La identificación de los compuestos volátiles olfativas utilizando cromatografía de gases-de varias unidades Grabaciones (GCMR) en el lóbulo antenal insectos

El objetivo general de este procedimiento es identificar odorantes biológicamente efectivos en un sentido complejo a través de grabaciones en el cerebro del abejorro. Esto se logra primero recolectando el sentido del efecto conductual y, en segundo lugar, preparando el cromatógrafo de gases y los sistemas de registro multicanal para el experimento. El tercer paso es preparar y diseccionar el cerebro del abejorro para las grabaciones neuronales en la antena del lóbulo de la fábrica.

A continuación, el experimento se lleva a cabo insertando los electrodos en el lóbulo de una antena y midiendo las respuestas a los volátiles inflados mediante el análisis de la actividad neuronal en respuesta al sentido complejo y sus constituyentes individuales. Se pueden identificar odorantes biológicamente activos obtenidos por cromatografía de gases. Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica en relación con otras técnicas como G-C-E-A-G, es la sensibilidad de las neuronas de carga de antena y la capacidad de caracterizar cómo las neuronas en el cerebro responden a volátiles florales específicos.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos analíticos electrofisiológicos y químicos combinados son difíciles de aprender debido a la preparación electrofisiológica, la técnica de registro y los pasos necesarios para recolectar los volátiles del espacio de cabeza. Aunque esta técnica puede proporcionar información sobre el procesamiento olfativo de los abejorros, también se puede aplicar a otros sistemas, como factores de enfermedades como mosquitos o vinchucas, o plagas de cultivos como pulgones o polillas. Para este procedimiento, se ha preparado un electrodo de referencia hecho de alambre de tungsteno en un micro manipulador en un segundo.

El micromanipulador tiene un electrodo multicanal, como un cable en espiral, un tede o un electrodo multicanal de silicona conectado a un preamplificador tiene un cromatógrafo de gases con una salida en una mesa BNC blindada. La salida del detector de GC se interconecta con el amplificador y el sistema de adquisición de datos, de modo que tanto las señales neuronales como las de GC están sincronizadas. En este ejemplo, el gas portador de GC es helio y se encuentra en una columna DB five GC.

El GC utiliza una entrada de lista dividida con la temperatura establecida en 200 grados Celsius y tiene la temperatura del detector de ionización de llama configurada en 230 grados Celsius. Después de que las muestras se calientan en el gc, el efluente de la columna se divide uno a uno entre el detector de ionización de llama y la antena B mediante un conector Y de vidrio. En este ejemplo, el GC se utiliza para entregar volátiles recolectados por absorción dinámica de las flores de ojo de Mimus Lewis, una flor silvestre alpina originaria de California.

Alternativamente, en lugar de usar el gc, los compuestos volátiles individuales o las mezclas de compuestos se pueden administrar mediante pulsos de aire. Se inyecta a través de una jeringa de vidrio separada que contiene un trozo de papel de filtro en el que se han depositado los compuestos. Los pulsos de aire se desvían de una corriente de aire constante mediante una válvula activada por solenoide controlada por una computadora.

Comience los preparativos cortando aproximadamente un centímetro desde el extremo de la punta de una pipeta de un mililitro. Coloque un abejorro en la base de la punta de la pipeta y empújelo suavemente hacia el extremo opuesto de la punta hasta que solo quede expuesta la cabeza. Con cera dental derretida, haz un molde alrededor de la cabeza expuesta.

La cera debe adherirse a los ojos compuestos para inmovilizar completamente la cabeza, pero no debe entrar en contacto con la antena si es necesario. Utilice pequeños alfileres para inmovilizar las antenas. A continuación, haz una incisión cuadrada en forma de ventana en la cápsula de la cabeza con una cuchilla afilada como un microbisturí.

Comience a cortar directamente detrás de la antena y adyacente a uno de los ojos compuestos. Corta una línea recta entre los ojos. A continuación, corte dorsalmente hasta que la cápsula de la cabeza se curve hacia el tórax.

Continúa el corte hasta el extremo opuesto de la cápsula de la cabeza. Finalmente corta hasta el principio para completar el cuadrado. Use fórceps para quitar la cutícula.

La cutícula adyacente a la antena debe ser removida, o impedirá el electrodo tan pronto como el cerebro esté expuesto. Inmediatamente superfusione el tejido con solución salina de insectos. Asegúrese de que los lóbulos de las antenas estén bien expuestos.

A continuación, utilice con cuidado un par de pinzas muy finas para extraer la vaina perineural inmediatamente por encima de los lóbulos de la antena. Tenga mucho cuidado de no perforar el cerebro de la abeja con las pinzas. La preparación de la abeja ya está lista para el registro electrofisiológico.

Comience conectando la abeja preparada a una abrazadera que esté fijada a una base magnética. Manténgalo súper fusionado con solución salina para insectos suministrada desde un depósito con un controlador de flujo. Ahora inserte el electrodo de referencia en el tejido cerebral contralateral.

A continuación, inserte el electrodo multicanal en los lóbulos de la antena de la abeja. Cuando los electrodos están en su lugar. Espere de 30 a 60 minutos para que las grabaciones se estabilicen.

Durante este tiempo, prepárese para los picos extracelulares de las neuronas mediante también el umbral. Es posible que se requiera el umbral manual de los canales de grabación individuales para algunos canales debido a un ruido en los canales de grabación. A continuación, verifique que la rampa de temperatura de la ejecución de GC sea correcta.

En este ejemplo, la temperatura comienza a 50 grados centígrados durante cuatro minutos y luego aumenta 10 grados por minuto hasta una temperatura final de 220 grados centígrados, o se mantiene durante seis minutos. Cuando las formas de onda de las unidades en los canales de grabación se han vuelto consistentes, las grabaciones neuronales se consideran estables. Una vez estabilizada, cargue la jeringa con el olor floral del espacio de cabeza e inyecte el olor en el puerto de inyección de cabeza del gc.

A continuación, comience a grabar inmediatamente desde los electrodos una vez finalizada la ejecución de GC. Deje reposar la preparación de cinco a 15 minutos. A continuación, inyecte otra muestra en el GC o estimule la preparación utilizando compuestos volátiles individuales o mezclas de compuestos.

Si en algún momento la actividad espontánea se detiene o cambia repentinamente, revise el goteo de solución salina y deje reposar la preparación durante 15 minutos. Luego, si la actividad no recupera su nivel anterior, descarta la preparación. Después del experimento, fije el cerebro con las sondas aún en el tejido, luego extirpe el cerebro, limpie el fijador y deshidrate el cerebro.

Las ubicaciones de los canales de grabación se pueden identificar mediante microscopía confocal a partir del aroma floral mimus Luci. El número total de volátiles que están saqueando. El GC suele estar entre 60 y 70 compuestos.

El aroma de Mimus Luci se compone predominantemente de monoterpenoides, como la beta miosina y la alfa pinina. El resto del aroma está compuesto por seis carbonos volátiles. Se estimularon varias preparaciones con tres microlitros del extracto de ojos de Mimus Lewis.

Esta grabación de una de las ocho unidades neuronales registradas por el electrodo multicanal muestra cómo una neurona selectiva compite con volátiles específicos. En este ejemplo, dine es el compuesto que se muestra. Estas son las respuestas de ocho unidades neuronales.

Aproximadamente la mitad del conjunto no respondía. Esto es sorprendente dada la diversidad de compuestos volátiles aludidos desde el espacio floral de cabeza, pero esto es consistente entre las preparaciones y es reportado por otros estudios. La velocidad de disparo normalizada de las unidades sensibles muestra que existe una fuerte selectividad para un grupo de odorantes.

Los odorantes resaltados por las flechas provocaron las respuestas más robustas. Se trata de la demine y la trans beta osain. Entonces, después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar su insecto para el experimento y luego realizar el experimento utilizando cromatografía de gases con grabación multicanal.

El objetivo entonces es identificar odorantes putativos conductualmente efectivos en un ramo complejo. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos o tres horas si se hace correctamente siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como las pruebas de comportamiento con los odorantes identificados, para determinar completamente la eficacia de los volátiles en la mediación de la respuesta conductual del insecto.