Name: Replicación del cromosoma Timing Combinado con fluorescente In situ La hibridación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 14 s
Description: Aprende a analizar cuantitativamente el tiempo de replicación cromosómica en células mamíferas mediante la incorporación de BrdU y la hibridación in situ fluorescente. Este método permite comparar directamente cromosomas rearrangados y normales.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional del Cáncer, CA131967.

1. BrdU incorporación (denominación de los terminales) <ol><li> Células de la placa a aproximadamente 70% de confluencia en un cultivo de tejido de 150 mm plato 24 horas antes de la adición de BrdU. </li><li> Sustitución de los medios por nuevos medios completos que contienen 20 mg / ml de BrdU (Sigma) en puntos de tiempo apropiados antes de la cosecha. La longitud de tiempo de las células se cultivan en medios con BrdU variará con el tipo celular y la especie, típicamente la fase G2 dura entre 2 y 5 horas (Figura 1). </li></ol> 2. Cromosoma cosecha de cultivos monocapa de células <ol><li> Eliminar los medios de cultivo de la placa y recoger 10 ml en un tubo de 15 ml de centrífuga cónico. Deseche los medios restantes. </li><li> Enjuagar las células una vez con 10 ml versine [o HBSS (Sigma)]. </li><li> Añadir 5 ml de tripsina 0,25% en versine (o HBSS) a la placa. Incubar a temperatura ambiente hasta que las células se separan de la placa. </li><li> Añadir suspensión de células se tripsinizaron al tubo que contiene los 10 ml de medios de paso 2,1. &lt;/ Li&gt; <li> Centrifugar a 400 xg durante 10 min para sedimentar las células. Aspirar el sobrenadante, dejando 0,5 ml de medio más el sedimento celular. </li><li> Resuspender las células a fondo por pipeteo con una pipeta Pasteur. </li><li> Añadir 3 gotas de solución hipotónica (0,075 M KCl (Sigma) se calentó a 37 ° C) y mezclar la suspensión de células con una pipeta Pasteur. Añadir 0,5 ml de solución hipotónica y se mezcla de nuevo con una pipeta Pasteur. Llevar a un volumen de solución hipotónica a 5 ml y mezclar de nuevo. Incubar a 37 ° C durante 20-45 min, dependiendo del tipo de célula. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 10 min. Aspirar el sobrenadante, dejando 0,5 ml de medio más el sedimento celular. </li><li> Resuspender el pellet de células agitando suavemente el tubo. Las células osmóticamente hinchadas será frágil en este punto, por lo que se debe tener cuidado de no perturbar las membranas citoplasmáticas. </li><li> Añadir 3 gotas de fijador (1:3 ácido acético glacial: metanol) Carnoy y mezcle suavemente con una pipeta Pasteur pipeteee. Añadir 0,5 ml de fijador y mezclar pipeteando suavemente con una pipeta Pasteur. Llevar a un volumen de fijador a 5 ml y mezclar de nuevo pipeteando suavemente con una pipeta Pasteur. Las células fijadas se pueden almacenar en la oscuridad a -20 ° C durante varios meses. </li><li> Centrifugar y aspirar como en el paso 2,8. </li><li> Resuspender el sedimento celular en fijador fresco; estimar el volumen de la pastilla y añadir 10 veces el volumen de ~ fijador de Carnoy. </li><li> Añadir la suspensión celular gota a gota en portaobjetos de microscopio húmedos, helados; mantener el portaobjetos a un ángulo de ~ 45 ° y permitir la suspensión de células a fluir sobre la superficie del portaobjetos. Coloque la corredera plana sobre papel de cocina y el diluvio de diapositivas con fijador y dejar secar al aire. Ver diapositivas para la presencia de los diferenciales mitóticas usando un microscopio invertido. </li></ol> 3. RNasa tratamiento y deshidratación de etanol <ol><li> Place 200 l de 10 mg / ml de RNasa A (Sigma) en 2 x SSC a cada diapositiva; incubar a 37 y deg; C durante 1 hr. </li><li> Lavado de los portaobjetos 3 veces con 2X SSC, pH 7,0 a temperatura ambiente durante 3 min cada uno. </li><li> Deshidratar desliza a través de una EtOH (Sigma) serie (70%, 90% y% 100) a temperatura ambiente durante 3 min cada uno. </li><li> Secar las preparaciones a temperatura ambiente. </li></ol> 4. Preparación de cócteles Probe Plus para BAC centrómero del cromosoma específico Enumeración Probe (CEP) o para las pinturas de cromosomas enteros Hibridación in situ <ol><li> Para la hibridación BAC / PAC simultánea, preparar dos cócteles sondas separadas para pre-hibridación. Hemos encontrado que la pre-hibridación de las sondas de BAC y PAC por separado en los resultados de rigurosidades diferentes en menos de fondo y una mayor intensidad de señal. También hemos encontrado que fosmids individuales también se pueden utilizar en lugar de clones BAC. La formulación cóctel se describe a continuación representa los volúmenes para una sola diapositiva. Si el procesamiento de varias diapositivas utilizando las mismas sondas simplemente aumentar el parámetro adecuado volúmenes<html> iately. * BAC ADN sonda cóctel: 11,5 l de tampón de hibridación (50% formamida (Sigma) / 2 x SSC / sulfato de dextrano (Sigma)) 2 l dH 2 O 2,5 l BAC/Cot1 ADN en dH 2 O (ver más abajo para el etiquetado de protocolo) 15 l volumen total * CEP sonda cóctel: 7 l CEP tampón de hibridación (65% Formamide/2x SSC / sulfato de dextrano) 2 l dH 2 O 1 l de ADN CEP/Cot1 (comprado prelabeled con Spectrum Orange/Cy3/Texas Rojo) 10 l volumen total * Después de la desnaturalización y pre-hibridación (paso 5.1) Mezcla de BAC sonda con CEP sonda en una relación 3:2 25 cócteles sonda l / diapositivas y mezclar. Oregón </li><li> Alícuota de 20 l / portaobjetos de sonda completo con Paint cromosoma (Cy3/Texas Red) en un tubo. Proceder a la desnaturalización y la etapa de pre-hibridación. </li></ol>&quot;&gt; 5. Deslice y desnaturalización de la sonda y la hibridación in situ <ol><li> Desnaturalizar la sonda cóctel (s) a 75 ° C durante 10 min. Pre-hibridación a 37 º C durante 30 min para permitir que el ADN de Cot1 para hibridar con secuencias repetitivas y para evitar la hibridación subsiguiente a cromosomas en metafase. </li><li> Diapositivas desnaturalizar en frascos Coplin en Formamide/2x 70% SSC, pH 7,0 a 72 ° C durante 3 min. </li><li> Inmediatamente deshidratar desliza a través de una serie de EtOH (70%, 90% y% 100) en frascos Coplin a 4 ° C durante 3 min cada uno. </li><li> Deje que los portaobjetos se seque al aire a temperatura ambiente. </li><li> Precalentar diapositivas a 45 ° C en la diapositiva más cálido de los últimos 10 minutos de la sonda de pre-La hibridación (paso 5.1). Mezclar pre-hibridizada cóctel sonda si es necesario y añadir 25 ul para cada diapositiva, coloque suavemente un cubreobjetos en cada diapositiva y el sello a lo largo de todos los bordes con cemento de goma. Incubar durante una noche a 37 ° C en una cámara humidificada para evitar la evaporación. </li></ol><ol><li> Lavar los portaobjetos en frascos Coplin 3 veces en formamide/2x 50% SSC, pH 7,0, a 38-40 ° C durante 3 min cada uno. La temperatura de los lavados puede variar entre las sondas. Si no hay hibridación de fondo alta puede aumentar la temperatura de los lavados. A la inversa, si la señal es débil y no existen antecedentes entonces se puede disminuir la temperatura de estos lavados. </li><li> Lavar los portaobjetos una vez en tampón de PN a temperatura ambiente durante 3 min, y pasar a la etapa de detección de BrdU. </li></ol> 7. BrdU detección <ol><li> Diapositivas de bloques con tampón de PNM durante 10 min (200 l / portaobjetos) a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Escurrir las diapositivas mediante la activación de borde sobre una toalla de papel. Añadir 100 l de anti-BrdU-FITC (50 mg / ml o Millipore Roche) en tampón de PNM durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Lavar los portaobjetos 3 veces en tampón de PN a temperatura ambiente durante 3 min cada uno. </li><li> Drenarel exceso de tampón de PN en portaobjetos de uno a la vez girando en el borde en una toalla de papel. Añadir 20 l DAPI / Antifade solución de montaje (Invitrogen). Cubrir el portaobjetos con una toalla de papel y presione el cubreobjetos para forzar la salida de burbujas de aire y el exceso de solución de montaje. Continúe con el análisis de imágenes. </li></ol> 8. La captura de imágenes y cuantificación de incorporación de BrdU <ol><li> Las imágenes se capturan con una Olympus BX61 microscopio de fluorescencia Olympus y la cámara CCD, 100x objetivo, rueda de filtros automáticos y software Cytovision (Applied Imaging). BrdU es capturado utilizando un filtro FITC; pinturas cromosoma (Texas Red, metasistemas o Cytocell), BAC (Cy3) y sondas de CEP (Vysis Spectrum Orange) se capturaron con una Red de Texas o el filtro de Cy3; DAPI se capta con un filtro DAPI (véase Las figuras 2 y 3). </li><li> Cromosomas individuales de interés se identifican con BAC / PAC cromosoma o sondas específicas de pintura (Figuras 2B y 3B). Utilizandoel software Cytovision, cada cromosoma de interés es de &quot;corte&quot; de la propagación de metafase como un todo, se traza una línea a través del largo de la longitud del cromosoma de brazo corto de brazo largo (figuras 2C y 3C). El software Cytovision se utiliza para cuantificar el perfil de intensidad de los píxeles a lo largo de la longitud de cada cromosoma. El software Cytovision calcula el área ocupada por los píxeles y se cuantifica la intensidad de los píxeles representados por los BrdU o DAPI señales en cada cromosoma aislado. La intensidad de los píxeles promedio representada por cada cromosoma se multiplica por el área ocupada por los píxeles para obtener el número total de pixeles (Tabla 1 y Figura 4). Además, este protocolo permite la visualización de las últimas regiones de replicación de los cromosomas. En consecuencia, el patrón de bandas de incorporación de BrdU permite la detección de regiones de replicación activa de los cromosomas, y diferencias en el momento de replicación entre chromospares OMe se ve como diferencias en este patrón de bandas (Figuras 2 y 3). Por último, estas diferencias en los patrones de unión se puede comparar con conocidos mapas de replicación de tiempo para cada cromosoma 6,7, lo que permite una estimación de la diferencia de tiempo de replicación entre cromosomas homólogos o los brazos del cromosoma 4. Por ejemplo, el cromosoma dos 6 es en la Figura 3A muestran una diferencia en el patrón de bandas de&gt; 2 hr cuando se compara con la temporización normal de replicación del cromosoma 6 4. Además, un procedimiento similar al descrito aquí se ha utilizado con éxito para el estudio de la replicación asíncrona de temporización entre los cromosomas X inactivo y activo 8,9. Los cromosomas X activos e inactivos se identificaron utilizando pinturas cromosoma X. Las imágenes se adquirieron usando Quips mFISH software (Vysis) y el número de píxeles ocupados por los cromosomas X y el número de píxeles ocupados por la fluorescenciabeled BrdU fueron calculados utilizando NIH Image ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/nihimage" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html</a> ). </li></ol> 9. Nick Traducción de BAC ADN de etiquetado fluorescente (Vysis) <ol><li> Agregue la mezcla de sondas siguiente a un tubo de microcentrífuga refrigerada: 70 l (4 g de ADN) en dH 2 O 10 l 0,2 mM dUTP-Naranja o Verde 20 l .1 mM dTTP 20 l 10x tampón de traducción Nick 40 l NT dNTP (menos dTTP) 40 l nick enzima Traducción Volumen total 200 l Incubar @ 16 ° CO / N. Detener la reacción por calentamiento a 70 ° C durante 10 min. Enfriar en hielo durante 5 min. </li><li> Se precipita el ADN con etanol añadiendo lo siguiente a la mezcla de sondas: 200 l solución de sonda 48 l 3 M NaOAc 160 l Cot1DNA (.25 mg / ul) 1.200 l de EtOH 100% </li><li> Almacenar a -80 º C durante 10 min a O / N. </li><li> Girar in frío a 12.000 xg durante 20 min. Decantar EtOH. Lavar 1 vez con 70% EtOH. Girar como antes. Decantar EtOH. Deje secar al aire sólo hasta que se evapore EtOH. Resuspender en 40 l dH 2 O para una concentración final de 100 ng / l de ADN de BAC. </li></ol>

<ol><li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosome+dosage+compensation%3A+how+mammals+keep+the+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).</li>
<li>Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation+induces+frequent+translocations+with+delayed+replication+and+condensation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation.</a> Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).</li>
<li>Smith, L., Plug, A., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+Replication+Timing+Leads+to+Delayed+Mitotic+Chromosome+Condensation+and+Chromosomal+Instability+of+Chromosome+Translocations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).</li>
<li>Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autosomal+locus+that+controls+chromosome-wide+replication+timing+and+mono-allelicexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).</li>
<li>Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+translocations+with+delayed+replication%3A+evidence+for+cis+control+of+chromosome+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).</li>
<li>Camargo, M., Cervenka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+DNA+replication+of+human+chromosomes.+II.+Replication+map+and+replication+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model.</a> Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).</li>
<li>Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+chromosomal+bands+replicating+early+in+the+S+phase+of+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts.</a> Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).</li>
<li>Diaz-Perez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+element%28s%29+at+the+nontranscribed+Xist+locus+of+the+active+X+chromosome+controls+chromosomal+replication+timing+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse.</a> Genetics. 171, 663-672 (2005).</li>
<li>Diaz-Perez, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deletion+at+the+mouse+Xist+gene+exposes+trans-effects+that+alter+the+heterochromatin+of+the+inactive+X+chromosome+and+the+replication+time+and+DNA+stability+of+both+X+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes.</a> Genetics. 174, 1115-1133 (2006).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li>
<li>Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+inactivation+of+rDNA+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Allelic inactivation of rDNA loci.</a> Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).</li>
<li>Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman">http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman</a> (2006).</li>
<li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+checkpoint+response+to+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">The checkpoint response to replication stress.</a> DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La preparación de extensiones de cromosomas es un paso crítico para el éxito de la replicación de temporización ensayo descrito aquí. La inclusión de una etapa de pretratamiento antes de la colcemid tratamiento hipotónico puede ayudar en la frecuencia y la propagación de las células mitóticas. Nos típicamente exponer las células a colcemdi de 1-3 h antes de la cosecha, y el uso colcemid a una concentración final de 10 ug / ml. Sin embargo, la inclusión de una etapa de pretratamiento colcemid puede alterar la longitud de...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Anti-BrdU-FITC </td><td> Roche Millipore </td><td> 11202593001 MAB326F </td><td> 50 g / l </td></tr><tr><td> Nick Translation Kit </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 07J00-0001 </td><td></td></tr><tr><td> Spectrum Orange dUTP </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 02N33-050 </td><td></td></tr><tr><td> CEP </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> Varía </td><td></td></tr><tr><td> LSI / WCP tampón de hibridación </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 06J67-011 </td><td></td></tr><tr><td> CEP tampón de hibridación </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 07J36-001 </td><td></td></tr><tr><td> Cromosoma paints </td><td> Metasistemas Grupo </td><td> D-14NN-050-TR </td><td></td></tr><tr><td> Olympus BX61 microscopio de fluorescencia </td><td> Olimpo </td><td> BX61TRF-1-5 </td><td></td></tr><tr><td> Imágenes de microscopio software del sistema </td><td> Applied Imaging </td><td> Cytovision 3.93.1 </td><td></td></tr><tr><td> Cámara Digital </td><td> Olimpo </td><td> UCMAD3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> En las recetas de hibridación in situ Soluciones Formamida 70% Formamide/2x SSC 35 ml * La formamida (Sigma) 10 ml de 10x SSC 5 ml d 2 H 2 0 pH a 7,0 con HCl (Sigma) * Es importante utilizar formamida que se ha almacenado a -20 ° C. El almacenamiento prolongado temperatura ambiente va a generar ácido fórmico y el pH wenfermedad sea demasiado baja. 50% Formamide/2x SSC 25 ml de formamida (Sigma) 10 ml de 10x SSC 15 ml dH 2 O pH a 7,0 con HCl (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g de NaCl (Sigma) 358 g Citrato de Na (Sigma) dH 2 O al volumen PN Buffer [0,1 M NaP0 4 0,1% NP_40 (Sigma)] Hacer una solución 0,1 M de cada uno de fosfato de sodio (Filtro de esterilizar y almacenar en alícuotas de 500 ml). 0,1 M NaH 2 P0 4, 1 L 13,8 g NaH 2 P0 4 (Sigma): dH 2 O al volumen 0,1 M NaH 2 P0 4 1 L </strong&gt; 14,2 g NaH 2 P0 4 (Sigma) dH 2 O al volumen. PN: Ajustar el pH de 0,1 M Na 2 HP0 4 a pH 8,0 con 0,1 M NaH 2 P0 4. Esterilizar por filtración y se añade 1 ml de NP-40. PNM 50 ml 1,25 g leche descremada seca (Sigma) 25 ml tampón de PN (receta anterior) Mezclar durante 15-20 min con agitación constante. Girar 2 veces a 400 xg durante 10 min. Utilice sobrenadante, y asegúrese de no molestar a las proteínas precipitadas leche. </td></tr></tbody></table>

replicación del cromosoma timing combinado con fluorescente<em&gt; in situ</em&gt; la hibridación

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

La replicación del ADN de mamíferos se inicia en varios sitios a lo largo de los cromosomas en diferentes momentos durante la fase S, siguiendo un programa de repetición temporal. La especificación de la sincronización de replicación se cree que es un proceso dinámico regulada por señales específicas de tejido y de desarrollo que son sensibles a las modificaciones epigenéticas. Sin embargo, los mecanismos que regulan dónde y cuándo se inicia la replicación del ADN a lo largo de los cromosomas sigue siendo poco conocida. Los cromosomas homólogos suele replicar de forma sincrónica, sin embargo, hay excepciones notables a esta regla. Por ejemplo, en células de mamífero hembra uno de los dos cromosomas X se convierte tarde replicación a través de un proceso conocido como inactivación X 1. Junto con este retraso en el tiempo de replicación, estimado en 2-3 horas, la mayoría de los genes se transcriptionally silenciados en un cromosoma X. Además, un discreto de acción en cis locus, conocido como el centro de la inactivación X, regula este proceso de inactivación X, incluyendo the inducción de la replicación de temporización retardada en el cromosoma X inactivo completo. Además, ciertos reordenamientos cromosómicos que se encuentran en las células cancerosas y en células expuestas a la radiación ionizante mostrar un retraso significativo en el tiempo de replicación de&gt; 3 horas que afecta a todo el cromosoma 2,3. Trabajos recientes de nuestro laboratorio indican que la interrupción de discreta actuación cis resultado autosómica loci en un fenotipo de replicación muy tarde que afecta al 4 cromosoma entero. Estudios adicionales de ingeniería de cromosoma &#39;indican que los reordenamientos cromosómicos que afectan a los cromosomas diferente resultado, muchos en este momento la replicación anormal fenotipo, lo que sugiere que todos los cromosomas de mamíferos contienen discretas que actúan en cis loci que controlan la sincronización correcta replicación de los cromosomas 5. Aquí, se presenta un método para el análisis cuantitativo de la replicación del cromosoma de temporización en combinación con hibridación in situ fluorescente. Estamétodo permite una comparación directa de la replicación de temporización entre cromosomas homólogos en la misma célula, y se adaptó a partir de 6. Además, este método permite la identificación inequívoca de los reordenamientos cromosómicos que se correlacionan con cambios en el plazo que afectan a la replicación de todo el cromosoma. Este método tiene ventajas sobre el reciente desarrollo de alto rendimiento micro-array o secuenciación protocolos que no pueden distinguir entre homólogos alelos presentes en reordenar y reorganizar un-cromosomas. Además, debido a que el método descrito aquí evalúa las células individuales, se puede detectar cambios en el tiempo de replicación en el cromosoma reordenamientos cromosómicos que están presentes en sólo una fracción de las células en una población.

Un ejemplo del análisis de tiempo de replicación para el cromosoma 6 humano se muestra en la Figura 2. Las células que contienen una deleción del gen ASAR6 4, que se encuentra en 6q16.1, fueron expuestos a BrdU durante 5 h, se recogieron las células mitóticas y para peces con una sonda de cromosoma pintura 6 (Vysis) y para la incorporación de BrdU. Observe que no hay una diferencia significativa en el patrón de BrdU de bandas entre los dos 6, que es coherente con un retraso en el tiempo de re...

Un método cuantitativo para el análisis de sincronización cromosoma replicación se describe. El método utiliza la incorporación de BrdU en combinación con fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Hibridación (FISH) para evaluar el tiempo de replicación de los cromosomas de mamíferos. Esta técnica permite la comparación directa de los cromosomas reordenados y reordenados ONU-dentro de la misma célula.

Replicación del cromosoma Timing Combinado con fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Este enfoque experimental combina la incorporación de BRDU con hibridación fluorescente in situ. Para analizar cuantitativamente el momento de replicación de los cromosomas de mamíferos. Primero, incorpore BRDU en células vivas y aísle los cromosomas en metafase.Luego, realice una hibridación fluorescente in situ de ADN combinada con tinción secuencial con anticuerpo contra BRDU para identificar los cromosomas individuales en replicación. A continuación, utilice microscopía fotográfica para capturar imágenes de las señales de hibridación y la incorporación de BRDU en figuras mitóticas individuales. Mediante el software Cyto Vision, calcule el área e intensidad de los píxeles representados por las señales de BRDU o DAPI en cada cromosoma aislado.Los resultados pueden cuantificar y comparar la incorporación de BRDU en cromosomas reorganizados individuales y sus holos. Dado que el método descrito aquí evalúa células individuales, tiene la capacidad de detectar cambios en la replicación y en el momento de las reorganizaciones cromosómicas que están presentes solo en una fracción de las células de una población, en comparación con los protocolos recientemente desarrollados de microarreglos y secuenciación de ADN de alto rendimiento. Este método permite una comparación directa de cromosomas homólogos que se encuentran dentro de la misma célula.También tiene la capacidad de identificar de manera inequívoca reordenamientos cromosómicos que afectan la replicación del cromosoma. El momento de todo el cromosoma que demuestra el procedimiento será Leslie Smith. Un investigador asociado en mi laboratorio siembre las células a aproximadamente 70% de confluencia en un recipiente de cultivo tisular de 150 milímetros y colóquelas en un incubador de células durante 24 horas al tiempo apropiado.Puntos anteriores a la recolección. Reponga el medio con medio completo fresco que contenga 10 microgramos por mililitro de BRDU. El tiempo de duración durante el cual las células se cultivan en medio con BRDU variará según el tipo celular y la especie.Típicamente, la fase G2 dura entre dos y cinco horas. Retire el medio de cultivo de la placa, guardando 10 mililitros en un tubo cónico de centrífuga de 15 mililitros. Lave las células con 10 mililitros de tampón y elimine el tampón restante mediante aspiración al vacío.Luego, agregue cinco mililitros de tripsina al 0,25 % e incube a temperatura ambiente hasta que las células se desprendan de la placa. Recoleccione las células y transfiera la suspensión a los 10 mililitros de medio reservado. Pelote las células mediante centrifugación y aspire todo excepto 0,5 mililitros del medio.Ahora, resuspenda completamente las células utilizando una pipeta para hincharlas osmóticamente; agregue tres gotas de cloruro de potasio 75 milimolar calentado a 37 grados Celsius y mezcle la suspensión celular con una pipeta. Luego, incorpore un volumen adicional de 0,5 mililitros de solución hipotónica. A continuación, complete hasta un volumen total de cinco mililitros con solución hipotónica y mezcle mediante pipeteo.Incube la suspensión celular a 37 grados Celsius durante 20 a 45 minutos, según el tipo de célula. Incube los tubos en posición inclinada para mantener las células en suspensión. Luego, centrifugue a 400 × g durante 10 minutos.Aspire todo excepto 0,5 milímetros del sobrenadante y utilice una pipeta Pasteur para resuspender suavemente la pastilla celular. En este punto, las células hinchadas osmóticamente serán frágiles, por lo que se debe tener cuidado de no alterar las membranas citoplasmáticas. A continuación, agregue tres gotas de carnoys, fijador, y mezcle suavemente.Después de incorporar 0,5 mililitros adicionales de fijador, complete el volumen de fijador hasta cinco mililitros y pipetee para obtener una suspensión homogénea de células. Estas células fijadas pueden almacenarse a oscuras a menos veinte grados Celsius durante varios meses. Recoga las células fijadas mediante centrifugación, aspire el fijador y resuspenda el sedimento en 10 volúmenes de fijador mantenido sobre hielo frío para microscopio.Deslice aproximadamente a un ángulo de 45 grados. Agregue la suspensión celular gota a gota para extender la suspensión. Inunde la lámina con fijador y elimine el exceso.Luego, coloque el portaobjetos horizontalmente sobre toallas de papel para que se seque al aire. Evalúe las muestras en busca de la presencia de extensiones mitóticas utilizando un microscopio invertido. Añada dos microlitros de RNAsa A al 10 microgramos por mililitro en dos XSSC a cada portaobjetos e incube a 37 grados Celsius durante una hora.Realice tres lavados de tres minutos con dos XSSC pH 7,0 a temperatura ambiente. Luego deshidrate las muestras mediante una serie de etanol a temperatura ambiente durante tres minutos. A continuación, seque al aire cada muestra a temperatura ambiente en un tubo microcentrífugo enfriado.Agregue cuatro microgramos de sustrato de ADN con nucleótido marcado, tampón de traducción NIC 10 X, mezcla de dNTP y enzima de traducción NIC. Incube la reacción a 16 grados Celsius durante la noche, luego caliente a 70 grados Celsius durante 10 minutos para detener la reacción. A continuación, enfríe en hielo durante cinco minutos.Ahora, para precipitar el ADN con etanol, agregue 48 microlitros de acetato de sodio tres molar, 160 microlitros de ADN 1D capturado a 0,25 microgramos por microlitro y 1,2 mililitros de etanol al 100 %. Almacene la muestra a 80 grados Celsius negativos durante 10 minutos hasta la precipitación nocturna del ADN mediante centrifugación, lave el precipitado con etanol al 70 % y re suspenda la sonda de ADN seca al aire en 40 microlitros de agua doblemente destilada para obtener una concentración final de 100 nanogramos por microlitro de ADN marcado para la hibridación simultánea de retro SEP. Prepare dos cócteles de sonda separados que contengan cot ADN 1D según se detalla en el manuscrito adjunto.Deshidrate las mezclas de sondas a 75 grados Celsius durante 10 minutos. Luego incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos para bloquear el ADN cot 1 con las secuencias repetitivas. Ahora combine la sonda de bloqueo con la sonda S en una proporción de tres a dos, utilizando 25 microlitros por muestra.Deslice al lado para desnaturalizar las muestras. Sumerja los portaobjetos en formamida al 70 % y dos SSC a 72 grados Celsius e incube durante tres minutos. Deshidrate inmediatamente las muestras mediante una serie de etanol a cuatro grados Celsius durante tres minutos.Deje secar al aire cada muestra a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos antes de finalizar la preparación de la sonda. Equilibre los portaobjetos en un calentador de portaobjetos a 45 grados Celsius. A continuación, agregue 25 microlitros de la mezcla de sonda back S.Coloque suavemente una cubreobjetos sobre cada portaobjetos y selle todos los bordes con cemento de goma para la etapa de hibridación. Incube las muestras durante la noche a 37 grados Celsius en una cámara humedecida. Realice tres lavados posteriores a la hibridación de tres minutos cada uno en 50%IDE dos XSSC pH 7,0 a 38-40 grados Celsius.La temperatura óptima de los lavados depende de la sonda. Si hay una hibridación con fondo elevado, aumente la temperatura de los lavados. Por el contrario, si la señal de la sonda es débil y no hay fondo, disminuya la temperatura de los lavados.Realice un lavado en tampón PN a temperatura ambiente durante tres minutos. Para la detección de BRDU, agregue 200 microlitros de tampón bloqueador PNM a cada portaobjetos. Incube durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad y drene los portaobjetos sobre una toalla de papel.Luego, agregue 100 microlitros de anticuerpo conjugado anti B-R-D-U-F-E a 50 microgramos por mililitro e incube durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Realice tres lavados de tres minutos en tampón PN a temperatura ambiente. Retire el exceso de tampón PN de cada portaobjetos.Luego, agregue 20 microlitros de solución de montaje dappy Antifa. Cubra el portaobjetos con una toalla de papel y presione sobre el cubreobjetos para expulsar las burbujas de aire y el exceso de solución de montaje. Capture las imágenes con un microscopio de fluorescencia acoplado a una cámara CCD.Utilice el objetivo de 100x, la rueda de filtros automática y el software Cyto Vision para capturar BRDU mediante un filtro fitzy, y las pinturas cromosómicas y las sondas centroméricas mediante un filtro side three o Texas red. Asimismo, utilice un filtro dappy para la tinción de núcleos. Identifique los cromosomas individuales de interés con sondas de pintado EP o específicas para cromosomas mediante el software Cyto Vision.Corte cada cromosoma de interés del extendido metafásico en su totalidad. Copie y pegue las imágenes cromosómicas de DPI y FITZY en una nueva ventana. Seleccione el icono de gráfico en el menú de herramientas, que permite generar un gráfico que represente el área e intensidad de las tinciones Fitz y dappy a lo largo de cada cromosoma individual.Esto se realiza trazando una línea a lo largo del cromosoma, desde el brazo corto hasta el brazo largo. En el menú de herramientas, seleccione el icono de datos y genere una tabla que muestre el área calculada y la intensidad para ZI y dpi. A continuación, seleccione las señales ZI y DPI para los cromosomas de interés.Luego, haga clic en los botones de intensidad y área en el icono de tabla. El software genera una medición numérica de píxeles por pulgada cuadrada para cada señal. A continuación, la intensidad promedio de píxeles de cada cromosoma se multiplica por el área ocupada por esos píxeles.Para obtener el número total de píxeles para la visualización de las regiones cromosómicas que se replican más tarde, evalúe el patrón de bandeo de la incorporación de BRDU en las regiones cromosómicas que se replican activamente. Luego, calcule las diferencias en el momento de replicación entre pares de cromosomas en función de las diferencias en el patrón de bandeo de BRDU. Los cromosomas en las células de mamíferos se replican según un programa temporal, en el que la replicación temprana y tardía ocurre al principio y al final de la fase S, respectivamente.Un sase típico en células de mamífero dura de ocho a 10 horas, y la G dos suele durar de dos a cinco horas. En este sistema experimental, se añade BRDU durante períodos de tiempo crecientes para marcar las últimas porciones de los cromosomas que se replican; estas células contienen una deleción del gen humano asa R seis localizado en el 6 Q 16.1. Tras un tratamiento de cinco horas con BRDU, se recolectaron las células mitóticas y se procesaron para detectar la incorporación de BRDU y la hibridación fluorescente in situ mediante una sonda marcadora del cromosoma seis; los dos cromosomas seis muestran tres etiquetas fluorescentes.La diferencia significativa en el patrón de bandeo de BRDU es consistente con el retraso en el momento de replicación de más de dos horas para uno de los cromosomas seis. El software Cyto vision muestra los perfiles de intensidad de señal diferentes para DPI y BRDU en los dos cromosomas seis, lo que indica una replicación asincrónica. Además, existe una diferencia significativa en la cantidad total de incorporación de BRDU en comparación con un análisis similar de la tinción con DPI.La inclusión de una sonda inversa que contiene el gen AR seis humano resalta el cromosoma seis único que presenta una deleción en su brazo largo en esta célula. Curiosamente, hay una incorporación de BRDU más intensa y un patrón de bandeo más extendido de la incorporación de BRDU en comparación con el cromosoma seis no-ED. Cuando se procesaron preparaciones de metafase de siete células diferentes para la cuantificación de la diferencia en el momento de replicación entre los cromosomas seis.Los niveles de BRDU muestran una diferencia mayor a dos veces entre los valores totales de píxeles para los cromosomas seis eliminados y los no ED. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse correctamente en tres días. Esperamos que ahora tenga una buena comprensión de cómo medir la replicación, el momento de los cromosomas homólogos ubicados dentro de la misma célula y cómo identificar sin ambigüedades las reordenaciones cromosómicas que se correlacionan con alteraciones en la replicación.Temporización de cromosomas completos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Fuente: Schumacher, D., y Sogaard-Andersen, L. Imagen de células vivas con fluorescencia del ciclo celular vegetativo completo de la bacteria social de crecimiento lento Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demuestra el uso de imágenes de células vivas para rastrear los orígenes cromosómicos marcados con fluorescencia durante la división celular bacteriana. Captura la dinámica de segregación cromosómica utilizando microscopía de contraste de fase en time-lapse y fluorescencia.

Imagen en lapso de tiempo de la segregación cromosómica en bacterias marcadas con fluorescencia

La hibridación fluorescente in situ (FISH) permite la detección de ácidos nucleicos en su ambiente nativo dentro de las células. Se describen un protocolo para el combinado, la detección simultánea de ARN y ADN por medio de pescado, que se puede utilizar para estudiar inactivación del cromosoma X en las células madre embrionarias de ratón.

ADN-ARN combinado fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH) para el Estudio de inactivación del cromosoma X en las células madre embrionarias de ratón Diferenciada Mujer

Desarrollamos un protocolo de hibridación fluorescente in situ (FISH) fluorescente específico de cadena fácilmente personalizable combinado con inmunofluorescencia. Esto permite un examen detallado de la dinámica del ARN con información simultánea sobre la estructura de la cromatina, la organización nuclear y la regulación transcripcional a nivel de célula individual.

Fluorescente Rápida In Situ Protocolo de hibridación para Xist ARN combinado con inmunofluorescencia de histona Modificación de inactivación del cromosoma X.

Aquí, presentamos un método simple para realizar la hibridación in situ de ADN fluorescente (DNA ISH) para visualizar secuencias heterocromáticas repetitivas en cromosomas montados en portaobjetos. El método requiere reactivos mínimos y es versátil para su uso con sondas cortas o largas, diferentes tejidos y detección con señales basadas en fluorescencia o no fluorescencia.

Método simple de ADN de fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridación a los cromosomas aplastado

Describimos aquí un sistema que utiliza un bloque de proteínas in vivo reversible y específico del sitio para detener y colapsar las horquillas de replicación en Escherichia coli. El establecimiento del bloque de replicación se evalúa mediante microscopía de fluorescencia y se utiliza electroforesis en gel de agarosa en 2 dimensiones neutro-neutro para visualizar los intermedios de replicación.

Induciendo un bloqueo de replicación de sitios en específico<i&gt; E. coli</i&gt; El uso de un sistema fluorescente represor operador

El RNA se describe en situ hibridación protocolo permite la detección de RNA en todo Drosophila embriones o tejidos disecados. Utilizando placas de microtitulación de 96 pocillos y amplificación de la señal tyramide, transcripciones pueden ser detectadas en el rendimiento, sensibilidad y alta resolución y a un costo relativamente bajo.

Alta resolución fluorescente In Situ hibridación en embriones de Drosophila y tejidos utilizando amplificación de la señal de Tyramide

Este manuscrito presenta un detallado método para la generación X-cromosoma brazo sondas y rendimiento en situ hibridación de la fluorescencia (pescado) para examinar el estado de la hermana cohesión de cromátidas hermanas en Prometafase y metafase detenido  Drosophila ovocitos. Este protocolo es adecuado para determinar si cohesión brazo meiótica es intacta o interrumpida en diferentes genotipos.

Con fluorescencia In Situ hibridación (pescado) para supervisar el estado de la cohesión de brazo en Prometafase y metafase I ovocitos de Drosophila

Esta sola molécula fluorescencia en situ hibridación protocolo está optimizado para cuantificar el número de moléculas de ARN en levadura de florecimiento durante la meiosis y crecimiento vegetativo.

Sola molécula fluorescencia In Situ hibridación (smFISH) análisis de florecimiento levadura crecimiento vegetativo y la Meiosis

Este protocolo describe una aplicación de hibridación in situ de fluorescencia de una sola molécula (smFISH) para medir la cinética in vivo de la síntesis y degradación del ARNm.

Sondeo de mRNA cinética en el espacio y el tiempo en Escherichia coli usando hibridación de fluorescencia de una sola molécula de dos colores

Este protocolo ilustra un sistema de dimerización de proteínas inducido químicamente para crear condensados en la cromatina.  Se demuestra la formación del cuerpo nuclear de la leucemia promielocítica (LMP) en telómeros con dimerizadores químicos. El crecimiento, la disolución, la localización y la composición de las gotas se controlan con imágenes de células vivas, inmunofluorescencia (IF) e hibridación fluorescente in situ (FISH).

Condensados de proteínas inducidas por dimerización química en telómeros

Este protocolo presenta una técnica para el mapeo de alta resolución de sitios de replicación en cromatina estructuralmente preservada in situ que emplea una combinación de etiquetado EdU-streptavidin-Nanogold preincrustante y ChromEMT.

Imágenes de dominios replicativos en cromatina ultraestructuralmente preservada por tomografía electrónica

Aprende a analizar cuantitativamente el tiempo de replicación cromosómica en células mamíferas mediante la incorporación de BrdU y la hibridación in situ fluorescente. Este método permite comparar directamente cromosomas rearrangados y normales.

Replicación del cromosoma Timing Combinado con fluorescente

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