Replicación del cromosoma Timing Combinado con fluorescente In situ La hibridación

Este enfoque experimental combina la incorporación de BRDU con la hibridación fluorescente en C dos. Analizar cuantitativamente el tiempo de replicación de los cromosomas de los mamíferos. Primero, incorpore BRDU en células vivas y recoja los cromosomas de la metafase.

A continuación, se realiza la combinación de peces de ADN con la tinción secuencial de anticuerpos BRDU para identificar los cromosomas replicantes individuales. A continuación, utilice la fotomicroscopía para capturar imágenes de las señales de los peces y la incorporación de BRDU en figuras mitóticas individuales. Utilizando el software de visión por cito, calcule el área y la intensidad de los píxeles representados por las señales BRDU o DPI en cada cromosoma aislado.

Los resultados pueden cuantificar y comparar la incorporación de BRDU en cromosomas individuales reordenados y sus hologramas. Debido a que el método descrito aquí evalúa células individuales, tiene la capacidad de detectar cambios en la replicación, sincronizando los reordenamientos cromosómicos que están presentes en solo una fracción de las células de una población en comparación con los protocolos de secuenciación de ADN y microarrays de alto rendimiento desarrollados recientemente. Este método permite una comparación directa de cromosomas homólogos que residen dentro de la misma célula.

También tiene la capacidad de identificar sin ambigüedades los reordenamientos cromosómicos que afectan a la replicación cromosómica. El momento de los cromosomas completos que demuestren el procedimiento será Leslie Smith. Un investigador asociado en mi laboratorio Siembre las células a aproximadamente el 70% de confluencia en una placa de cultivo de tejidos de 150 milímetros y colóquelas en una incubadora de células durante 24 horas en el momento apropiado.

Puntos previos a la recolección. Reponga el medio con medio completo nuevo que contenga 10 microgramos por mililitro. BRDU. La cantidad de tiempo que las células se cultivan en medios con BRDU variará según el tipo de célula y la especie.

Por lo general, la fase G bifásica es de entre dos y cinco horas. Retire el medio de cultivo de la placa ahorrando 10 mililitros en un tubo de centrífuga cónico de 15 mililitros. Enjuague las células con 10 mililitros de seno y elimine el seno restante por aspiración endouterina.

A continuación, añade cinco mililitros de tripsina al 0,25% e incuba a temperatura ambiente hasta que las células se desprendan de la placa. Coseche las células y transfiera la suspensión a los 10 mililitros de medios reservados. Granular las células por centrifugación, aspirar todo menos 0,5 mililitros del medio.

Ahora resus suspende las células a fondo usando un pasado de pipeta para hinchar osmóticamente las células, agrega tres gotas de cloruro de potasio de 75 milimolares calentado a 37 grados centígrados, y mezcla la suspensión celular con un pasado de pipeta. A continuación, incorpore 0,5 mililitros adicionales de solución hipotónica. Ahora lleve el volumen total de la solución hipotónica a cinco mililitros y mezcle mediante pipeteo.

Incubar la suspensión celular a 37 grados centígrados durante 20 a 45 minutos, dependiendo del tipo de célula. Incuba los tubos inclinados para mantener las células en suspensión. A continuación, centrifugar a 400 veces G durante 10 minutos.

Aspire todo menos 0,5 milímetros del sobrenadante y utilice una pipeta de agitación pasada para resusar suavemente la paleta de celdas. Las células osmóticamente hinchadas serán frágiles en este punto, por lo que se debe tener cuidado de no alterar las membranas citoplasmáticas. A continuación, añade tres gotas de ruido de coche, fijador y mezcla suavemente.

Después de incorporar 0,5 mililitros adicionales de fijador, lleve el volumen de fijador a cinco mililitros y pipetee hasta obtener una suspensión celular homogénea. Estas células fijas pueden almacenarse en la oscuridad a 20 grados centígrados negativos durante varios meses. Recoja las células fijadas por centrifugación, aspire el fijador y vuelva a suspender el pellet en 10 volúmenes de fijador sosteniendo un microscopio húmedo y helado.

Deslice en un ángulo de aproximadamente 45 grados. Agregue la suspensión celular gota a gota para extender la suspensión celular. Inundar el portaobjetos con fijador y escurrir el exceso.

Luego, coloque el portaobjetos plano sobre toallas de papel para que se seque al aire. Evalúe las muestras para detectar la presencia de diseminaciones mitóticas utilizando un microscopio invertido. Agregue dos microlitros de ARN A de 10 microgramos por mililitro en dos XSSC a cada portaobjetos e incube a 37 grados centígrados durante una hora.

Realice tres lavados de tres minutos de dos XSSC pH 7.0 a temperatura ambiente. A continuación, deshidratar las muestras a través de una serie de etanol a temperatura ambiente durante tres minutos. Cada uno seca al aire las muestras a temperatura ambiente hasta obtener un tubo de micro fuga refrigerado.

Agregue cuatro microgramos de nucleótido marcado con sustrato de ADN, tampón de traducción 10 X NIC, mezcla de DNTP y enzima de traducción NIC. Incubar la reacción a 16 grados centígrados, calentar durante la noche a 70 grados centígrados durante 10 minutos para detener la reacción. Luego enfríe en hielo durante cinco minutos.

Ahora, para precipitar el ADN en etanol, agregue 48 microlitros de acetato de sodio de tres molares, 160 microlitros de 0,25 microgramos por microlitro capturado 1D NA y 1,2 mililitros de etanol 100%. Almacene la muestra a menos 80 grados centígrados durante 10 minutos para precipitar el ADN durante la noche por centrifugación y lavar el pellet con etanol al 70%, vuelva a suspender la sonda de ADN secado al aire en 40 microlitros de agua destilada doble para una concentración final de 100 nanogramos por microlitro de ADN retromarcado para la hibridación simultánea de SEP posterior. Prepare dos cunas separadas, 1D NA que contengan cócteles de sonda como se detalla en el manuscrito adjunto.

Desnaturalizar los cócteles de la sonda a 75 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos a la cuna 1D NA a secuencias repetitivas. Ahora combine la sonda trasera con la sonda S en una proporción de tres a dos para 25 microlitros por muestra.

Desliza el dedo junto para desnaturalizar las muestras. Sumerja los portaobjetos en amida al 70% de XSSC a 72 grados centígrados e incube durante tres minutos. Deshidratar inmediatamente las muestras a través de una serie de etanol a cuatro grados centígrados durante tres minutos.

Cada uno seca las muestras al aire a temperatura ambiente unos 10 minutos antes de completar la preparación de la sonda. Equilibre los portaobjetos en un calentador de toboganes de 45 grados centígrados. A continuación, añada 25 microlitros de la mezcla de la sonda S trasera.

En cada portaobjetos, coloque suavemente un cubreobjetos y selle a lo largo de todos los bordes con cemento de caucho para el paso de hibridación. Incubar las muestras durante la noche a 37 grados centígrados en una cámara humidificada. Realizar tres lavados post hibridación de tres minutos cada uno en 50%IDE dos XSSC pH 7.0 a 38 a 40 grados Celsius.

La temperatura óptima de los lavados depende de la sonda. Si hay una alta hibridación de fondo, aumente la temperatura de los lavados. Por el contrario, si la señal de la sonda es débil y no hay fondo, disminuya la temperatura de los lavados.

Realice un lavado en tampón PN a temperatura ambiente durante tres minutos. Para la detección de BRDU, agregue 200 microlitros de tampón de bloqueo PNM a cada portaobjetos. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, escurrir los portaobjetos sobre una toalla de papel.

A continuación, añadir 100 microlitros de 50 microgramos por mililitro de anticuerpo conjugado anti B-R-D-U-F-E e e incubar durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Realice tres lavados de tres minutos en tampón PN a temperatura ambiente. Retire el exceso de tampón PN de cada portaobjetos.

A continuación, añade 20 microlitros de solución de montaje Antifa elegante. Cubra la corredera con una toalla de papel y presione hacia abajo el cubreobjetos para expulsar las burbujas de aire y el exceso de solución de montaje. Capture las imágenes con un microscopio de fluorescencia conectado a una cámara CCD.

Usando el objetivo 100 x y la rueda de filtros automática y el software de visión por citos, Capture BRDU usando un filtro fitzy y las pinturas cromosómicas y las sondas de centrómero usando un filtro de tres lados o rojo de Texas. Utilice también un filtro dappy para la tinción de núcleos. Identifique los cromosomas individuales de interés con sondas de pintura retro EP o cromosómicas específicas en el software de visión citográfica.

Corta cada cromosoma de interés de la metafase extendida como un todo. Copie y pegue las imágenes de los cromosomas DPI y FITZY en una nueva ventana. Seleccione el icono de gráfico en el menú de herramientas, que permite la generación de un gráfico que representa el área y la intensidad de la tinción de Fitz y dappy a lo largo de cada cromosoma individual.

Esto se hace trazando una línea a través de la longitud del cromosoma desde el brazo corto hasta el brazo largo. En el menú de herramientas, seleccione el icono de datos y genere una tabla que muestre el área calculada y la intensidad para ZI y ppp. A continuación, seleccione las señales ZI y DPI para los cromosomas de interés.

A continuación, haga clic en los botones de intensidad y área del icono de la mesa. El software genera una medición numérica de píxeles por pulgada cuadrada para cada señal. A continuación, la intensidad media de píxeles de cada cromosoma se multiplica por el área ocupada por esos píxeles.

Para obtener el número total de píxeles para la visualización de las últimas regiones replicantes de los cromosomas, evalúe el patrón bandido de la incorporación de BRDU para las regiones de replicación activa de los cromosomas. A continuación, calcule las diferencias en el tiempo de replicación entre los pares de cromosomas en función de las diferencias en el patrón de bandas BRDU. Los cromosomas en las células de mamíferos se replican de acuerdo con un programa temporal, con una replicación temprana y tardía que ocurre al comienzo y al final de la fase S, respectivamente.

Una sase típica en células de mamíferos dura de ocho a 10 horas, y G dos suele ser de dos a cinco horas. En este sistema experimental, se añade BRDU durante periodos de tiempo crecientes para etiquetar las últimas porciones de los cromosomas que replican, estas células contienen una deleción del humano como un gen R seis situado en seis Q 16.1. Después de un tratamiento de cinco horas con células mitóticas de BRDU que se recolectaron y procesaron para la incorporación de BRDU y la hibridación fluorescente en C dos utilizando una sonda de pintura del cromosoma seis, los dos cromosomas seis muestran tres etiquetas fluorescentes.

La diferencia significativa en el patrón de bandas BRDU es consistente con el retraso en el tiempo de replicación de más de dos horas para uno de los cromosomas seis. El software Cyto vision representa la diferencia en los perfiles de intensidad de la señal para DPI y BRDU en los dos cromosomas seis, lo que indica una replicación asíncrona. Además, existe una diferencia significativa en la cantidad total de incorporación de BRDU en comparación con un análisis similar de la tinción de DPI.

La inclusión de una sonda trasera que contiene el gen humano como AR seis destaca el único cromosoma seis que contiene una deleción en su brazo largo en esta célula. Curiosamente, hay una incorporación de BRDU más intensa y un patrón de bandas más extendido de incorporación de BRDU que en el cromosoma seis no ED. Cuando se procesaron las diseminaciones mitóticas de siete células diferentes para cuantificar la diferencia de tiempo de replicación entre los cromosomas seis.

Los niveles de BRDU muestran una diferencia de más del doble entre los valores totales de píxeles para los cromosomas seis, eliminados y no ED. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar correctamente en tres días. Esperamos que ahora tenga una buena comprensión de cómo medir la replicación, el tiempo de los cromosomas homólogos que residen dentro de la misma célula e identificar sin ambigüedades los reordenamientos cromosómicos que se correlacionan con las alteraciones en la replicación.

Temporización de cromosomas completos.