Microinyección insulina hipocampo y

El objetivo general de este procedimiento es medir el metabolismo del hipocampo durante las pruebas conductuales. Esto se logra mediante la preparación quirúrgica de un animal bien manipulado con una cánula guía para microdiálisis. El día de la prueba, se inserta una sonda de microdiálisis en la cánula y se confirma el flujo PERFUSE ocho.

A continuación, se permite que la sonda alcance el equilibrio mientras el animal permanece en una cámara de control. En última instancia, se requieren métodos analíticos adecuados, por ejemplo, una reacción de glucosa oxidasa, NADP, N-A-D-P-H y análisis fluorométrico. Si se mide la glucosa para mostrar el nivel de metabolismo y/o liberación neuroquímica durante el período de prueba, uno de los aspectos más difíciles de esta técnica es el cuidado necesario al manipular el tubo de microdiálisis y también el hecho de que con frecuencia los animales lo mastican o enredan los conductos si no se toman las precauciones debidas.

Así que la primera vez que utilicé la microdiálisis del hipocampo durante pruebas conductuales fue durante mi trabajo de posgrado, y queríamos comprobar si los modelos existentes sobre el suministro de glucosa eran, de hecho, compatibles con los datos psicológicos conocidos respecto al mejoramiento de la memoria por la glucosa. Esta metodología nos permitió demostrar que, en realidad, los modelos existentes sobre la glucosa aplicados al cerebro eran completamente erróneos.

Tras seguir procedimientos quirúrgicos estándar, prepare el animal, exponga el cráneo y realice orificios para la colocación de la cánula. Inserte una cánula en coordenadas predeterminadas y luego bájela lentamente hasta la profundidad objetivo. Una vez posicionada correctamente, fije la cánula en su lugar con cemento dental.

Utilice un hilo quirúrgico estéril para cerrar la herida si es necesario. Por último, se utiliza un estilo para mantener la permeabilidad del catéter. A continuación, prepare el PERFUSE ocho para su uso en microdiálisis.

Debe tenerse en cuenta que una composición precisa del fluido es esencial para obtener resultados óptimos. El día de la prueba, debe agregarse albúmina sérica bovina BSA y disolverse completamente. Después de la preparación, el PERFUSE ocho debe filtrarse a través de un filtro de 0,2 micrones.

A continuación, prepare el tratamiento que se administrará al cerebro, si lo hubiera, utilizando una alícuota del ECF-A preparado. Aquí se prepara insulina para su administración en el hipocampo. Se debe preparar una sonda y línea de microdiálisis nuevas el día anterior a la prueba.

Cree dos líneas separadas para la entrada y la salida. Utilice tubo PE 50 para conectar dos piezas de tubo FEP de un metro de largo y asegúrese de que haya un espacio muerto mínimo entre las líneas. El tubo debe recortarse como se muestra para crear extremos inclinados que faciliten la inserción en los conectores PE 50.

Conecte el tubo de entrada a una jeringa Hamilton de un mililitro llena con agua desionizada estéril filtrada y conecte la sonda al otro extremo para permitir que el animal se mueva libremente durante la toma de mediciones. Conecte las líneas de entrada y salida a un conector giratorio de dos canales. A continuación, conecte el tubo de salida a la bomba y hágala funcionar a 1,5 microlitros por minuto hasta que observe agua desionizada saliendo por el tubo de salida de la sonda.

Apague la bomba y conecte la otra línea entre el tubo de salida y un tubo de recolección de muestra. Pase cinco mililitros a través del tubo y coloque la sonda en un vial que contenga agua desionizada estéril durante la noche, asegurándose de que la punta de la sonda permanezca siempre húmeda. 24 horas antes de la prueba, realice la preinstalación del sujeto de prueba retirando el estilete simulado e insertando una sonda de microdiálisis que se utilice exclusivamente para este propósito.

Durante 10 minutos después, reemplace el estilo ficticio y devuelva la rata a su jaula. Alternativamente, use una sonda nueva en esta etapa y déjela en su lugar sin retirarla hasta tomar las mediciones. Al día siguiente.

El día de la microdiálisis, llene la jeringa Hamilton y el vial de centelleo con A ECF filtrado y permita que la bomba se equilibre durante una hora. Si es necesario, llene una segunda jeringa Hamilton con el tratamiento preparado y colóquela en la bomba de jeringas. La clave del éxito en este procedimiento es mantener la calma y manipular al animal de manera muy cuidadosa.

Así que manténgase tranquilo, muévase lentamente y con precisión, y sobre todo practique. Cuando la equilibración esté completa, retire el estiloide simulado e inserte suavemente la sonda de microdiálisis equilibrada en el cerebro de la rata a través de la cánula. Coloque la rata en una caja de plástico transparente que contenga algo de la cama de su hogar.

Asegúrese de contrapesar el tubo. Sujete un tubo microcentrífugo de 1,6 mililitros lleno con agua al tubo situado fuera de la jaula de manera que la gravedad mantenga las líneas de microdiálisis sin dobleces pero sin tensión. Permita que la sonda y la rata se equilibren durante dos horas.

Al comienzo de este período, confirme que el flujo del Perfuse ocho no esté obstruido. Para ello, recoja el efluente del PERFUSE ocho durante un período definido y pese la muestra para confirmar que el volumen esperado esté saliendo del sistema antes de recolectar las muestras. Asegúrese de que la correlación entre la diálisis de la muestra y su recolección se calcule con precisión.

Aquí tenemos un volumen de 30 microlitros entre la sonda y el punto de recogida a una velocidad de 1,5 microlitros por minuto. Existe un retraso de 20 minutos desde que la muestra sale del cerebro hasta que se recoge. Tras el período de equilibración, recoja al menos tres muestras mientras la rata está en reposo en la cámara de alojamiento.

Para establecer una línea base estable de mediciones antes de las pruebas conductuales, planifique cuidadosamente el momento de la administración del tratamiento al cerebro. En este montaje, donde tenemos un volumen de 30 microlitros entre la punta de la jeringa y la sonda que ingresa al cerebro del animal, cambiamos la jeringa de tratamiento a la solución de tratamiento profusa ocho minutos antes. Queremos que el tratamiento llegue al hipocampo para cambiar las jeringas.

Desconecte simplemente la línea de entrada del jeringa de control PERFUSE eight y conéctela rápidamente a la jeringa de tratamiento PERFUSE eight. Esto no debe tardar más de cinco segundos para evitar interrupciones en el flujo de PERFUSE eight. Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire que puedan reducir la eficacia en el período de tiempo adecuado.

Después de la administración del tratamiento, traslade suavemente la rata al aparato de pruebas conductuales elegido. Aquí, se mide la alternancia espontánea en un laberinto en forma de cruz. Permita que el animal explore libremente el laberinto durante 20 minutos.

Registre la secuencia y el momento del brazo de Aries ya sea mediante una grabación de video o manualmente para recoger muestras. Durante este período, traslade el tubo de salida a un nuevo tubo de recolección. Cada cinco minutos, sostenga el tubo de manera que se mueva libremente.

No debe obstaculizar el movimiento de la rata ni moverse frente al animal; manténgase quieto para que sus movimientos no afecten el comportamiento de la rata. Después de la prueba, retire suavemente a la rata del laberinto y devuélvala a la cámara de control. Continúe la recolección de muestras de microdiálisis durante al menos cuatro muestras para cubrir el período de recuperación tras el desempeño de la tarea.

Después de recolectar las muestras deseadas, retire suavemente la sonda de la cabeza del animal y colóquela en un vial de almacenamiento. Devuelva al animal a su jaula de origen y observe cuidadosamente cualquier cambio postexperimental en su salud o comportamiento. Finalmente, enjuague el tubo intercambiando a una jeringa que contenga una solución de catho para prevenir el crecimiento de microbios.

Este ejemplo muestra una disminución de la glucosa en el ECF hipocampal asociada a una tarea. El cuadro gris representa el tiempo que el animal pasó en el laberinto. La línea púrpura muestra la glucosa hipocampal en animales sin prueba en el laberinto, mientras que la línea roja representa a los animales realizando la tarea de alternancia espontánea del antebrazo.

La línea naranja muestra las mediciones en animales realizando la versión más sencilla de esta tarea con tres brazos. Aquí se observan los cambios en la glucosa y el lactato hipocampal tras la administración de insulina. Obsérvese que estos cambios se observan sin ninguna prueba conductual, y por lo tanto reflejan el impacto de la insulina por sí sola en condiciones basales.

Al realizar este procedimiento, es muy importante mantener la calma. Las ratas pueden percibir el estrés del experimentador y se volverán agitadas, lo que puede dificultar mucho el procedimiento y probablemente confundir sus resultados. Esta combinación de técnicas ha permitido una investigación neuroquímica precisa de los procesos conductuales.

Actualmente, técnicas similares también se utilizan en pacientes humanos. Por ejemplo, pacientes con epilepsia que tienen electrodos implantados para localizar el foco de la crisis también pueden tener una cánula de microdiálisis implantada para permitir mediciones metabólicas.