Name: Realizar el lavado de la vagina, tinción de cristal violeta y Evaluación citológica vaginal para ratón Celo identificación Staging Ciclo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprende a identificar las etapas del ciclo estral en ratones mediante citología vaginal no invasiva con tinción de cristal violeta. Este método permite evaluar cambios hormonales en biología reproductiva.

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Nos gustaría dar las gracias a Marc Leonard de Carleton Immersive Media Studio expertos para la asistencia técnica en la producción y edición de video y el Dr. Martin Bertrand de Carleton Immersive Media Studio / Laboratorio de Regeneración Neural de asistencia modelo visual. Los autores agradecen el asesoramiento de la Dra. Marilyn Keaney y todo su personal especializado en la Universidad de Ottawa y Cuidado de Animales Servicios Veterinarios. Este trabajo fue financiado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud (CIHR, RP 62826) para SALB, el Instituto de Envejecimiento y CIHR Iniciativa para la Formación Estratégica de Investigación de la Salud / Programa de Formación en CIHR lipidomics Neurodegenerativas (TGF 96121) para SALB y SF, Fundación Canadiense de Innovación a SF, Ontario Innovation Trust a SF, y Autodesk investigación a la ciencia ficción. ACM recibe un CIHR Banting y Best premio doctoral. NV recibe una beca post-profesional del Instituto de Mayores y el Programa de Capacitación en CIHR lipidomics neurodegenerativas.

1. Preparación de Reactivos <ol><li> Para el lavado vaginal estéril, autoclave agua doblemente destilada (DDH 2 O) y guárdela en un recipiente herméticamente cerrado, a temperatura ambiente hasta que se necesite. </li><li> Para la evaluación citológica, añadir 0,1 g de polvo de cristal violeta a 100 ml de ddH 2 O. Mezclar bien. Tinción de cristal violeta (0,1%) se puede almacenar en un recipiente herméticamente cerrado a temperatura ambiente hasta que se necesite. </li></ol> 2. Recolección de células vaginales (lavado vaginal) <ol><li> Colocar una bombilla de látex en el extremo de una punta estéril 200 l y elaborar aproximadamente 100 l de ddH 2 O estéril utilizando las gradaciones en la punta como una guía volumen. </li><li> Levante el ratón fuera de su jaula y coloque la jaula en la tolva (tapa) con su extremo trasero / trasero hacia usted. </li><li> Sujete firmemente la cola y elevar el extremo posterior. El ratón tendrá ahora sólo sus patas delanteras prensiles la tolva. En este punto, el ratón puede orinar. Si es así, Espere hasta que deje de orinar. ¿Debería haber orina que queda en la entrada del canal vaginal, es posible que desee aclarar la abertura con el exceso de O 2 ddH usando una punta diferente (es decir, no con la punta de recogida de muestras). </li><li> Coloque el extremo de la ddH 2 O llena de punta en la abertura del canal vaginal, teniendo cuidado de no penetrar en el orificio vaginal como (y cervical) estimulación puede inducir pseudopreñez en ratas 1,2. Los informes recientes sugieren que los ratones son menos susceptibles a este efecto, sin embargo se debe tener cuidado para reducir al mínimo el grado de invasividad en análisis repetidos 3. </li><li> Presione suavemente la bombilla para expulsar un cuarto a la mitad del volumen de agua (~ 25-50 l) en la apertura del canal vaginal. El líquido aspirado de forma espontánea en el canal sin la punta de inserción. Lentamente libere la presión ejercida sobre el bulbo. El fluido se retire de nuevo en la punta. Evite liberación de presión demasiado rápido para evitar la aspiración de líquidoen el bulbo. Una punta filtrada puede ser útil para este propósito. </li><li> Repetir los tiempos de las etapas anteriores 4-5 utilizando la misma punta, bulbo, y el líquido para obtener un número suficiente de células en una sola muestra. </li><li> Coloque el fluido sobre portaobjetos de vidrio, y permitir que el frotis se seque por completo a temperatura ambiente. Una vez seca, estos frotis estrales puede teñir inmediatamente o almacenarse y se tiñeron en una fecha posterior. </li></ol> 3. Tinción citológica utilizando Crystal Violet * 4 <ol><li> Colocar el portaobjetos en seco en un vaso de Coplin (u otro recipiente de tinción comparable) que contiene el colorante cristal violeta durante 1 min. </li><li> Retirar a un segundo vaso de Coplin que contiene ddH 2 O. Lave el portaobjetos con ddH 2 O durante 1 min. Repetir. </li><li> Retire el exceso ddH 2 O de los bordes de la diapositiva con un limpiador de tejidos ligeros, evitando el contacto con la tinción. </li><li> Pipetear aproximadamente 15 l de glicerol en la parte superior de la tinción y la taparesbale. Alternativamente, otros reactivos histológicos de montaje pueden ser utilizados para obtener un más permanente, no difusora mancha. </li></ol> * El método de tinción descrito aquí es el procedimiento más simple que puede realizarse en cualquier laboratorio. Otros métodos pueden proporcionar detalles adicionales. Por ejemplo, mediante la tinción de Papanicolaou, la madurez de las células epiteliales nucleadas se pueden distinguir con células menos maduras maduras células teñidas de color turquesa y más rosa o anaranjado-teñidas. Estas diferencias se pueden utilizar para la etapa proestro temprano o tardío. 4 4. Citología Vaginal <ol><li> Examinar el frotis al microscopio óptico para determinar los tipos de células presentes. El examen microscópico se debe hacer inmediatamente después de la tinción de cristal violeta como se difundirá a partir de las células con el tiempo cuando se usa glicerol para cubreobjetos. Las microfotografías deben tomarse en el momento de análisis para documentar la citología. </li><li> Comience por examinar la entire frotis con un aumento menor. Seleccione un área representativa y pasar a un mayor aumento. Verá cornificación células epiteliales escamosas, leucocitos, y / o células epiteliales nucleadas (resultados representativos, la figura 1A-C). La proporción de células presentes le permitirá determinar la etapa de estro de su ratón en el momento de la toma de muestras (resultados representativos, Figura G-1D) y su estado hormonal inmediata (discusión, Figura 2). </li></ol> 5. Los resultados representativos Citología: Tres tipos de células primarias pueden ser detectados en muestras de frotis vaginales: (1) células nucleadas epiteliales (Figura 1A), (2) cornificación células epiteliales escamosas (Figura 1B), y (3) los leucocitos (Figura 1C). Nucleados células epiteliales tienen un citoplasma ligeramente manchado, manchado oscuro membrana plasmática, y un núcleo oval ( <strong&gt; Figura 1A). Cornified células epiteliales escamosas son uniformemente manchado, más de forma poligonal que sus predecesores epiteliales nucleadas, y carecen de un núcleo (Figura 1B). Los leucocitos polimorfonucleares se pueden distinguir de las células epiteliales por su forma irregular, núcleos polimórfico oscuro manchado, y el pequeño tamaño (Figura 1C, las flechas negras). En caso de contaminación de la orina estar presente en el frotis, cristales de ácido úrico se detectan fácilmente por sus estructuras cristalinas diferentes a cualquier tipo de celda esperados (Figura 3). Si esto ocurre, y la detección oscura de tipo celular predominante, la prueba debe ser desechado y no se utiliza para fines de estadificación. Montaje: La proporción relativa de los tipos de células observadas en frotis se puede utilizar para identificar la fase del ciclo estral de su ratón en el día de la recogida de muestras (Figura 1D-G). Durante el proestro, las células son casi exclusivamenteracimos de vuelta, bien formado nucleados células epiteliales (Figura 1D, célula representativa indicada por la flecha blanca). Durante el estro, las células son predominantemente cornificación células epiteliales escamosas, presentes en racimos compactados (Figura 1E, célula representante indicado por punta de flecha). Durante metaestro, pequeñas leucocitos oscuramente teñidos predominan (Figura 1F, célula representativa indicada por la flecha negro). Cornified células epiteliales escamosas se puede observar, a menudo en fragmentos, (Figura 1F, célula representativa indicada por negro punta de flecha). Durante el diestro, raras cornificadas células epiteliales escamosas puede aún estar presente (Figura 1G, célula representativa indicada por negro punta de flecha), sin embargo aún predominan los leucocitos (Figura 1G, célula representativa indicada por la flecha negro). Metaestro puede distinguirse de diestro por la aparición de células epiteliales nucleadas en diestro ( <stron<html> g&gt; Figura 1G, célula representativa indicada por la flecha blanca). <img src="/files/ftp_upload/4389/4389fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Evaluación citológico de frotis vaginal puede ser utilizado para identificar la etapa estral tres principales tipos de células se detectan en muestras de frotis vaginales:. (A) las células epiteliales nucleadas, (B) cornificadas células epiteliales escamosas, y leucocitos (C). La proporción de estos tipos de células presentes en el frotis se puede utilizar para identificar en ratones (D) proestro, (E) estro, (F) metaestro, o diestro (G) como se describe en los resultados representativos. Puntas de flecha negras en E, F y G a punto representativos cornificadas células epiteliales escamosas. Las flechas negras en C, F y G a punto leykocytes representativas. Las flechas blancas en D y G representante más destacado nucleados células epiteliales. . Jpg &quot;alt =&quot; Figura 2 &quot;/&gt; Figura 2. Citología vaginal smear refleja hechos subyacentes endocrinos. Detalles se proporcionan también en discusión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4389/4389fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img src="/files/ftp_upload/4389/4389fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Cristales de ácido úrico puede estar presente siguiente de tinción de cristal violeta de orina contaminados-muestras. (A) los cristales son transparentes y pueden ser de varios tamaños (flechas y la región en caja magnificados en (B)). No hay células están presentes en este campo. En caso de contaminación úrico cristales de ácido dentro de los campos utilizados para la tinción citológica estar presente, puede ser difícil identificar con precisión los tipos de células presentes y el frotis debe ser desechado. Las barras de escala = 50 micras.

<ol><li>Adler, N. T., Zoloth, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copulatory+behavior+can+inhibit+pregnancy+in+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Copulatory behavior can inhibit pregnancy in female rats.</a> Science. 168, 1480-1482 (1970).</li>
<li>Adler, N. T., Resko, J. A., Goy, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+copulatory+behavior+on+hormonal+change+in+the+female+rat+prior+to+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">The effect of copulatory behavior on hormonal change in the female rat prior to implantation.</a> Physiology. 5, 1003-1007 (1970).</li>
<li>Yang, J. J., Larsen, C. M., Grattan, D. R., Erskine, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mating-induced+neuroendocrine+responses+during+pseudopregnancy+in+the+female+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Mating-induced neuroendocrine responses during pseudopregnancy in the female mouse.</a> Journal of. 21, 30-39 (2009).</li>
<li>Hong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+mouse+estrus+cycle+in+response+to+BRCA1+inactivation+suggest+a+potential+link+between+risk+factors+for+familial+and+sporadic+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Changes in the mouse estrus cycle in response to BRCA1 inactivation suggest a potential link between risk factors for familial and sporadic ovarian cancer.</a> Cancer research. 70, 221-228 (2010).</li>
<li>Hawkins, S. M., Matzuk, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+menstrual+cycle%3A+basic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The menstrual cycle: basic biology.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1135, 10-18 (2008).</li>
<li>Walmer, D. K., Wrona, M. A., Hughes, C. L., Nelson, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactoferrin+expression+in+the+mouse+reproductive+tract+during+the+natural+estrous+cycle%3A+correlation+with+circulating+estradiol+and+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Lactoferrin expression in the mouse reproductive tract during the natural estrous cycle: correlation with circulating estradiol and progesterone.</a> Endocrinology. 131, 1458-1466 (1992).</li>
<li>Parkening, T. A., Collins, T. J., Smith, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+and+pituitary+concentrations+of+LH%2C+FSH%2C+and+prolactin+in+aging+C57BL%2F6+mice+at+various+times+of+the+estrous+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+aging%22%5BJournal%5D)">Plasma and pituitary concentrations of LH, FSH, and prolactin in aging C57BL/6 mice at various times of the estrous cycle.</a> Neurobiology of aging. 3, 31-35 (1982).</li>
<li>Sarkar, D. K., Chiappa, S. A., Fink, G., Sherwood, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotropin-releasing+hormone+surge+in+pro-oestrous+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gonadotropin-releasing hormone surge in pro-oestrous rats.</a> Nature. 264, 461-463 (1976).</li>
<li>Rajendren, G., Gibson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+confocal+microscopic+study+of+synaptic+inputs+to+gonadotropin-releasing+hormone+cells+in+mouse+brain%3A+regional+differences+and+enhancement+by+estrogen%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">A confocal microscopic study of synaptic inputs to gonadotropin-releasing hormone cells in mouse brain: regional differences and enhancement by estrogen.</a> Neuroendocrinology. 73, 84-90 (2001).</li>
<li>Kumar, T. R., Wang, Y., Lu, N., Matzuk, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicle+stimulating+hormone+is+required+for+ovarian+follicle+maturation+but+not+male+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Follicle stimulating hormone is required for ovarian follicle maturation but not male fertility.</a> Nature. 15, 201-204 (1997).</li>
<li>Montgomery, V., Loutradis, D., Tulchinsky, D., Kiessling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FSH-induced+ovulation+in+intact+and+hypophysectomized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+reproduction+and+fertility%22%5BJournal%5D)">FSH-induced ovulation in intact and hypophysectomized mice.</a> Journal of reproduction and fertility. 84, 1-6 (1988).</li>
<li>Mihm, M., Gangooly, S., Muttukrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+normal+menstrual+cycle+in+women%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+reproduction+science%22%5BJournal%5D)">The normal menstrual cycle in women.</a> Animal reproduction science. , 124-229 (2011).</li>
<li>Appelgren, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+demonstration+of+drug+interference+with+progesterone+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+reproduction+and%22%5BJournal%5D)">Histochemical demonstration of drug interference with progesterone synthesis.</a> Journal of reproduction and. 19, 185-186 (1969).</li>
<li>Sander, V. A., Facorro, G. B., Piehl, L., de Celis Rubin, E., Motta, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+DHEA+and+metformin+on+corpus+luteum+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of DHEA and metformin on corpus luteum in mice.</a> Reproduction. 138, 571-579 (2009).</li>
<li>Stocco, C., Telleria, C., Gibori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+control+of+corpus+luteum+formation%2C+function%2C+and+regression%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+reviews%22%5BJournal%5D)">The molecular control of corpus luteum formation, function, and regression.</a> Endocrine reviews. 28, 117-149 (2007).</li>
<li>Rudolph, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+overt+menstruation+in+intact+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Induction of overt menstruation in intact mice.</a> PLoS One. 7, e32922(2012).</li>
<li>Yano, J., Lilly, E., Barousse, M., Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell-derived+S100+calcium-binding+proteins+as+key+mediators+in+the+hallmark+acute+neutrophil+response+during+Candida+vaginitis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell-derived S100 calcium-binding proteins as key mediators in the hallmark acute neutrophil response during Candida vaginitis.</a> Infection and immunity. 78, 5126-5137 (2010).</li>
<li>Whitten, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+anoestrus+in+mice+caged+in+groups%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+endocrinology%22%5BJournal%5D)">Occurrence of anoestrus in mice caged in groups.</a> The Journal of endocrinology. 18, 102-107 (1959).</li>
<li>Lamond, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+stimulation+derived+from+other+animals+of+the+same+species+on+oestrous+cycles+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+endocrinology%22%5BJournal%5D)">Effect of stimulation derived from other animals of the same species on oestrous cycles in mice.</a> The Journal of endocrinology. 18, 343-349 (1959).</li>
<li>Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+longitudinal+study+of+estrous+cyclicity+in+aging+C57BL%2F6J+mice%3A+I.+Cycle+frequency%2C+length+and+vaginal+cytology%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+reproduction%22%5BJournal%5D)">A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology.</a> Biology of reproduction. 27, 327-339 (1982).</li>
<li>Felicio, L. S., Nelson, J. F., Finch, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+studies+of+estrous+cyclicity+in+aging+C57BL%2F6J+mice%3A+II.+Cessation+of+cyclicity+and+the+duration+of+persistent+vaginal+cornification%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+reproduction%22%5BJournal%5D)">Longitudinal studies of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: II. Cessation of cyclicity and the duration of persistent vaginal cornification.</a> Biology of reproduction. 31, 446-453 (1984).</li>
<li>Van Der Lee, S., Boot, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+pseudopregnancy+in+mice.+II%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+physiologica+et+pharmacologica+Neerlandica%22%5BJournal%5D)">Spontaneous pseudopregnancy in mice. II.</a> Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 5, 213-215 (1956).</li>
<li>Van Der Lee, S., Boot, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+pseudopregnancy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+physiologica+et+pharmacologica+Neerlandica%22%5BJournal%5D)">Spontaneous pseudopregnancy in mice.</a> Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 4, 442-444 (1955).</li>
<li>Armaiz-Pena, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrous+cycle+modulates+ovarian+carcinoma+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+cancer+research+%3A+an+official+journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Estrous cycle modulates ovarian carcinoma growth.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 15, 2971-2978 (2009).</li>
<li>Jemiolo, B., Harvey, S., Novotny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+the+Whitten+effect+in+female+mice+by+synthetic+analogs+of+male+urinary+constituents%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Promotion of the Whitten effect in female mice by synthetic analogs of male urinary constituents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4576-4579 (1986).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las normas y reglamentos establecidos por la Universidad de Ottawa Animal Care Comité y el Consejo Canadiense de Protección de los Animales.

Estos cambios en la tipología de células son indicativos de eventos endocrinos subyacentes. La fase proestro del ciclo estral se corresponde con la fase folicular humano del ciclo menstrual y 5 se define por un aumento preovulatorio en circulante 17-β-estradiol niveles 6, así como un aumento pequeño en la prolactina 7 (Figura 2, proestro, panel izquierdo). El aumento de 17-β-estradiol estimula indirectamente liberadora de gonadotropina hormona de neuronas en el hipotálamo y el septo que, a su vez, activan las células sensibles en la pituitaria anterior para liberar hormona luteinizante y hormona estimulante del folículo en la circulación 8,9 (Figura 2 , Proestro, panel izquierdo). En los frotis vaginales obtenidas de los animales en proestro, las células son casi exclusivamente ovales células nucleadas epiteliales (Figura 1D, la figura 2, el proestro, panel derecho). El pico en horm estimulante del folículouna ovulación y los niveles de las señales de entrada en estro 10,11. Durante el estro, 17-β-estradiol disminuyen los niveles de los niveles de prolactina y pico de 6,7 (Figura 2, estro, panel izquierdo). Frotis vaginales se caracterizan por detección casi exclusivo de forma irregular cornificadas células epiteliales escamosas a menudo en grupos (Figura 1E, la Figura 2, el estro, panel derecho). Entrada en metaestro coincide con un aumento continuo en los niveles de hormonas progesterona y 6 se corresponde con el inicio de la fase lútea humano 12 (Figura 2, metaestro, panel izquierdo). Como los niveles de progesterona comienzan a aumentar y hay un aumento pequeño en el 17-β-estradiol los niveles en respuesta a la activación del cuerpo lúteo 6,13,14 (Figura 2, metaestro, panel izquierdo). Los tipos de células presentes en los frotis vaginales durante esta etapa son células fragmentadas, cornificadas epiteliales y leucocitos más pequeñas más oscuras manchadas (Figure 1F, la figura 2, metaestro, panel derecho). Por último, la entrada en el diestro en ratones se produce y los niveles circulantes de progesterona pico 6, correspondiente a la fase lútea tardía humano 12. Regresión del cuerpo lúteo conduce a una posterior disminución brusca en los niveles de progesterona 15,16 (Figura 2, Diestro, panel izquierdo). Los leucocitos predominan en los frotis durante el diestro. La frecuencia de células epiteliales cornificadas y nucleadas se reduce células epiteliales empiezan a ser detectados justo antes de la transición a la proestro (Figura 1G, la Figura 2, diestro, panel derecho). En resumen, este protocolo simple rutina puede ser utilizada para estimar las fluctuaciones hormonales diarias y establecer etapa estral en ratones experimentales sin alterar el estado reproductivo si las toman las siguientes precauciones. El muestreo se debe realizar no más de una vez al día usando el protocolo no invasivo described aquí, en comparación con la penetración repetida de la cavidad vaginal, la aspiración y la agitación. Esto puede causar irritación vaginal resulta en una 17 respuesta inflamatoria resultante en leucocitos y otros tipos de células para estar presentes en los frotis que pueden confundir la evaluación citológica. Además, incluso en colonias alojadas las mujeres, es normal ver a diestro prolongados y fases de estro en ratones diferentes como la inducción y de anestro 18 y esta identificación es útil en la interpretación de impacto hormonal en la salud reproductiva, género y estudios de enfermedades. La variabilidad en la duración del ciclo también se introduce con la edad y por las diferencias de vivienda en colonias (individual o en grupo de viviendas-) de las hembras 7,19-21. Hembras alojadas en femenino-colonias sólo puede dejar la bicicleta y entrar en un estado de prolongada diestro 18,22,23 aunque la bicicleta puede ser restablecida por la exposición a las jaulas pretratados con orina masculino para obtener 24,25 bicicleta. Por lo tanto, para establecer individual longitudes de ciclo para un ratón dado, se recomienda que las evaluaciones no invasivos descritos aquí puede realizar diariamente, con cuidado, hasta dos ciclos completos se observan.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Catálogo # </td></tr><tr><td> Puntas de pipeta estériles 200 mu l </td><td> DiaMed </td><td> E340901 </td></tr><tr><td> Pera de látex (1 ml) </td><td> Pescador </td><td> 03-488-21 </td></tr><tr><td> Portaobjetos de vidrio </td><td> Pescador </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> Crystal Violet mancha (25 g) </td><td> Pescador </td><td> C581-25 </td></tr><tr><td> Trabajo liviano Limpiaparabrisas tejido </td><td> VWR </td><td> 82003-820 </td></tr><tr><td> Glicerol </td><td> Pescador </td><td> BP229-1 </td></tr><tr><td> Microscopio Glass Cover (22x30) </td><td> Pescador </td><td> 12-544A </td></tr></tbody></table>

realizar el lavado de la vagina, tinción de cristal violeta y evaluación citológica vaginal para ratón celo identificación staging ciclo

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

Un medio rápido para evaluar el estado reproductivo en roedores es útil no sólo en el estudio de la disfunción reproductiva, sino que también es necesario para la producción de nuevos modelos de ratón de la enfermedad y las investigaciones en la regulación hormonal de la degeneración del tejido (o regeneración) después de la estimulación patológica. El murino reproductiva (o estro) ciclo se divide en 4 etapas: proestro, estro, metaestro y diestro. Fluctuaciones definidas en los niveles circulantes de los esteroides ováricos 17-β-estradiol y progesterona, las gonadotropinas luteinizante y hormonas estimulantes del folículo, y la prolactina luteotropic hormona transición de la señal a través de estas etapas de reproducción. Los cambios en la tipología de células dentro del canal vaginal murino reflejar estos eventos endocrinos subyacentes. Evaluación diaria de la proporción relativa de células nucleadas cornificadas epiteliales, células epiteliales escamosas, y leucocitos presentes en los frotis vaginales se pueden utilizar para identificar murino estraletapas. El grado de invasividad, sin embargo, empleado en la recogida de estas muestras puede alterar el estado reproductivo y provocar una respuesta inflamatoria que puede confundir la evaluación citológico de frotis. Aquí se describe un simple, no invasivo protocolo que se puede utilizar para determinar el estadio del ciclo estral de una hembra de ratón sin alterar su ciclo reproductivo. Detallamos cómo diferenciar entre las cuatro fases del ciclo estral por la recolección y el análisis de la tipología predominante de células en frotis vaginales y nos muestran cómo estos cambios pueden ser interpretados con respecto al estado endocrino.

Aquí se describe cómo identificar la etapa del ratón reproductiva (proestro, estro, metaestro o diestro) por simple, no invasivo recogida y evaluación citológica de muestras de frotis vaginales. Nos describen con más detalle cómo citología vaginal refleja los niveles circulantes de hormonas subyacentes transición a través del ciclo reproductivo murino.

Realizar el lavado de la vagina, tinción de cristal violeta y Evaluación citológica vaginal para ratón Celo identificación Staging Ciclo

Un medio rápido de evaluar el estado reproductivo en roedores es útil no solo en el estudio de la disfunción reproductiva, sino que también es necesario para el...

Todos los procedimientos realizados en este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y regulaciones establecidas por el Comité de Cuidado Animal de la Universidad de Ottawa y por el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales. Un método rápido para evaluar el estado reproductivo en roedores es útil no solo en el estudio de la disfunción reproductiva, sino que también es necesario para la generación de nuevos modelos murinos de enfermedad y para investigaciones sobre la regulación hormonal de la degeneración o regeneración tisular tras un desafío patológico. Aquí describimos cómo identificar la fase del ciclo reproductivo de las hembras de ratón en cualquier día determinado mediante una evaluación citológica sencilla y no invasiva del tipo celular predominante presente en frotis vaginales.El ciclo reproductivo o estro, que se asemeja al ciclo menstrual humano, se divide en cuatro etapas. Las fases de proestro, estro, metaestro y diestro definen las fluctuaciones en los niveles circulantes de los esteroides ováricos, 17 beta-estradiol y progesterona, las gonadotropinas, la hormona luteinizante y la hormona foliculoestimulante, así como la hormona luteotrópica prolactina, que señala la transición a través de estas etapas reproductivas. La fase de proestro del ciclo estro corresponde a la fase folicular del ciclo menstrual humano y se caracteriza por un aumento previo a la ovulación en los niveles circulantes de 17 beta-estradiol, así como por un pequeño pico de prolactina.El aumento en 17 beta estradiol va seguido de un incremento en los niveles circulantes de hormona luteinizante y de hormona foliculoestimulante. El pico en los niveles de hormona foliculoestimulante señala la ovulación y la entrada en ES. Durante el estrés en ES, los niveles de 17 beta estradiol disminuyen junto con los niveles de prolactina.El ingreso al estro pico coincide con un pequeño aumento en los niveles circulantes de hormona foliculoestimulante y corresponde al comienzo de la fase lútea humana. Los niveles de progesterona comienzan a elevarse y se produce un segundo pequeño pico en los niveles de 17 beta-estradiol. En respuesta a la activación del cuerpo lúteo, el ingreso a la diestros y a los ratones ocurre cuando los niveles circulantes de progesterona alcanzan su máximo y corresponde al humano.Fase lútea tardía. La regresión del cuerpo lúteo conduce a una disminución brusca subsiguiente de los niveles de progesterona y al inicio de la prote. Los cambios en la tipología celular reflejan estos eventos endocrinos subyacentes en la proporción relativa de células epiteliales.Las células y leucocitos cuantificados detectados en frotis vaginales pueden utilizarse para identificar cada una de las fases del ciclo estral. Hola, mi nombre es Ashley McLean. Soy investigadora en el laboratorio de neuroregeneración bajo la dirección de la Dra. Stephanie Bennett en la Universidad de Ottawa.Y soy Nicholas Valenzuela. Trabajo con el Dr. Steven Phi en el Carlton Immersive Media Studio de la Universidad de Ottawa. En este video, describimos un protocolo sencillo que puede utilizarse para la determinación del estadio extra ciclo de EST.Este protocolo detallará cómo se puede diferenciar entre las cuatro etapas reproductivas del ratón: proestro, metaestro y diestro, mediante la evaluación de la tipología celular predominante y frotis vaginales. Comencemos. Para este protocolo, necesitará preparar dos elementos, agua doblemente destilada y una solución al 0,1 % de violeta de cristal, todos ellos autoclavados.La solución de tinción se puede almacenar en un recipiente herméticamente cerrado a temperatura ambiente hasta que sea necesaria. Comience colocando una perilla de látex en el extremo de una punta estéril de 200 microlitros y aspire aproximadamente cien microlitros de agua doblemente destilada estéril. Utilice las graduaciones de la punta como guía de volumen.Coloque su ratón sobre el embudo de manera que su extremo trasero quede orientado hacia usted. Sujete firmemente su cola y levante suavemente su extremo posterior. El ratón utilizará sus patas delanteras para agarrarse al embudo.En este momento, el ratón podría orinar. De ser así, enjuague la zona con agua doblemente destilada proveniente de una punta separada. Coloque el extremo de la punta llena de agua doblemente destilada en la abertura del canal vaginal.Presione suavemente la perilla y expulse de un cuarto a la mitad del volumen de agua dentro del canal vaginal. Luego, libere lentamente la presión ejercida sobre la perilla, retirando el líquido nuevamente hacia la punta. Repita este paso anterior cuatro a cinco veces utilizando la misma perilla y el mismo líquido.Evite liberar la presión demasiado rápido para evitar aspirar el líquido hacia la perilla. Puede ser útil un puntero con filtro para este fin. Devuelva al ratón a su jaula y expulse el líquido sobre el portaobjetos de vidrio.Deje que el portaobjetos se seque completamente a temperatura ambiente. Una vez seco, estas extensiones adicionales pueden teñirse inmediatamente o en una fecha posterior. Coloque el portaobjetos secado al aire en la solución de violeta de cristal durante un minuto.Lave el portaobjetos con agua doblemente destilada durante un minuto. Repita el proceso y retire el exceso de agua doblemente destilada del portaobjetos con un limpiador de baja absorción. Evite la región del frotis teñido y coloque aproximadamente 20 microlitros de glicerol sobre el frotis y la cubierta.Debe examinar los frotis teñidos lo más pronto posible mediante microscopía óptica, ya que el colorante se difundirá desde las células en el medio de glicerol con el tiempo. Comience examinando todo el frotis con un aumento menor. Seleccione un área representativa y pase a un aumento mayor.Durante la etapa Pro Astra, las células son casi exclusivamente células epiteliales nucleadas. Durante la etapa extra, las células que observará son predominantemente células epiteliales escamosas cornificadas, que generalmente forman agrupaciones densamente empaquetadas. Estas células tienen forma irregular y carecen de núcleo visible.En la etapa de metestro, aún se observan raras células epiteliales escamosas cornificadas, pero ahora predomina un mayor número de leucocitos más pequeños y de tinción oscura. En la etapa de diestro, hay pocas o ninguna célula epitelial escamosa cornificada. Los leucocitos restantes están presentes en gran cantidad.Se observan células epiteliales nucleadas, encontradas tanto como células individuales como en grupos. Un problema que podría presentarse es la contaminación de la muestra con orina. En caso de que esto ocurra, debe descartar la muestra y no utilizarla para la clasificación.Acabamos de mostrarle cómo realizar lavados vaginales. Recolecte muestras, tiña estas muestras y evalúe la tipología celular para determinar la etapa del ciclo estral de las ratonas en el momento del análisis. En resumen, durante la fase preovulatoria en PROE, un pico en los niveles circulantes de 17 beta-estradiol se refleja mediante una predominancia de células epiteliales nucleadas bien formadas en las muestras de frotis vaginal.Un pico posterior en los niveles de la hormona estimulante del folículo señala la ovulación y la entrada en el estro, donde predominan las células epiteliales escamosas cornificadas en los frotis. Durante el metestro, los niveles de progesterona aumentan. El tipo celular presente en los frotis vaginales en este momento son fragmentos de células epiteliales cornificadas y leucocitos más pequeños y de tinción más oscura.Durante el diestro, con un pico de progesterona, comienzan a aparecer células epiteliales nucleadas. Los leucocitos aún están presentes. Para asegurar que una hembra de ratón esté ciclando regularmente y para establecer la duración del ciclo estral, estas evaluaciones deben realizarse diariamente y analizarse durante dos ciclos completos; es normal observar etapas de diestro y estrus prolongadas en diferentes ratones.Esperamos que esto le sea útil en sus estudios enfocados en género y hormonas, y le deseamos buena suerte en sus experimentos.

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