Un alto contenido de imágenes de flujo de trabajo para estudiar Grb2 complejos de señalización por clonación de expresión

El objetivo general del siguiente experimento es identificar los factores de interacción de Grab dos mediante clonación por expresión de ARNc y observación de los cambios en la proteína verde fluorescente marcada con Grab dos. Esto se logra primero preparando una biblioteca de ARNc a partir de lisados bacterianos como segundo paso. Los ARNc se transfectan en células de riñón embrionario humano, lo que dará lugar a la expresión del constructo reportero junto con los genes de interés.

A continuación, las placas transfectadas se analizan en el microscopio opera con el fin de visualizar los cambios en la localización de grab dos en toda la célula. Los resultados obtenidos muestran el reclutamiento mediado por el receptor del factor de crecimiento epidérmico de grab dos marcado con GFP hacia los endosomas, según se observa mediante microscopía de fluorescencia. La principal ventaja de esta técnica en comparación con métodos existentes como el sistema de dos híbridos es que permite identificar los factores de interacción de grab dos en una situación fisiológica que tenga en cuenta la distribución subcelular de dichos factores de interacción.

Aunque este método puede utilizarse para identificar la transducción de señales mediante Grab dos, también puede aplicarse a otros sistemas, como otras proteínas de interés. La biblioteca de ADNc se proporciona en clones bacterianos individuales en stocks de glicerol.

En formato de placa de 96 pocillos, utilizando el comando re ray en el menú de selección del Hudson Rapid pick light. Seleccione clones bacterianos desde la placa fuente e inocúlelos en 1,5 mililitros de LB con ampicilina en una placa de 96 pocillos profundos. Selle herméticamente las placas de pocillos profundos con un sello permeable al gas e incube durante la noche a 37 grados Celsius en un agitador. Al día siguiente, centrifugue las placas de pocillos profundos que contienen las bacterias a 2000 RPM durante 20 minutos.

Utilizando adaptadores para placas en una centrífuga de sobremesa, aspire el medio de los pocillos dejando el pellet bacteriano intacto. A continuación, configure la plataforma de la estación de trabajo automatizada Tecan Freedom Evo tal como se muestra aquí. Distribuya las soluciones para la preparación de plásmidos en las cubetas uno a cinco y coloque una placa de pocillos profundos en la plataforma.

Coloque un recipiente multipozo con solución de alucian adyacente a la placa de pozos profundos; cargue las puntas en los estantes para puntas. Monte el manifold de vacío. Coloque la placa de unión de plásmidos dentro del manifold y coloque la placa de filtro de plásmidos encima del manifold. Re_suspenda los pellet con 250 microlitros de la solución uno.

El tampón de suspensión Resus mediante pipeteo ascendente y descendente. Es fundamental asegurarse de que los pellet se resuspendan completamente para el éxito de este procedimiento. Puede utilizarse un agitador si el pipeteo ascendente y descendente no resuspende completamente el pellet.

Una vez que los pellet estén completamente resuspendidos, coloque las bacterias añadiendo 250 microlitros de solución al tampón de lisis. Selle la placa e inviértala para permitir una mezcla completa. Configure un temporizador durante dos minutos.

A continuación, agregue 350 microlitros de la solución tres, el tampón de neutralización. Selle la placa e inviértala tres veces.

Transfiera los lisados bacterianos a las placas de filtro para plásmidos. Aplique vacío durante cinco minutos. Retire la placa de filtro y coloque la placa de unión encima del manifold.

Aplique vacío durante un minuto. Añada 500 microlitros de tampón de lavado adicional y aplique vacío durante dos minutos. Añada 900 microlitros de la solución de lavado cuatro y aplique vacío durante dos minutos.

Después de eso, agregue 900 microlitros de la solución de lavado cuatro nuevamente y aplique vacío durante 15 minutos. Coloque la placa de recolección de ADN dentro del manifold. Añada 100 microlitros de tampón Elucian a la placa de unión e incube durante dos minutos.

Aplique vacío durante 10 minutos. Finalmente, retire la placa de recolección y mida la concentración de ADN utilizando el NanoDrop 8,000. Típicamente, se puede esperar un rendimiento de aproximadamente 100 nanogramos por microlitro con este método para comenzar este procedimiento.

Después de que las células HEK 293 se tripsinizan y se cuentan, use un dispensador automatizado para dispensar dos veces 10 a la cuatro células en cada pocillo de una placa Perkin Elmer. Incube las células durante la noche a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono para la transfección.

Utilice el manipulador automático de líquidos para preparar la siguiente mezcla en cada pocillo de una placa de fondo redondo de 96 pocillos: 100 nanogramos de GFP. Agregue dos plásmidos de ADN con 100 nanogramos de ADN CD en 25 microlitros de medio libre de suero. A continuación, añada 25 microlitros de medio libre de suero que contenga 0,5 microlitros de transfectina por pocillo, y active el temporizador durante 30 minutos.

Después de 30 minutos, transfiera 50 microlitros de la mezcla de transfección de ADNc a las células. Utilice un método de dispensación suave. Incube las células durante la noche a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.

Para comenzar la adquisición de imágenes, inicie el software opera. Seleccione la pestaña de configuración y elija el objetivo de 20 aumentos y el tipo de placa correcto. Asegúrese de que el collar esté ajustado al valor correcto en el objetivo para permitir el enfoque con diferentes tipos de placa.

A continuación, seleccione la pestaña del microscopio. Defina la exposición uno como láser fite 4 88 y la exposición dos como láser UV 365. Active el filtro UV en ambas exposiciones y asigne la exposición.

Uno a la cámara uno y exposición. Dos a la cámara dos. Establezca los tiempos de exposición en 800 milisegundos para la exposición uno y 40 milisegundos para la exposición.

Dos, seleccione exposición, ajuste la altura de enfoque a cero micrómetros. Seleccione enfoque una vez enfocado. Exponga la cámara uno.

Ajuste la altura del enfoque para optimizar el plano de exposición y haga clic en tomar altura. Guarde los parámetros de exposición, repita para la exposición. Dos, seleccione la pestaña de definición del experimento, cree la distribución y la subdistribución.

Arrastre y suelte el diseño relevante, exposición, imagen de referencia, archivo de corrección de inclinación, archivo de recorte y subdiseño. Guarde el experimento. Seleccione la pestaña de experimento automático y adquiera imágenes en condiciones normales.

Grab dos está localizado en toda la célula. Tras la estimulación de un receptor de factor de crecimiento, se transloca hacia la membrana plasmática y posteriormente se internaliza en endosomas. En esta figura, el panel superior muestra células CO M seis que fueron transfectadas temporalmente con GFP-Grab dos, y como era de esperar, la fluorescencia se distribuye en toda la célula.

Sin embargo, en células transfectadas transitoriamente con GFP GRAB2, el receptor de superficie celular IT EGFR GRAB2 se reubica a estructuras similares a endosomas, como se muestra en el panel inferior. Por lo tanto, al aplicar una biblioteca de genoma completo, se puede esperar que se identifiquen nuevas proteínas de superficie celular que se unan a GRAB2. Este método no se limita a la detección de proteínas de superficie celular.

Por ejemplo, la proteína DYNAMIN dos de GPA, que participa en la endocitosis mediada por grab dos, induce una translocación de grab dos. En este experimento, se realizaron transfecciones conjuntas de grab dos-GFP con DNM dos en células HEC 293 T. La reubicación de grab dos-GFP hacia estructuras similares a endosomas se ilustra mediante las células dentro de los círculos rojos.

Tras seguir este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos como la inmunoprecipitación o ensayos bioquímicos para responder preguntas adicionales, como si la interacción es directa o indirecta. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar el clonado por expresión para identificar interacciones proteicas subcelulares.