Un alto contenido de imágenes de flujo de trabajo para estudiar Grb2 complejos de señalización por clonación de expresión

El objetivo general del siguiente experimento es identificar los socios de interacción de Grab Two mediante la clonación de la expresión de CD NA y la observación de cambios en la proteína verde fluorescente marcada con Grab Two. Esto se logra preparando primero una biblioteca de CD NA a partir de lisados bacterianos como segundo paso. Los CDNAs se transfectan en células de riñón embrionario humano, lo que dará lugar a la expresión de la construcción reportera junto con los genes de interés.

A continuación, se analizan las placas transfectadas en el microscopio opera con el fin de visualizar los cambios en la localización de agarre dos a lo largo de las células, se obtienen resultados que muestran el reclutamiento mediado por el receptor del factor de crecimiento epidérmico de GFP marcado. Agarre dos a endosomas según la microscopía de fluorescencia. La principal ventaja de esta técnica en comparación con los métodos existentes, como estos dos híbridos, es que los compañeros de interacción de agarra dos se pueden identificar en una situación fisiológica que tiene en cuenta la distribución subcelular de los socios de interacción.

Bueno, sin embargo, este método se puede usar para identificar la transducción de señales por Grab dos. También se puede aplicar a otros sistemas como otras proteínas de interés. La biblioteca CDNA se proporciona con clones bacterianos únicos en stocks de glicerol.

En un formato de 96 pocillos usando el comando re ray en el menú selector de la luz de selección Hudson Rapid. Elija clones bacterianos de la placa de origen e inocule en 1,5 mililitros lb amp en una placa de 96 pocillos de profundidad. Sellar tardíamente las placas de pozos profundos con un sello permeable al gas e incubar durante la noche a 37 grados centígrados en un agitador Al día siguiente, gire las placas de pozos profundos que contienen las bacterias A 2000 RPM durante 20 minutos.

Usando adaptadores de placa en una centrífuga de mesa, aspire los medios de los pocillos dejando intacta la pastilla bacteriana. A continuación, configure la plataforma de la estación de trabajo Tecan Freedom Evo Automation como se muestra aquí. Distribuya las soluciones para la preparación de plásmidos en los comederos del uno al cinco y coloque una placa de pocillo profundo en la cubierta.

Coloque un canal de pocillos múltiples con solución aluiana adyacente a las puntas de carga de la placa de pozo profundo en los estantes de puntas. Ensamble el colector de vacío. La placa de unión de plásmidos se coloca dentro del colector y la placa de filtro de plásmidos se coloca encima de los gránulos de suspensión Resus del colector con 250 microlitros de solución uno.

El amortiguador de suspensión Resus mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Asegurarse de que los gránulos se resuspendan por completo es fundamental para el éxito de este procedimiento. Se puede usar un agitador si una caricia, hacia arriba y hacia abajo, no resuspende el pellet por completo.

Una vez que los gránulos están completamente resuspendidos, las bacterias se colocan agregando 250 microlitros de solución al tampón de lisis. Selle la placa e inviértala para permitir una mezcla completa. Pon un temporizador para dos minutos.

A continuación, agregue 350 microlitros de la solución tres. El tampón de neutralización. Selle la placa e invierta tres veces las líneas.

Transfiera los lisados bacterianos a las placas de filtro de plásmidos. Aplique la aspiradora durante cinco minutos. Retire la placa del filtro y coloque la placa de unión en la parte superior del colector.

Aplique la aspiradora durante un minuto. Agregue 500 microlitros de tampón de lavado adicional y aplique vacío durante dos minutos. Agregue 900 microlitros de solución tampón de lavado cuatro y aplique vacío durante dos minutos.

Después de eso, agregue 900 microlitros de solución tampón de lavado cuatro nuevamente y aplique vacío durante 15 minutos. Coloque la placa colectora de ADN dentro del colector. Añadir 100 microlitros de tampón Elucian a la placa de unión e incubar durante dos minutos.

Aplique la aspiradora durante 10 minutos. Por último, retire la placa de recogida y mida la concentración de ADN con el NanoDrop 8, 000. Por lo general, se puede esperar un rendimiento de aproximadamente 100 nanogramos por microlitro con este método para comenzar este procedimiento.

Después de hec 2 9 3 células se tripegan, se inizan y se cuentan. Use un dispensador automático para dispensar dos veces 10 a las cuatro celdas en cada pocillo de un Perkin Elmer. Las células de incubación de la placa durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono para la transfección.

Utilice el manipulador de líquidos automatizado para preparar la siguiente mezcla en cada pocillo de un fondo redondo de 96, placa de pocillo de 100 nanogramos de GFP. Toma dos plásmidos de ADN con 100 nanogramos de CD NA en 25 microlitros de medio libre de suero. A continuación, agregue 25 microlitros de medios libres de suero que contengan 0,5 microlitros transfect en la mezcla por pocillo e inicie el temporizador durante 30 minutos.

Después de 30 minutos, transfiera 50 microlitros en el CDNA transfect en mezcla a las células. Usando un método de dispensación suave. Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Para comenzar la adquisición de imágenes, inicie el software opera. Seleccione la pestaña de configuración y seleccione el objetivo de 20 veces y el tipo de placa correcto. Asegúrese de que el collar esté ajustado al valor correcto en el objetivo para permitir el enfoque con diferentes tipos de placas.

A continuación, seleccione la pestaña Microscopio. Defina la exposición uno como láser fite 4 88 y la exposición dos como láser UV 365. Active el filtro UV en ambas exposiciones y asigne exposición.

Uno a la cámara, uno y la exposición. Dos a la cámara dos. Establezca los tiempos de exposición en 800 milisegundos para la exposición, uno y 40 milisegundos para la exposición.

Dos, seleccione la exposición, una establezca la altura de enfoque en cero micras. Seleccione el enfoque una vez que esté enfocado. Exponga la cámara uno.

Ajusta la altura de enfoque para optimizar el plano de exposición y haz clic en tomar altura. Guarde los parámetros de exposición, repita para la exposición. Dos, seleccione la pestaña de definición de experimento, crear diseño y subdiseño.

Arrastre y suelte el diseño, la exposición, la imagen de referencia, el sesgo, el archivo de recorte y el subdiseño relevantes. Guarde el experimento. Seleccione la pestaña de experimento automático y adquiera imágenes en condiciones normales.

El agarre dos se localiza en toda la celda. Tras la estimulación de un receptor del factor de crecimiento, se transloca a la membrana plasmática y posteriormente se internaliza en los endosomas. En esta figura, el panel superior muestra seis células de CO M que se transfectaron transitoriamente con GFP agarra dos y, como se esperaba, la fluorescencia se distribuye por toda la célula.

Sin embargo, en las células transfectadas transitoriamente con GFP, agarra dos más el receptor de superficie celular IT EGFR agarra dos se reubica en estructuras similares a endosomas como se muestra en el panel inferior. Por lo tanto, cuando se aplica una biblioteca de genoma amplio, se puede esperar que se puedan identificar nuevas proteínas de superficie celular de unión a dos agarras. Este método no se limita a la detección de proteínas de la superficie celular.

Por ejemplo, la DYNAMIN dos de la GPA, que está involucrada en la endocitosis mediada por el agarre dos, induce una translocación del agarre dos. En este experimento, la cuchara GFP dos se transfectó con DNM dos en células T HEC 2 93. La reubicación de GFP agarra dos a estructuras similares a endosomas se ilustra mediante las células dentro de los círculos rojos.

Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como la inmunoprecipitación o los ensayos bioquímicos, para responder a otras preguntas, como si la interacción es directa o indirecta. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar la clonación de expresión para identificar las interacciones de las proteínas subcelulares.