Replicación del cromosoma Timing Combinado con fluorescente

Este enfoque experimental combina la incorporación de BRDU con hibridación fluorescente in situ. Para analizar cuantitativamente el momento de replicación de los cromosomas de mamíferos. Primero, incorpore BRDU en células vivas y aísle los cromosomas en metafase.

Luego, realice una hibridación fluorescente in situ de ADN combinada con tinción secuencial con anticuerpo contra BRDU para identificar los cromosomas individuales en replicación. A continuación, utilice microscopía fotográfica para capturar imágenes de las señales de hibridación y la incorporación de BRDU en figuras mitóticas individuales. Mediante el software Cyto Vision, calcule el área e intensidad de los píxeles representados por las señales de BRDU o DAPI en cada cromosoma aislado.

Los resultados pueden cuantificar y comparar la incorporación de BRDU en cromosomas reorganizados individuales y sus holos. Dado que el método descrito aquí evalúa células individuales, tiene la capacidad de detectar cambios en la replicación y en el momento de las reorganizaciones cromosómicas que están presentes solo en una fracción de las células de una población, en comparación con los protocolos recientemente desarrollados de microarreglos y secuenciación de ADN de alto rendimiento. Este método permite una comparación directa de cromosomas homólogos que se encuentran dentro de la misma célula.

También tiene la capacidad de identificar de manera inequívoca reordenamientos cromosómicos que afectan la replicación del cromosoma. El momento de todo el cromosoma que demuestra el procedimiento será Leslie Smith. Un investigador asociado en mi laboratorio siembre las células a aproximadamente 70% de confluencia en un recipiente de cultivo tisular de 150 milímetros y colóquelas en un incubador de células durante 24 horas al tiempo apropiado.

Puntos anteriores a la recolección. Reponga el medio con medio completo fresco que contenga 10 microgramos por mililitro de BRDU. El tiempo de duración durante el cual las células se cultivan en medio con BRDU variará según el tipo celular y la especie.

Típicamente, la fase G2 dura entre dos y cinco horas. Retire el medio de cultivo de la placa, guardando 10 mililitros en un tubo cónico de centrífuga de 15 mililitros. Lave las células con 10 mililitros de tampón y elimine el tampón restante mediante aspiración al vacío.

Luego, agregue cinco mililitros de tripsina al 0,25 % e incube a temperatura ambiente hasta que las células se desprendan de la placa. Recoleccione las células y transfiera la suspensión a los 10 mililitros de medio reservado. Pelote las células mediante centrifugación y aspire todo excepto 0,5 mililitros del medio.

Ahora, resuspenda completamente las células utilizando una pipeta para hincharlas osmóticamente; agregue tres gotas de cloruro de potasio 75 milimolar calentado a 37 grados Celsius y mezcle la suspensión celular con una pipeta. Luego, incorpore un volumen adicional de 0,5 mililitros de solución hipotónica. A continuación, complete hasta un volumen total de cinco mililitros con solución hipotónica y mezcle mediante pipeteo.

Incube la suspensión celular a 37 grados Celsius durante 20 a 45 minutos, según el tipo de célula. Incube los tubos en posición inclinada para mantener las células en suspensión. Luego, centrifugue a 400 × g durante 10 minutos.

Aspire todo excepto 0,5 milímetros del sobrenadante y utilice una pipeta Pasteur para resuspender suavemente la pastilla celular. En este punto, las células hinchadas osmóticamente serán frágiles, por lo que se debe tener cuidado de no alterar las membranas citoplasmáticas. A continuación, agregue tres gotas de carnoys, fijador, y mezcle suavemente.

Después de incorporar 0,5 mililitros adicionales de fijador, complete el volumen de fijador hasta cinco mililitros y pipetee para obtener una suspensión homogénea de células. Estas células fijadas pueden almacenarse a oscuras a menos veinte grados Celsius durante varios meses. Recoga las células fijadas mediante centrifugación, aspire el fijador y resuspenda el sedimento en 10 volúmenes de fijador mantenido sobre hielo frío para microscopio.

Deslice aproximadamente a un ángulo de 45 grados. Agregue la suspensión celular gota a gota para extender la suspensión. Inunde la lámina con fijador y elimine el exceso.

Luego, coloque el portaobjetos horizontalmente sobre toallas de papel para que se seque al aire. Evalúe las muestras en busca de la presencia de extensiones mitóticas utilizando un microscopio invertido. Añada dos microlitros de RNAsa A al 10 microgramos por mililitro en dos XSSC a cada portaobjetos e incube a 37 grados Celsius durante una hora.

Realice tres lavados de tres minutos con dos XSSC pH 7,0 a temperatura ambiente. Luego deshidrate las muestras mediante una serie de etanol a temperatura ambiente durante tres minutos. A continuación, seque al aire cada muestra a temperatura ambiente en un tubo microcentrífugo enfriado.

Agregue cuatro microgramos de sustrato de ADN con nucleótido marcado, tampón de traducción NIC 10 X, mezcla de dNTP y enzima de traducción NIC. Incube la reacción a 16 grados Celsius durante la noche, luego caliente a 70 grados Celsius durante 10 minutos para detener la reacción. A continuación, enfríe en hielo durante cinco minutos.

Ahora, para precipitar el ADN con etanol, agregue 48 microlitros de acetato de sodio tres molar, 160 microlitros de ADN 1D capturado a 0,25 microgramos por microlitro y 1,2 mililitros de etanol al 100 %. Almacene la muestra a 80 grados Celsius negativos durante 10 minutos hasta la precipitación nocturna del ADN mediante centrifugación, lave el precipitado con etanol al 70 % y re suspenda la sonda de ADN seca al aire en 40 microlitros de agua doblemente destilada para obtener una concentración final de 100 nanogramos por microlitro de ADN marcado para la hibridación simultánea de retro SEP. Prepare dos cócteles de sonda separados que contengan cot ADN 1D según se detalla en el manuscrito adjunto.

Deshidrate las mezclas de sondas a 75 grados Celsius durante 10 minutos. Luego incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos para bloquear el ADN cot 1 con las secuencias repetitivas. Ahora combine la sonda de bloqueo con la sonda S en una proporción de tres a dos, utilizando 25 microlitros por muestra.

Deslice al lado para desnaturalizar las muestras. Sumerja los portaobjetos en formamida al 70 % y dos SSC a 72 grados Celsius e incube durante tres minutos. Deshidrate inmediatamente las muestras mediante una serie de etanol a cuatro grados Celsius durante tres minutos.

Deje secar al aire cada muestra a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos antes de finalizar la preparación de la sonda. Equilibre los portaobjetos en un calentador de portaobjetos a 45 grados Celsius. A continuación, agregue 25 microlitros de la mezcla de sonda back S.

Coloque suavemente una cubreobjetos sobre cada portaobjetos y selle todos los bordes con cemento de goma para la etapa de hibridación. Incube las muestras durante la noche a 37 grados Celsius en una cámara humedecida. Realice tres lavados posteriores a la hibridación de tres minutos cada uno en 50%IDE dos XSSC pH 7,0 a 38-40 grados Celsius.

La temperatura óptima de los lavados depende de la sonda. Si hay una hibridación con fondo elevado, aumente la temperatura de los lavados. Por el contrario, si la señal de la sonda es débil y no hay fondo, disminuya la temperatura de los lavados.

Realice un lavado en tampón PN a temperatura ambiente durante tres minutos. Para la detección de BRDU, agregue 200 microlitros de tampón bloqueador PNM a cada portaobjetos. Incube durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad y drene los portaobjetos sobre una toalla de papel.

Luego, agregue 100 microlitros de anticuerpo conjugado anti B-R-D-U-F-E a 50 microgramos por mililitro e incube durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Realice tres lavados de tres minutos en tampón PN a temperatura ambiente. Retire el exceso de tampón PN de cada portaobjetos.

Luego, agregue 20 microlitros de solución de montaje dappy Antifa. Cubra el portaobjetos con una toalla de papel y presione sobre el cubreobjetos para expulsar las burbujas de aire y el exceso de solución de montaje. Capture las imágenes con un microscopio de fluorescencia acoplado a una cámara CCD.

Utilice el objetivo de 100x, la rueda de filtros automática y el software Cyto Vision para capturar BRDU mediante un filtro fitzy, y las pinturas cromosómicas y las sondas centroméricas mediante un filtro side three o Texas red. Asimismo, utilice un filtro dappy para la tinción de núcleos. Identifique los cromosomas individuales de interés con sondas de pintado EP o específicas para cromosomas mediante el software Cyto Vision.

Corte cada cromosoma de interés del extendido metafásico en su totalidad. Copie y pegue las imágenes cromosómicas de DPI y FITZY en una nueva ventana. Seleccione el icono de gráfico en el menú de herramientas, que permite generar un gráfico que represente el área e intensidad de las tinciones Fitz y dappy a lo largo de cada cromosoma individual.

Esto se realiza trazando una línea a lo largo del cromosoma, desde el brazo corto hasta el brazo largo. En el menú de herramientas, seleccione el icono de datos y genere una tabla que muestre el área calculada y la intensidad para ZI y dpi. A continuación, seleccione las señales ZI y DPI para los cromosomas de interés.

Luego, haga clic en los botones de intensidad y área en el icono de tabla. El software genera una medición numérica de píxeles por pulgada cuadrada para cada señal. A continuación, la intensidad promedio de píxeles de cada cromosoma se multiplica por el área ocupada por esos píxeles.

Para obtener el número total de píxeles para la visualización de las regiones cromosómicas que se replican más tarde, evalúe el patrón de bandeo de la incorporación de BRDU en las regiones cromosómicas que se replican activamente. Luego, calcule las diferencias en el momento de replicación entre pares de cromosomas en función de las diferencias en el patrón de bandeo de BRDU. Los cromosomas en las células de mamíferos se replican según un programa temporal, en el que la replicación temprana y tardía ocurre al principio y al final de la fase S, respectivamente.

Un sase típico en células de mamífero dura de ocho a 10 horas, y la G dos suele durar de dos a cinco horas. En este sistema experimental, se añade BRDU durante períodos de tiempo crecientes para marcar las últimas porciones de los cromosomas que se replican; estas células contienen una deleción del gen humano asa R seis localizado en el 6 Q 16.1. Tras un tratamiento de cinco horas con BRDU, se recolectaron las células mitóticas y se procesaron para detectar la incorporación de BRDU y la hibridación fluorescente in situ mediante una sonda marcadora del cromosoma seis; los dos cromosomas seis muestran tres etiquetas fluorescentes.

La diferencia significativa en el patrón de bandeo de BRDU es consistente con el retraso en el momento de replicación de más de dos horas para uno de los cromosomas seis. El software Cyto vision muestra los perfiles de intensidad de señal diferentes para DPI y BRDU en los dos cromosomas seis, lo que indica una replicación asincrónica. Además, existe una diferencia significativa en la cantidad total de incorporación de BRDU en comparación con un análisis similar de la tinción con DPI.

La inclusión de una sonda inversa que contiene el gen AR seis humano resalta el cromosoma seis único que presenta una deleción en su brazo largo en esta célula. Curiosamente, hay una incorporación de BRDU más intensa y un patrón de bandeo más extendido de la incorporación de BRDU en comparación con el cromosoma seis no-ED. Cuando se procesaron preparaciones de metafase de siete células diferentes para la cuantificación de la diferencia en el momento de replicación entre los cromosomas seis.

Los niveles de BRDU muestran una diferencia mayor a dos veces entre los valores totales de píxeles para los cromosomas seis eliminados y los no ED. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse correctamente en tres días. Esperamos que ahora tenga una buena comprensión de cómo medir la replicación, el momento de los cromosomas homólogos ubicados dentro de la misma célula y cómo identificar sin ambigüedades las reordenaciones cromosómicas que se correlacionan con alteraciones en la replicación.

Temporización de cromosomas completos.