Aislamiento de linfocitos de ratón del tracto genital Mucosa

El objetivo general de este procedimiento es aislar los linfocitos del tracto reproductivo del ratón. Esto se logra extirpando primero todo el tracto genital y picando el tejido en pedazos pequeños para liberar los linfocitos del tejido. El tejido finamente picado se digiere con colagenasa ocho y se agita vigorosamente el tejido a 37 grados centígrados.

Con una agitación magnética, los linfocitos se aíslan mediante un gradiente de llamada. En última instancia, los linfocitos pueden caracterizarse mediante citometría de flujo La implicación de esta técnica se extendió hacia el diagnóstico y la terapia de la enfermedad reproductiva. Ya que este método nos permite comprender el comportamiento de los linfocitos tisulares, que a menudo difieren del linfocito que se aísla del sistema circulante.

Aunque este método proporciona información sobre el sistema de la mucosa reproductiva, también puede aplicarse a otros sistemas, como los sistemas de la mucosa intestinal y respiratoria. Después de sacrificar a un ratón hembra, use unas tijeras quirúrgicas para hacer una incisión en la línea media baja y luego abra la piel. Retire suavemente los intestinos, identifique el conducto cúbico y, a continuación, aísle y extraiga todo el tracto genital desde el tubo tubular hasta la abertura vaginal.

Coloca el tracto genital en una placa de Petri. Use un par de tijeras para abrir todo el tracto longitudinalmente. A continuación, transfiera el tejido a una placa de Petri con medios RPMI 10 completos.

Ahora corte el tracto genital en trozos finos y luego transfiera los trozos a un matraz que contenga RPMI 10 completo y EDTA. Coloque el matraz en un agitador magnético y agite el tejido dos veces durante 15 minutos a temperatura ambiente cada vez para deshacerse de las células epiteliales después del último período de agitación, deseche el sobrenadante y luego vierta los trozos de tejido a través de un colador de células de 40 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros. Lave los residuos de EDTA con medios completos.

Ahora transfiera las piezas de tejido filtradas a un nuevo matraz con RPMI 10 fresco y colagenasa y digiera las piezas a 37 grados centígrados en el conjunto de agitación magnética para agitar vigorosamente el tejido después de una hora, vierta el sobrenadante a través de un colador de células de 100 micrómetros en un tubo cónico fresco de 50 mililitros y mantenga la suspensión de células filtradas en hielo. Agregue RPMI 10 fresco con colagenasa al matraz original y revuelva el pañuelo dos veces más usando RPMI 10 completo fresco y colagenasa cada vez. Después de la tercera digestión, no debe haber trozos de tejido visibles en la solución.

Ahora, junta los sobrenadantes de las tres digestiones. Gire las células durante cinco minutos a 410 G y cuatro grados centígrados, y luego deseche el sobrenadante. Comience por resus suspendiendo el pellet de la celda en una solución nueva del 40% por llamada.

Agregue la suspensión de celdas con un 40% por llamada en un tubo de gradiente, y luego subbase cuidadosamente e iguale el volumen de lo recién preparado. 70% por llamada. Ahora centrifugue las muestras de gradiente durante 20 minutos a temperatura ambiente con la pausa apagada.

Después de la centrifugación, coseche cuidadosamente los linfocitos en la capa de interfaz entre los gradientes de perol. A continuación, lave las células recuperadas con RPMI de uno a tres durante 10 minutos a temperatura ambiente. Por último, después de descartar el supnatante, vuelva a suspender los linfocitos en la solución adecuada de acuerdo con el procedimiento experimental deseado.

Este diagrama de puntos es un ejemplo de una población de linfocitos que se aisló del tracto genital de un ratón infectado intravaginalmente con uredermo por clamidia. Siete días después de la infección, la suspensión unicelular se comió en linfocitos CD tres positivos y se analizó para detectar células que expresaban CD cuatro y CD ocho después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que el investigador explorara la función reproductiva de los linfocitos y las características celulares en un modelo de enfermedad de ratón con virus que imitan enfermedades humanas.