Name: 海马胰岛素显微注射和微透析过程中空间记忆测试 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学习海马胰岛素显微注射与微透析技术，用于清醒动物空间工作记忆行为测试中的实时代谢物分析。该方法结合葡萄糖氧化酶反应和荧光分析，可精确测量神经化学释放与代谢变化。

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本工作由美国国立卫生研究院/国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所（DK077106，资助给ECM）资助。

1. 手术准备
<ol>
 <li>动物操作。实验动物（最常见的是大鼠或小鼠，尽管微透析技术及其与行为学测试结合的方法在不同物种间具有普遍适用性，仅需根据物种特性进行相应调整，e.g. 麻醉方式等）应在手术前至少连续两天、每天至少操作10分钟。充分的操作已被证明可使动物在测试时处于无应激状态，从而避免可能的干扰4-5,7,8。本方案中将以大鼠作为示例物种。操作过程中必须避免因使用e.g. 乳胶或丁腈手套抓取毛发而引起动物应激：最理想的方式是使用裸手操作，但需事先征得动物设施兽医及职业健康管理人员的同意。若无法使用裸手，则应在屏障手套外加戴柔软棉质手套，以避免牵拉大鼠毛发。</li>
 <li>无菌区域准备。手术开始前，应准备好手术区域，在立体定位仪周围建立无菌区域，并在仪器上覆盖无菌手术单，同时覆盖用于维持大鼠体温的加热垫。使用带有精确温控装置的循环水垫，以防止动物体温过高。</li>
 <li>麻醉诱导。检查异氟烷挥发器中异氟烷含量是否处于最佳水平，并将其连接至诱导舱。检查各连接部位以确保形成密闭回路。检查通风排气系统是否正常运行。开启异氟烷挥发功能，将动物置于诱导舱内，使用5%异氟烷与氧气混合气体进行麻醉，即向100%氧气气流中加入5%异氟烷，并输送至诱导舱。</li>
 <li>固定于仪器。使用耳杆和门齿固定器将动物牢固固定于立体定位仪上。正确安装耳杆可使头部保持静止，双耳紧贴耳杆平面。迅速完成固定后，将动物鼻部插入专用麻醉面罩；将异氟烷输送从诱导舱切换至鼻罩，并调节麻醉混合气体，使输送至鼻罩的氧气气流中含2–3%异氟烷。</li>
 <li>麻醉深度确认。通过用力捏压足部及向眼部吹气来确认麻醉深度；两种刺激均不应引起任何反应。整个手术过程中应每隔约15分钟重复上述测试，以确认维持在手术麻醉水平。在进入无菌区域前，需去除切口部位的毛发。</li>
</ol>
2. 手术
<ol>
 <li>动物初始处理。将眼膏涂抹于每只眼球表面，以防止干燥。皮下注射1 ml无菌生理盐水，以预防手术期间可能出现的脱水，同时用无菌手术巾覆盖动物身体。使用聚维酮碘涂抹头皮，并用棉签由中心向外擦拭；随后以同样方式用70%乙醇擦拭，上述两步清洁操作共重复三次，以确保切口部位充分消毒。聚维酮碘和酒精与皮肤接触时间应在切口前至少维持3分钟。整个手术过程中持续维持麻醉状态并定期检查；皮下注射一次卡洛芬（5 g/kg）以启动镇痛，操作全程遵循无菌技术。为减少注射带来的应激，在麻醉诱导后立即给予镇痛处理。</li>
 <li>切口与颅骨准备。在颅骨正中矢状方向做一长度为3–4 cm的切口。局部应用1:1配比的布比卡因-肾上腺素混合液，以进一步提供镇痛并减少出血。使用外科夹固定头皮，使其远离切口区域，并用无菌棉片清除覆盖在颅骨表面的膜性组织。以颅骨前囟（bregma）为参考点测量钻孔坐标，使用无菌钻头（或手持电灼器）标记位置，并在开始钻孔前再次确认坐标准确性。根据脑图谱确定感兴趣脑区（e.g. 此处为海马）的具体坐标。进行海马微透析时，我们采用的钻孔位置为前囟后5.6 mm、外侧+5.0 mm、硬脑膜下3.0 mm。</li>
 <li>钻孔。在颅骨上钻三个孔，操作时需格外小心，仅施加最小力度，以确保对硬脑膜及其下方结构的创伤最小甚至无损伤。其中一个孔位于导管植入的预定坐标处；另外两个孔的位置则根据方便固定颅骨螺钉的原则设定。将合适尺寸的螺钉（e.g. 1.17 mm自攻螺钉；Fine Science Tools）插入这两个孔中，避免压迫下方脑组织，这些螺钉将作为后续牙科水泥固定的锚定点。</li>
 <li>导管植入与伤口闭合。将导管置于预定植入坐标处，并再次确认其与所钻孔位置一致，然后缓慢下降至目标深度。导管定位准确后，用牙科水泥固定。如有需要，可使用单根无菌外科缝线关闭切口。将套管针芯插入导管内，以保持其通畅。本方案中使用CMA12探针及引导套管（CMA/Microdialysis）。</li>
 <li>术后急性期护理。皮下注射3 ml无菌生理盐水以维持水合状态；同时皮下注射一次卡洛芬（5 g/kg）以维持镇痛效果。将动物从麻醉设备中移出，置于温暖的恢复室内的清洁笼具中，并持续监测直至完全从麻醉中恢复。完全恢复的标准为翻正反射恢复及正常运动能力重现。确认恢复后，将动物送回其原饲养笼并转移至常规饲养室。</li>
 <li>短期随访护理。对接受手术的动物笼具标注手术日期。术后至少连续三天每日至少观察一次动物状态，并在术后第一天及其后连续两天每天给予一片卡洛芬咀嚼片（2 mg）。若动物未自行摄入卡洛芬，可改用注射途径给药，以确保充分镇痛。依据机构动物护理指南，监测动物整体健康状况及伤口局部情况（如感染、红肿等），必要时及时寻求动物护理人员或兽医的帮助。重要的是，必须注意适当的抓取操作和实验人员的适应性训练：实验人员应对动物进行充分的手动接触训练，包括对导管的操作，直至动物在被操作时不再表现出紧张或应激反应。</li>
 <li>后续动物护理与处理。动物将根据批准的实验方案及其所属的具体实验分组，接受相应的测试程序和安乐死操作。</li>
</ol>
3. 微透析（mD）
<ol>
 <li>灌流液制备。人工细胞外液（aECF）含有 153.5 mM Na、4.3 mM K、0.41 mM Mg、0.71 mM Ca、139.4 mM Cl、1.25 mM 葡萄糖，用缓冲液调节 pH 至 7.49. 注意 准确的灌注液成分至关重要：使用不准确或生理性质较差的液体（如林格氏液或磷酸盐缓冲液）进行微透析，将导致显著错误的结果9特别需要注意的是，细胞外液（ECF）的离子组成与脑脊液（CSF）并不相同，这一点我们在2004年对海马区ECF的详细研究中已有阐明。9测试当天，应加入2%（质量/质量）的牛血清白蛋白（BSA），并充分溶解；这可减少胰岛素等肽类物质因黏附于管路而造成的损失，同时降低探针膜处液体流失（超滤）的风险。配制完成后，灌流液应通过0.2 μm滤器过滤。</li>
 <li>若需将某种治疗物质（如胰岛素）递送至目标脑区（此处为海马），请使用已配制的aECF分装样品，加入适当浓度的药物来制备该治疗溶液。对于通过逆向微透析递送的胰岛素，已有研究采用400 nM（66.7 μU/μl）的浓度，并证实其可影响海马的代谢功能与认知功能10请注意，此处未测量胰岛素的最终组织浓度，因此该值未知。</li>
 <li>设置微透析探针和管路。在测试前一天准备全新的微透析探针和管路。分别建立“进液”和“出液”两条独立管路。使用PE50导管连接两段各1米长的FEP导管，并确保连接处死腔体积最小。将进液管路连接至装有经无菌滤膜过滤的去离子水的1 ml Hamilton注射器20（dH20），然后连接到探针上。</li>
 <li>微透析旋转接头。为在测量期间允许动物自由活动，需使用额外的FEP管将液体旋转接头连接至靠近泵端的流入和流出管路。在考虑样品采集时间（见下文）时，请务必计入该旋转接头及管路的内部体积。</li>
 <li>设置 mD 泵。打开 mD 泵，并以 1.5 μl/min 的流速运行，直至观察到 dH20 从探针的流出管排出。然后，在关闭泵的情况下，将另一根管路连接在流出管与样品收集管之间。使 5 ml 液体流经管路，并将探针置于含有无菌 dH₂O 的小瓶中20 过夜；确保探针尖端始终处于湿润状态。</li>
 <li>测试前预处理。测试前24小时，从大鼠头部移除假性导管，插入仅用于此目的（不用于采样）的mD探针，持续10分钟。随后重新插入假性导管，并将大鼠放回笼中。该操作旨在最大限度减少反应性胶质增生对测试当日结果的影响。11-12 在我们手中，该方法可获得良好的结果，与其他技术的数据一致，并似乎反映了海马体的激活4-5,8,10,13；其他人采用过类似的方法，在测量前将探针留置24小时，如果能够避免探针在过夜期间受损，这种方法同样可行。</li>
 <li>探针平衡。在微透析当天，用滤过的aECF填充Hamilton注射器和闪烁小瓶，并泵入系统中平衡1小时。如有需要，另取一支Hamilton注射器装入预配好的处理液（例如，胰岛素-aECF），并放入注射泵中。</li>
 <li>探针插入。平衡完成后，移除假性针芯，通过套管将已平衡的mD探针轻柔插入大鼠脑内。将大鼠放入一个透明塑料盒中，盒内放置部分该大鼠原饲养笼中的垫料。务必对导管进行配重平衡：在笼外将一根装有1.6 ml水的微量离心管连接至导管，使重力作用保持微透析管路无扭曲但不过于紧绷。让探针在大鼠体内平衡2小时。在此阶段开始时，确认灌流液流动通畅无阻：最简便的方法是在固定时间段内收集灌流液出液，并称量样品重量，以确认系统流出体积符合预期。任何产生异常 &lt;预期体积的90%，且在拔出并重新插入后无法自行恢复，则应更换探针（否则会导致探针尖端水肿）。如果灌注流速持续偏低或无流速，应检查所有连接处是否存在泄漏；若未发现泄漏，则分阶段断开管路，以确定堵塞位置。若仍无法确定问题所在，应更换探针；若问题仍未解决，可能需要从3.3节开始，使用新的探针和管路重新进行实验。两小时的平衡期可使血脑屏障在探针周围重新闭合，从而避免探针插入带来的急性影响。</li>
 <li>采集样品。确保准确计算样品透析（来自脑部）与收集（进入管中）之间的时间相关性。例如，若在换向器与探针之间使用两米长的FEP管，则从探针到收集端的总体积为30 μl，因此在1.5 μl/min的流速下，样品需经过20分钟才能通过探针、管路、连接器和换向器，到达管路末端并开始收集。采集样品时，应确保收集到足够体积的样品，以满足后续检测所需的浓度要求。本实验中将采用每5分钟为一个收集时间段，因此每个收集管中将收集7.5 μl的透析液。</li>
 <li>基线样本采集。平衡完成后，开始采集样本。在大鼠处于饲养箱内静息状态时，至少采集三个样本，以建立稳定的基线测量值。</li>
 <li>给药时机。实验前需仔细计算开始给药的合适时间：请注意，灌流液从注射器流出到达动物海马组织存在时间延迟，这与透析和样本收集之间的时间延迟类似（通常相同）。因此，在我们的实验装置中，注射器与探针之间体积为30 μl，若希望药物灌流液在某一时间点开始到达海马，应在该时间点前20分钟更换为含有治疗药物的灌流液注射器。</li>
 <li>更换注射器。可根据需要使用液体切换装置，但并非必需：在适当时间，只需将灌流液输入管路从对照灌流液注射器上断开，并迅速连接至处理灌流液注射器。整个操作应不超过5秒，以避免灌流液流动发生明显中断。 注意 在达到所需剂量后，若希望限制治疗时间，则应逆转此过程。或者，治疗可在取样期间持续进行（参见 图2切换注射器时不应将气泡引入管路中，因为气泡可能在透析膜处积聚，降低探针效率。</li>
 <li>行为学测试。若进行行为学任务，请遵循相应步骤（详见下文第4节）。 注意 因此，与海马体治疗递送的协调至关重要。例如，胰岛素的给药时间应安排在开始测试前10分钟。 14因此，应在行为学测试前30分钟切换至含胰岛素的灌注液（20分钟使灌注液流经管路，外加测试前所需的10分钟递送时间）。</li>
 <li>完成样本采集。在收集完所需样本后，轻柔地将探针从动物头部取出，同时再次注意透析与样本采集之间的时间延迟。将动物放回其饲养笼中，并密切观察其健康状况或行为是否出现任何实验后变化，直至动物被处死并取出脑组织以确认探针位置正确。如果动物不会立即被处死，应将假性导丝重新插入套管中，以避免任何外来物质进入。</li>
 <li>分析。分析方法将根据目标分析物的不同而有所变化。由于透析取样无法使分析物在探针膜处达到完全的平衡，因此应采用零净通量法对样品浓度进行校正，以获得细胞外液（ECF）中的实际浓度。15,16.</li>
</ol>
4. 行为学测试
<ol>
 <li>迷宫放置。在获得基线样本后（即，至少完成三次透析的样本，但这些样本可能仍处于正在收集的流出管路中），轻柔地将大鼠移入行为学测试装置。可使用任何合适的行为学任务；图1中的数据是利用一个四臂十字形迷宫并测量自发交替行为获得的，自发交替是空间工作记忆的一种指标：将大鼠初始放置于迷宫中心，允许其自由探索13,17-18。由于可采用任意行为学测试，本方案的重点并不在于此处作为示例的具体任务（该任务的详细描述见其他文献13,19,20），简而言之，允许动物探索迷宫（图1中灰色区域所示时间段），并利用依赖海马的过程来记忆近期已访问过的臂。</li>
 <li>测试期间透析管路的移动。手持管路时应确保其自由移动，既不能阻碍大鼠的活动，也不能让管路移动至动物前方而使其分心。操作者应保持静止，尽量减少自身动作，以免影响大鼠的行为表现。</li>
 <li>持续样本采集。与基线期相同，每5分钟将流出管路转移至新的收集管中。</li>
 <li>交替行为测试。允许动物在迷宫中自由探索20分钟。使用视频记录或人工记录的方式，记录进入各臂的顺序和时间，用于后续任务表现分析13,20。</li>
</ol>
5. 测试后处理
<ol>
 <li>最终样品采集。测试结束后，将大鼠从迷宫中轻轻取出并放回对照室。继续进行微透析样品采集，至少收集四个样品，以覆盖任务执行后的恢复期。</li>
 <li>探针移除。在采集完所有样品后，轻柔地将探针从动物头部取出，并放入储存管中；将动物放回其饲养笼。</li>
 <li>探针储存。将动物放回饲养笼并收集完剩余的透析液后，用去离子水彻底冲洗探针20，并储存于装有dH₂O的闪烁瓶中20，并用封口膜覆盖。通过切换至含有1:10,000 Kathon水溶液的注射器冲洗管路20 以防止微生物生长。只要探头保持良好的流速且膜无破损，便可重复使用；若操作得当，通常可使用十次以上。</li>
 <li>组织学。处死动物并取出脑组织，在冷冻切片机上切片，并采用标准组织学技术（例如 用焦油紫染色（cresyl violet staining）确认探针位置的准确性。</li>
</ol>

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</ol>

未声明任何利益冲突。

微透析实验中使用的所有溶液均应在使用前立即用0.2 μm滤器过滤。将探针插入导向套管后，应观察确认液体流动无阻碍且正在正常收集样品。若插入后液体停止流动，最可能的原因是插入时操作不当导致探针膜受损，此时必须更换新的探针。
如上所述，这些方法的一个关键优势在于不存在混杂因素，从而可以在清醒、自由活动的动物中同时进行行为学和神经化学测量：为了充分利用这一优势，测试前必须对动物进行充分的抓握训练，以确保其在测量期间处于无应激状态。平衡期通常足以建立稳定的代谢基线，但若需要确保各动物间血糖水平一致，可在测试前1-2小时移除食物。
微透析（mD）作为一种取样技术最主要的两个局限性是：（i）分析物的分子尺寸受限；（ii）分析物可能因在导管内壁黏附而造成损失。前者可在一定程度上通过使用具有更高分子量截留阈值的mD探针来缓解。典型的商用探针截留分子量最高可达100 kD，因此分子量在约50 kD以下的分子通常可较顺畅地通过；然而，为尽量减少探针尖端因超滤作用导致的样品损失，应尽可能使用较低截留分子量的膜。目标分子在导管内壁的黏附问题主要出...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content">大多数试剂为标准实验室级别，可从任意供应商处获取。同样，注射泵和管路等设备也可使用来自不同制造商的产品。本实验中使用的某些关键物品，其具体信息如下：&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>CMA 12 微透析探针</td><td>CMA/ Microdialysis</td><td>CMA-12-XXX</td><td>此类探针具有不同的膜长度和截留分子量，具体由“XXX”中的代码标明。</td></tr><tr><td>人胰岛素（Humulin）</td><td>Eli Lilly</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>液体旋转接头</td><td>Instech</td><td>375/D/22QM</td><td>该型号旋转接头具有极低的扭矩和内部体积，并带有惰性的石英内衬。</td></tr></tbody></table>

海马区胰岛素微量注射及 在体内的 空间记忆测试期间的微透析技术

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

葡萄糖代谢是局部神经活动的一个有用指标，构成了2-脱氧葡萄糖法和功能磁共振成像等方法的基础。然而，在动物模型中使用这些方法需要麻醉，因而既会改变脑状态，又无法进行行为学测量。另一种替代方法是采用体内微透析技术，对清醒、无束缚动物脑细胞外液中的葡萄糖、乳酸及相关代谢物浓度进行连续测定。当该技术与依赖特定脑区和/或急性药物干预的任务相结合时尤为有用；例如，在空间工作记忆任务（自发交替）过程中对海马区的测量显示，细胞外葡萄糖水平下降而乳酸水平上升，提示糖酵解增强1-3,4-5，而向海马内给予胰岛素既可改善记忆功能，又能增加海马区的糖酵解活动6。诸如胰岛素等物质可通过用于代谢物检测的同一微透析探针递送至海马。采用自发交替行为作为海马功能的评估指标，旨在避免应激性驱动因素（例如足底电击）、束缚或奖赏（例如食物）带来的干扰，因为这些因素均可能影响任务表现和代谢水平；该任务还可提供运动活动的测量指标，从而有助于控制治疗的非特异性效应。综合而言，这些方法能够直接测量调控行为的神经化学和代谢变量。

大鼠在停止麻醉后30分钟内应迅速恢复，表现为清醒、活动自如且行为活跃。如果手术操作规范且使用最少的牙科水泥，套管帽的影响应降至最低。在术后监测期间，若发现任何感染迹象，或大鼠表现出任何痛苦或不适的征象，应立即终止实验；这种情况应极为罕见。在测试前的抓取操作过程中，动物应表现清醒、自由活动、温顺且具有探索性。经过良好操作的大鼠，应基本无任何来自手术、术后恢复或实验人员存在所导致的可观察到的应激反应；如有需要，可通过检测血浆应激激素（肾上腺素、糖皮质激素）和/或血糖水平来确认4-5,7,8。
脑细胞外液（ECF）葡萄糖浓度通常在 0.5 - 1.5 mM 范围内，不同脑区有所差异，尽管在糖尿病动物中可能观察到更高的数值；在海马区，基础葡萄糖浓度约为 1.25 mM9,16。在未施加任何外源性处理的情况下，执行任务时，参与该任务调控的脑区应出现细胞外液葡萄糖浓度下降（通常伴随细胞外液乳酸浓度升高）的现象（例如见图1）：这反映了认知负荷所诱导的代谢活动增强13,19,21。类似的变化也可作为...

通过直接向海马内微量注射来调控依赖海马的空间工作记忆，并在清醒、行为正常动物中伴随和随后进行体内微透析以检测代谢物。

葡萄糖代谢是局部神经活动的有用标志物，构成了2-脱氧葡萄糖和功能磁共振成像等方法的基础……

本实验的总体目标是在行为学测试期间测量海马体的代谢活动。为此，需通过手术为经过良好处理的动物植入微透析引导套管。在测试当天，将微透析探针插入套管中，并确认PERFUSE eight系统的灌流正常。接下来，让探针在动物处于对照室时进行平衡。最终，采用适当的分析方法，例如葡萄糖氧化酶、NADP、NADPH反应及荧光分析法。若通过测定葡萄糖水平来反映整个测试期间的代谢水平或神经化学物质释放情况，则该技术最具挑战性的方面之一是在操作微透析管时所需的高度谨慎，若操作不当，动物常会啃咬或缠绕导管线路。因此，我第一次在行为测试中使用海马区微透析技术是在攻读研究生期间，当时我们想验证现有的葡萄糖供应模型是否与已知的葡萄糖增强记忆的心理学数据相符。这一方法使我们得以证明，实际上，应用于大脑的现有葡萄糖模型完全错误。按照标准外科手术流程，准备动物，暴露颅骨，并钻孔以放置套管。在预定坐标处插入套管，然后缓慢将其降至目标深度。确认位置正确后，用牙科水泥固定套管。必要时使用无菌外科缝线闭合伤口。最后，使用套管维持装置以保持套管通畅。接下来，准备用于微透析的 PERFUSE 八通道灌注系统。需要注意的是，精确的液体成分对于获得最佳结果至关重要。在测试当天，应加入牛血清白蛋白 BSA 并充分溶解。制备完成后，PERFUSE eight 应通过 0.2 微米滤器过滤。接下来，如有需要，使用已配制的 A ECF 部分样品制备将要给予脑部的处理试剂。此处准备将胰岛素递送至海马体。应在测试前一天准备好新的微透析探针和管路。分别建立进液管路和出液管路。使用 PE 50 管路连接两段一米长的 FEP 管路，并确保管路之间的死体积最小。应按图示修剪管路，使其末端呈斜面，以便于插入 PE 50 连接头。将进液管连接至装有经无菌过滤的去离子水的1毫升Hamilton注射器，并将探头连接至另一端，以便在测量时允许动物自由活动。将进液管和出液管连接至双通道旋转连接器。接着，将出液管连接至泵，并以1.5 µL/min的流速运行，直至观察到去离子水从探头的出液管端流出。关闭泵，将另一根管路连接在流出管与样品收集管之间。使五毫升液体流经管路，然后将探针放入含有无菌去离子水的小瓶中过夜，确保探针尖端始终处于湿润状态。测试前24小时，通过移除假性导丝并插入仅用于此目的的微透析探针，对受试对象进行预处理。此后10分钟内，更换假的探针并把大鼠放回笼中。或者，在此阶段使用新的探针，并保持其位置不变，直到进行测量。第二天。在进行微透析的当天，用过滤后的 A ECF 填充 Hamilton 注射器和闪烁瓶，并让泵平衡一小时。如有需要，用准备好的处理液填充第二支 Hamilton 注射器，并将其放入注射泵中。该操作成功的关键在于保持冷静，并对动物进行充分而细致的操作。因此，请保持冷静，动作缓慢而精准，最重要的是多加练习。当平衡完成后，取出假性导丝，通过套管将已平衡的微透析探针轻轻插入大鼠脑内。将大鼠放入一个透明的塑料箱中，箱内放置一些该大鼠笼舍中的垫料。务必平衡好管路。将一个装有水的1.6毫升微量离心管连接到笼外的管路上，调整位置使重力作用保持微透析管路无扭曲但不过于紧绷。让探针和大鼠平衡适应两小时。在此阶段开始时，确认 Perfuse eight 的流路畅通无阻。为此，需在确定的时间段内收集 PERFUSE eight 的流出液并称重，以确认系统流出的体积符合预期，然后再进行样品收集。确保准确计算样品透析与收集之间的对应关系。此处探针与收集点之间的灌流体积为 30 µL，流速为 1.5 µL/min。样品从脑部流出至被收集之间存在 20 分钟的延迟。在平衡期结束后，当大鼠处于饲养笼内静息状态时，至少收集三个样品。在行为学测试之前，为了建立稳定的测量基线，需仔细规划向脑内给药的时间。在此实验设置中，注射器尖端与进入动物脑内的探针之间有 30 µL 的容积，因此我们会在目标治疗物质到达海马体前 20 分钟，更换为灌注第八种治疗溶液的注射器。以完成注射器的更换。只需将灌注管路从对照 PERFUSE EIGHT 注射器上断开，并迅速连接至处理用 PERFUSE EIGHT 注射器。整个操作应不超过五秒，以避免中断 PERFUSE EIGHT 的灌注流。注意避免引入气泡，以免在适当的时间段内降低灌注效率。给药结束后，轻柔地将大鼠转移至选定的行为学测试装置中。此处，采用前臂加号形迷宫测量自发交替行为。让动物在迷宫中自由探索 20 分钟。使用录像或手动记录 Aries 臂的动作顺序和时间，以收集样本。在此期间，将流出管移至新的收集管。每五分钟握住管路一次，使其自由移动。它不应妨碍大鼠的移动，也不应移动到动物前方或分散其注意力，应保持静止，以免你的动作影响大鼠的行为。测试结束后，轻柔地将大鼠从迷宫中取出，并放回对照室。继续进行至少四次微透析样本采集，以覆盖任务执行后的恢复期。在采集完所需样本后，轻柔地将探头从动物头部取出，并放入储存管中。将动物放回其饲养笼内，并密切观察其健康状况或行为是否出现任何实验后的变化。最后，更换为含有氯化胆碱溶液的注射器，冲洗管路，以防止微生物生长。该示例显示了与任务相关的海马区细胞外液葡萄糖水平下降。灰色区域表示动物在迷宫中停留的时间。紫色线条显示未进行迷宫测试动物的海马区葡萄糖水平，而红色线条表示执行前肢自发交替任务动物的海马区葡萄糖水平。橙色线条显示了动物执行较简单的三臂版本任务时的测量结果。此处展示了注射胰岛素后海马体中葡萄糖和乳酸的变化。需要注意的是，这些变化是在未进行任何行为测试的情况下观察到的，因此反映了在基线条件下仅由胰岛素引起的影响。进行该操作时，保持冷静至关重要。大鼠能够感知实验者的压力，从而变得焦躁，这不仅会使操作更加困难，还可能干扰实验结果。这种技术组合使得对行为过程的神经化学研究更加准确。目前，类似的技术也已应用于人类患者。例如，癫痫患者在植入电极以定位癫痫发作病灶的同时，也可能植入微透析套管，以便进行代谢物的测量。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

海马胰岛素显微注射和<em在体内</em&gt;微透析过程中空间记忆测试

来源：Provenzano, G.，等. 神经发育障碍小鼠模型中空间学习后海马神经元活动的免疫组织化学可视化。J. Vis. Exp.

小鼠脑切片中海马神经元激活的成像

microRNA 在脑结构和功能中具有重要作用。本文介绍一种通过立体定位注射表达 microRNA 的慢病毒载体以实现海马区 microRNA 过表达的方法。该方法可作为相对快速评估 microRNA 功能的手段 体内...

向小鼠海马CA1区立体定位注射表达microRNA的慢病毒及其行为学结果评估

本实验方案的目的是研究啮齿类动物的空间认知能力。双H形水迷宫是一种新型测试方法，特别适用于阐明学习、巩固和记忆的不同组分，以及记忆系统之间的相互作用。...

双迷宫：一种用于啮齿类动物学习与记忆研究的稳健行为学测试方法

我们描述了一种免疫组织化学实验方案，用于研究在具有神经发育源性认知缺陷特征的小鼠模型中，经历空间学习任务后海马神经元激活的情况。该方案可应用于具有认知缺陷的遗传性或药理学小鼠模型。...

神经发育障碍小鼠模型中空间学习后海马神经元活动的免疫组织化学可视化

尽管多光子成像仅在组织表面有限深度范围内有效，但通过pCLE可实现任意深度下3...

清醒小鼠海马毛细血管的体内光纤耦合临床前共聚焦激光扫描内窥显微成像（pCLE）

本方法描述了一种慢性制备技术，可实现对活体小鼠海马体的光学观察。该技术可用于在数周时间内对神经元结构可塑性以及活动诱导的细胞可塑性进行纵向光学成像。...

活体小鼠背侧海马CA1区的纵向双光子成像

本文介绍了评估匹罗卡品诱导的癫痫小鼠记忆障碍的实验方法。该方案可用于研究与癫痫相关的认知功能下降的病理生理机制，这是癫痫最常见的共病之一。...

匹罗卡品诱导癫痫小鼠的记忆功能评估

本文介绍的方案提供了关于实时同步进行脑电图（EEG）和行为学评估的信息。我们详细阐述了该方案所涉及的全部步骤，为神经科学多个领域的研究人员，特别是学习与记忆领域的研究者，提供了一种具有吸引力的解决方案。...

同步监测无线电生理信号与记忆行为学测试作为研究海马神经发生的一种工具

本文旨在描述一种系统性的方案，用于获取小鼠的水平脑切片。该方法的目的是保持海马纤维通路（如穿通通路和苔藓纤维束）的完整性，以评估与齿状回相关的神经过程。...

小鼠脑水平海马切片

本文演示了定制成像窗口的制备方法，该窗口配有灌注套管，并展示了其在小鼠海马CA1区的植入过程。...

行为小鼠海马神经元活动观测的开颅手术操作

本文介绍了一种通过精确控制的手术和双光子显微镜技术，对小鼠海马CA1区静息态小胶质细胞进行慢性体内观察的方法。...

体内 小鼠海马区小胶质细胞的慢性双光子成像

学习海马胰岛素显微注射与微透析技术，用于清醒动物空间工作记忆行为测试中的实时代谢物分析。该方法结合葡萄糖氧化酶反应和荧光分析，可精确测量神经化学释放与代谢变化。

海马区胰岛素微量注射及在体内的空间记忆测试期间的微透析技术

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