Análisis de imágenes de Neuron a la interacción glía en la Plataforma Cultura Microfluidic (MCP)-basada en Axón Neuronal y Sistema Glia Co-cultura

Este protocolo establece una nueva plataforma de cultivo conjunto de axones neuronales y astroglias para analizar las interacciones entre neuronas y astroglias mediante imágenes de alta resolución. Primero, ensamble la cámara de cultivo microfluídica, prepare los cultivos neuronales e induzca a los axones neuronales a ingresar al otro lado de la MCP. A continuación, agregue astrocitos cultivados para establecer un sistema de cultivo conjunto compartimentalizado; los resultados, incluyendo imágenes de lapso de tiempo con microscopía confocal de inmunofluorescencia, pueden ayudar a comprender las interacciones entre axones, astroglias y axones neuronales.

La idea de este método surgió inicialmente al intentar separar el efecto del proceso neuronal frente a la secreción neuronal en la regulación del GT. Por lo general, las personas nuevas en el método tienen dificultades para inducir el axón hacia otra parte del compartimento celular. Esto requiere una alta densidad de neuronas sanas sembradas en el lado neuronal, con las neuronas ubicadas cerca de los canales centrales.

Las cámaras abiertas de MCP están diseñadas para cultivos compartimentalizados de diferentes tipos de células; los recubrimientos de poliuretano y laminina son necesarios para sembrar neuronas y astrocitos en el cultivo conjunto. Primero, aplique una solución de poliuretano de un miligramo por mililitro a las placas con fondo de vidrio estéril y incube a 37 grados Celsius durante la noche. Lave las placas con fondo de vidrio recubierto tres veces con agua doblemente destilada y luego colóquelas bajo una campana estéril para que sequen.

A continuación, recubra el recipiente con laminina al un miligramo por mililitro y seque bajo luz UV durante una hora. El ensamblaje de MCP en el recipiente con fondo de vidrio debe prepararse recién antes de su uso. Coloque la plataforma de cultivo microfluídica con los canales de conexión centrales en su cara inferior y forme un sello hermético con el vidrio recubierto.

Placas inferiores. Añada medios de cultivo de neuronas o astrocitos normales a ambos lados del MCP ensamblado. Incube la cámara durante dos a cuatro horas a 37 grados Celsius y verifique que no haya fugas entre el MCP y el vidrio.

Placa inferior. Los cultivos de células neuronales corticales se preparan recientemente a partir de cerebros de ratón de 14 a 16 días de edad embrionaria. Tras la disección del cerebro del ratón, retire las meninges del cortex bajo el microscopio de disección.

Utilice una cuchilla de afeitar para picar el tejido en pequeños fragmentos y coloque los fragmentos picados en un tubo tras centrifugar. Deseche el medio situado sobre el pellet y añada 0.05% Try durante 10 minutos en un baño de agua a 37 grados Celsius. Disocie las células mediante agitación suave con una pipeta de vidrio Pasteur flameada.

Pase la muestra a través de un filtro de 70 micrones para obtener una suspensión clara de células neuronales utilizando el plaqueado de neuronas. Siembre en medio suplementado con 5 % de suero bovino fetal (FBS). Coloque 150 microlitros de neuronas en el lado derecho de la placa MCP ensamblada.

Una alta densidad de neuronas, ya que solo las neuronas que se adhieren en el área de retención celular son capaces de desarrollar axones a través de los canales centrales hacia el otro lado del MCP ensamblado. Al día siguiente, aspire cuidadosamente el medio del área de siembra celular de la cámara y sustituya el medio de siembra de neuronas por medio de cultivo neuronal regular.

Medio, agregue 20 nanogramos por mililitro de factor neurotrófico derivado de células gliales o GDNF al lado de los astrocitos de la cámara. Esto crea un gradiente químico que ayudará a inducir el crecimiento de axones desde el lado neuronal a través de los canales centrales del MCP ensamblado. Dos días después, supervise la entrada de axones en el canal central.

Una vez que los axones entran en el canal central, normalmente pasan al otro lado en un plazo de un día. Los axones suelen mantenerse íntegros durante al menos una semana después de pasar al otro lado. Disocié el cerebro de P y sembré astrocitos de uno a tres ratones en placas de 10 centímetros recubiertas con poliuretano.

Cultivo, las células reponen diariamente el medio de cultivo de astrocitos durante los dos días siguientes y luego cada tres días tras siete días, cuando los astrocitos han formado una monocapa confluente al 90 %, recolecte las células usando tripsina. Aproximadamente cinco días después de sembrar las neuronas, aspire el GDNF. Luego siembre 150 microlitros de los astrocitos resuspendidos en el lado izquierdo del MCP ensamblado. Cuando los axones están a punto de entrar o acaban de entrar, tras el resembrado de los astrocitos, los axones que ingresan al lado izquierdo del MCP ensamblado interactúan directamente con los astrocitos, ya sea mediante contacto axonal directo o mediante la liberación de factores solubles.

Observe los astrocitos para verificar su adhesión al área de retención celular. Inmunoetiquete las células en el sistema de cultivo co-cultivo compartimentalizado para visualizar proteínas específicas, como aquellas implicadas en la interacción entre los axones y los astrocitos. El sistema de co-cultivo compartimentalizado de neuronas y astrocitos permite que únicamente los procesos neuronales, especialmente los axones, interactúen selectivamente con los astrocitos.

Aquí describimos la activación transcripcional inducida por axones del transportador de glutamato en astrocitos. Estos estudios utilizan ratones transgénicos que albergan la expresión de un reportero fluorescente de EGF bajo el control del promotor genómico GT uno. Se cultivan neuronas a alta densidad en el área de retención celular; la vista ampliada del MCPA muestra los axones cruzando los canales centrales e ingresando al otro lado, con la tinción de beta tres tubulina revelando el cono de crecimiento axonal.

El sistema MCP permite el monitoreo de los haces de axones mientras crecen a través del canal central e ingresan al otro lado. La tinción inmunológica para GT1 identifica astrocitos en el lado glial del sistema MCP. La imagen muestra el contacto entre axones y astrocitos positivos para GLT1 aquí.

La expresión del gen reportero EGFP se correlaciona con la activación del promotor endógeno de GT uno, la expresión proteica y la actividad funcional. La evaluación de la actividad del promotor de GT uno en astrocitos individuales en C dos muestra una inmunorreactividad GLT uno significativamente aumentada en el sistema de cultivo en compartimentos. Importante, el sistema MCP permite imágenes de lapso de tiempo para monitorear los cambios dinámicos.

Por ejemplo, estos datos muestran la activación del promotor GT uno inducida por axones con retrotransfección GT uno EGFP en astrocitos y neuronas de tipo silvestre un día después del sembrado de los astrocitos. Mínimamente, se observa fluorescencia EGFP. La intensidad EGFP aumenta significativamente 48 horas después del cultivo conjunto, cuando los axones ya han penetrado considerablemente en el lado de los astrocitos e interactúan contactando directamente con ellos aquí.

El tratamiento con quinina en el lado neuronal del MCP ensamblado indujo la muerte celular neuronal. Curiosamente, también estimuló la retracción y degeneración axonal, así como la disminución de la fluorescencia axonal de EGFP. Estos cambios dinámicos en la intensidad de la fluorescencia de EGFP en respuesta a los axones demostraron claramente que la actividad del promotor Astroglia GT uno está modulada por la interacción con los axones.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo establecer el sistema de cultivo básico utilizando la plataforma de cultivo microfluídica; una vez dominada, esta técnica puede realizarse correctamente en unos pocos días.