Estudio del Checkpoint Daño del ADN utilizando

El objetivo general de este procedimiento es investigar el punto de control de daño en el ADN utilizando extractos de óvulos de xip como sistema modelo. Primero, prepare un extracto de baja velocidad a partir de óvulos de xip. Luego, prepare cromatina de espermatozoides dañada mediante métodos que induzcan daño en el ADN, como MMS y luz UV.

Prepare también la estructura que imita el daño en el ADN. Un T 70 procede a activar el punto de control del daño en el ADN en el LSE con la cromatina espermática dañada o con un T 70. En última instancia, los resultados de los blot pueden proporcionar información sobre el punto de control del daño en el ADN mediado por un TR en el extracto de huevo de Xenopus.

Hola. Soy CH Y del departamento de biología de la UNC Charlotte. Hoy les mostraremos cómo se utiliza el extracto de pus como sistema modelo para investigar la señalización del punto de control de daño.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inestabilidad dinámica, como la forma en que se activa el punto de control de daño D. Este protocolo describe la preparación de extracto de óvulos opus y reactivos que inducen el punto de control de daño en el ADN, así como el análisis del punto de control de daño en el ADN y xap. Estas técnicas son adaptables a una variedad de enfoques que dañan el ADN, incluyendo cuatro NQO y etopósido.

Para estudiar el punto de control del daño en el ADN, comencemos. Para inducir primariamente a las hembras de Xenopus laevis, inyecte los sacos linfáticos dorsales subcutáneamente con 100 unidades de PMSG. Después de esperar un mínimo de dos días tras la inducción primaria, induzca la puesta de huevos inyectando a cada rana tratada 500 unidades de gonadotropina coriónica humana subcutáneamente en el saco linfático dorsal. Incube las ranas inyectadas durante 14 a 20 horas en recipientes separados que contengan dos litros de solución de Ringer modificada de Marc.

Retire los renacuajos de los recipientes y vierta la solución MMR hasta que queden aproximadamente 100 mililitros. Luego transfiera los huevos de los recipientes a un vaso de precipitados de 250 mililitros y deshaga el gelatina de los huevos añadiendo 100 mililitros de cisteína al 2% pH 7,8 aproximadamente cada 30 segundos. Agite suavemente los huevos con una pipeta de Pasteur de vidrio invertida de 0,7 centímetros de diámetro, vierta y reemplace con cisteína fresca dos veces.

El proceso de eliminación de detalles estará completo en aproximadamente cinco a quince minutos. Cuando los huevos formen una capa más condensada en el fondo del vaso de precipitados, después de desechar la solución de cisteína, lave los huevos tres veces con solución 0.25 XMMR. Agite los huevos con una pipeta de vidrio e inspeccione la presencia de huevos malos blancos e hinchados que tienden a acumularse en el centro del vaso de precipitados.

Retire los huevos dañados con una pipeta de Pasteur. A continuación, lave los huevos tres veces con tampón de lisis de huevo. Elimine cualquier huevo dañado adicional y luego vierta los huevos en un tubo cónico de 14 mililitros.

Compacte los huevos mediante centrifugación durante 55 segundos a 188 veces G. Utilizando una centrifugadora clínica de mesa con rotor de cubeta oscilante, retire el exceso de puffer por encima de la capa de huevos. Ahora, por cada mililitro de huevos compactados, añada 0,5 microlitros de aprotinina, leptina o AL a 10 miligramos por mililitro y 0,5 microlitros de citocina B o cyto B a 5 miligramos por mililitro, y centrifugue los huevos a 16.500 veces G durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Utilizando la centrifugadora superveloz Sarva RC seis plus con rotor HB seis de cubeta oscilante, tras la centrifugación, los componentes se fraccionan en tres capas en el tubo: extracto lipídico y pigmento de yema desde la parte superior hacia la inferior, respectivamente. Perfore el lateral del tubo falcon en la porción inferior de la capa media de extracto con una aguja de calibre 21.

Retire cuidadosamente la aguja, ya que la aguja de punción podría obstruirse con plástico. Inserte una aguja nueva de calibre 21 conectada a una jeringa de un mililitro en el sitio de punción. Para recolectar el extracto.

Aspire lentamente el extracto, evitando burbujas de aire y contaminación con las capas de lípidos y pigmento de yema. Transfiera los extractos a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros enfriado. Por cada mililitro de extracto de huevo, agregue 10 microlitros de 10 miligramos por mililitro.

Cicloheximida: un microlitro de 10 miligramos por mililitro. Una pronina leptina, un microlitro de cinco miligramos por mililitro de citocina B, un microlitro de DTT uno molar y 0,33 microlitros de 10 miligramos por mililitro. Ole se mezcla invirtiendo suavemente el extracto de huevo al menos diez veces. Sin embargo, el extracto de baja velocidad debe usarse dentro de cuatro horas, ya que la calidad del LSE se ve comprometida.

Después de cuatro horas o un deshielo libre, disuelva los dos oligonucleótidos sintéticos en agua a una concentración de dos microgramos por microlitro. Añada 100 microlitros de cada oligo a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros e incube durante cinco minutos en un bloque térmico a 95 grados Celsius. Retire el bloque seco con el tubo que contiene la mezcla de oligos y deje enfriar a temperatura ambiente; alícuotas de 10 microlitros para almacenar a menos 20 grados Celsius.

La muestra de AL es ahora un dúplex A T 70 a una concentración final de dos microgramos por microlitro. Prepare cromatina de esperma normal según lo descrito por Tudor y Walter hasta 0,5 mililitros de cromatina. Añada 5,5 microlitros de MMS 9,1 molar.

Coloque el tubo de muestra en un rotador a temperatura ambiente durante 30 minutos utilizando la centrífuga clínica IE CCL dos con rotor de cubeta oscilante y adaptadores de tubos. Centrifugue la muestra a 686 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y lave el sedimento en 0,5 mililitros de tampón X que contiene B-S-A-D-T-T-A proin y leptina.

Repita este proceso tres veces y re suspenda el precipitado en 0,5 mililitros. Buffer x. Determine la concentración de cromatina espermática con un hemocitómetro.

Luego, diluya la muestra hasta 100.000 espermatozoides por microlitro y almacene alícuotas de cinco microlitros a menos 80 grados Celsius. Añada la cantidad deseada de cromatina de espermatozoides normales sobre la superficie de un trozo de parafina y coloque la muestra en un cruzador de UV. Establezca el parámetro de energía deseado e inicie el daño de la cromatina de los espermatozoides mediante luz UV.

Utilice inmediatamente la cromatina espermática tratada con UV para inducir el punto de control del daño del ADN en el extracto de baja velocidad preparado. Combine 50 microlitros de LSE, un microlitro de mezcla de energía y dos microlitros de cromatina espermática dañada. Incube la reacción a temperatura ambiente durante 90 minutos, asegurándose de agitar suavemente el tubo cada 10 minutos tras al menos 30 minutos.

Incubación, dispense un microlitro de la mezcla de reacción sobre un portaobjetos de microscopio y agregue un microlitro de solución de dados nucleares. Coloque un cubreobjetos y verifique la formación de núcleos mediante microscopio de fluorescencia. Normalmente, se formarán núcleos redondos tras 30 minutos de incubación, lo que indica que se ha iniciado la replicación del ADN.

Asimismo, evalúe 10 microlitros de la mezcla de reacción mediante inmunotransferencia usando anticuerpos anti check one. Combine 50 microlitros de LSE, un microlitro de mezcla de energía y 1,6 microlitros de stock de toto mycin en un tubo de microcentrífuga. Luego añada 1,25 microlitros de cualquiera de las siguientes opciones: dos microgramos por microlitro de un dúplex de ADN T70 o agua para el control negativo.

Incube las reacciones a temperatura ambiente durante 90 minutos y golpee suavemente los tubos de reacción cada 10 minutos. A continuación, añada 10 microlitros de la mezcla de reacción en 90 microlitros de tampón de muestra para el análisis por inmunotransferencia de verificación de una proteína. La cromatina espermática dañada o la estructura que imita el daño al ADN activan eficazmente un punto de control de daño al ADN mediado por TR verificación uno en el sistema de extracto de óvulo xop, en comparación con el control inducido por MMS.

Verifique una fosforilación en la serina 344, que es un indicador de la activación de la cinasa TR. De manera similar, una T 70 como una estructura que imita daño al ADN también desencadena la fosforilación de la proteína Check 1. Una vez dominada, la preparación de LSE puede completarse en aproximadamente una hora.

Dado que la calidad del extracto disminuye después de aproximadamente cuatro horas, la rapidez y la eficiencia son esenciales. Estos métodos pueden combinarse con otros enfoques para responder preguntas fundamentales sobre la señalización del punto de control de daño al ADN. Por ejemplo, se puede realizar un agotamiento inmunológico para probar si una proteína diana es necesaria en el punto de control de daño al ADN.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar el punto de control de daño D utilizando extracto de pus como sistema modelo. Gracias por verlo y buena suerte con su experimento.