestos.

El aroma de Mimus Luci está compuesto predominantemente por monoterpenoides, incluyendo beta miosina y alfa pinina. El resto del aroma está compuesto por volátiles de seis carbonos. Se estimularon varias preparaciones con tres microlitros del extracto ocular de Mimus Lewis.

Esta grabación de una de las ocho unidades neuronales registradas por el electrodo multicanal muestra cómo un neurona responde selectivamente a compuestos volátiles específicos. En este ejemplo, se muestra el dine como el compuesto. A continuación se presentan las respuestas de ocho unidades neuronales.

Aproximadamente la mitad del conjunto no respondió. Esto es sorprendente dada la diversidad de compuestos volátiles mencionados en el espacio floral, pero es consistente entre preparaciones y ha sido reportado por otros estudios. La tasa de disparo normalizada de las unidades responsivas muestra que existe una selectividad marcada para un grupo de odorantes.

Los odorantes resaltados por las flechas provocaron las respuestas más robustas. Estos son la demina y la trans beta osaina. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo preparar tu insecto para el experimento y luego realizar el experimento utilizando cromatografía de gases con grabación multicanal.

El objetivo entonces es identificar odorantes putativamente eficaces desde el punto de vista conductual en un bouquet complejo. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos o tres horas si se lleva a cabo correctamente siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como pruebas conductuales con los odorantes identificados, para determinar completamente la eficacia de los compuestos volátiles en la mediación de la respuesta conductual del insecto.