Name: Secuencial Foto-blanqueamiento para Precisar las células individuales de Schwann en la unión neuromuscular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Aprende a visualizar células de Schwann individuales en la unión neuromuscular mediante foto-blanqueamiento secuencial con microscopía confocal en ratones transgénicos.

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Nos gustaría dar las gracias a Manuela Budak, Marinkovi Ljiljana y Wullimann Kristina por su excelente asistencia técnica. Damos las gracias a W. Macklin para proporcionar GFP-Plp ratones. TM es apoyado por el Instituto de Estudios Avanzados (Technische Universität München), por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SFB Sonderforschungsbereich 596), por la Alexander-von-Humboldt-Foundation y por la administración nacional (&quot;Bundesministerium für Bildung und Forschung&quot; ) en el marco de ERA-NET NEURON &quot;iPSoALS&quot; y &quot;2-fotón de imagen&quot;. TM y MB son apoyados por el Centro para la Ciencia Proteína Integrado (Munich). PM fue apoyado por la Escuela de Postgrado de la Universidad Técnica de Munich (TUM-GS).

1. Triangularis Sterni explante (Figura 1) Tiempo: 15 min. <ol><li> Preparar instrumentos quirúrgicos: 2 pares de pinzas, 1 par de tijeras, 1 par de tijeras de primavera, un plato de cultivo de tejidos (10-cm). Pre-burbujeó (mínimo de 15 min) refrigerado (4 ° C) solución de Ringer con 5% de CO 2/95% O 2. Llena de 15 cm placa de cultivo de tejidos con hielo y se cubre con una placa de metal. Preparar microscopio de disección y colocar el plato 15-cm con hielo bajo el alcance de disección con el fin de enfriar el explante durante la disección. </li><li> Letalmente anestesiar el ratón por sobredosis isoflurano (o cualquier otro método aprobado de sacrificio). Pulverizar el ratón con 70% de etanol para evitar la contaminación de la piel explante. Por SC blanqueo, hemos utilizado Plp-GFP ratones, que se pueden cruzar para Thy1-OFP3 o Thy1 Membow13-para la visualización simultánea del axón. </li><li> Uso del par de tijeras de gran tamaño, hacer una incisión de línea media dela piel sobre el esternón y dos incisiones paralelas al borde inferior de la caja torácica. </li><li> Uso del par de tijeras de gran tamaño, retire la piel, abrir la pared abdominal, y hacer incisiones paralelas a la caja torácica todo el camino de vuelta a la columna vertebral. Después de disecar los músculos pectorales haciendo incisiones cerca de la inserción del músculo en el esternón. </li><li> Cortar el diafragma abierto justo debajo del cartílago xifoides y diseccionar fuera de la membrana a lo largo de sus inserciones costales. </li><li> Sosteniendo la caja torácica por el proceso xifoides con un conjunto de pinzas, comience a cortar las costillas de la columna vertebral, lo más cerca posible de sus inserciones. Los recortes izquierdo y derecho deben converger por encima del corazón hacia el manubrio del esternón. Trate de no cortar los principales vasos sanguíneos (especialmente las venas subclavias). Mejor visibilidad se logra levantando suavemente la preparación mientras se apoya en el apéndice xifoides con fórceps. </li><li> Haga un corte transversal justo por debajo del manubrio del esternóny transferir el explante en el plato 10-cm con CO 2 al 5% enfriado / 95% O 2-burbujeó la solución de Ringer. Colocar el plato 10-cm en la placa de metal que cubre el plato de tejido 15-cm cultura lleno de hielo. Todos los pasos se deben hacer bajo el microscopio de disección. </li><li> Con unas tijeras pequeñas primavera eliminar los restos de timo, la pleura, el diafragma (el interior) y los músculos pectorales (externos; Figura 1B-D). </li><li> Para colocar el explante al plato de 3,5 cm, la disección de todas las costillas que no se insertan en el esternón. Esto se hace mejor usando unas tijeras pequeñas resorte y cortar el tejido entre las costillas (Figura 1E). </li><li> Pin el esternón triangularis músculo y el nervio explante en el Sylgard recubierto de 3,5 cm de placa de cultivo de tejidos utilizando pins minutien (abreviado a &lt;4 mm; Figura 1G). Dos pasadores deben pasar por cartilaginosos (blanco) partes del esternón. Insertar al menos dos pasadores a través de los nervios, tanto en el lado izquierdo y derecho de thexplante e apuntando a las partes más blandas cartilaginosos y evitando las costillas por debajo o cerca del músculo triangularis. Los pasadores se utilizan más, mejor (usamos normalmente 8-10). A medida que precisar la preparación, asegúrese de que las costillas son algo extendido, se fija el músculo en una posición ligeramente estirado. </li><li> Opcional: visualizar los sitios sinápticos que contienen receptores de acetilcolina mediante la adición de bungarotoxina acoplados a colorantes Alexa (concentración de 0,8 g / ml en 5% de CO 2 / O 95% de 2-burbujeó la solución de Ringer). Incubar explante clavada en el plato recubierto Sylgard durante 15-20 min a temperatura ambiente y luego se lava varias veces con 5% de CO 2/95% O 2-burbujear la solución de Ringer. </li></ol> 2. SC blanquear y opcional Time-lapse microscopía (Figura 2) Tiempo: 30 - 45 min + opcional 1 - 5 horas por lapso de tiempo. <ol><li> Transferencia de 3,5 cm Sylgard recubierto plato a un ingenio microscopio confocal equipadoh un láser de argón (488 nm de longitud de onda) y los objetivos de inmersión en agua (4x, 0,13 NA, 20x, 100x y NA 0,5, 1,0 NA o 60x, 0,9 NA). </li><li> Opcional para microscopía de lapso de tiempo: Insertar 3,5-cm Sylgard recubierto plato en anillo calefacción, instalar sistema de superfusión y sonda de temperatura (Figura 2A). Asegúrese de que ninguno de ellos toque el explante, el borde del plato o el recubrimiento Sylgard. Calentar la muestra a 33-35 ° C. Por SC blanqueo sin lapso de tiempo, la temperatura ambiente es mejor, ya que las células muestran menos dinámica entre las etapas de blanqueo. </li><li> Con el objetivo de 4x aire observar el patrón de inervación del músculo triangularis esternón y encontrar banda triangularis placa terminal esternón. Cambiar a 20x de inmersión de cono objetivo y empezar a buscar regiones superficiales dentro de la banda placa terminal (costillas áreas superpuestas son buenos candidatos). Cambio de objetivo 60x a 100x o inmersión de cono objetivo de comprobar en NMJs individuales. Ideal es un NMJ que está cubierta por SCS varios y se encuentra muy superficially (Figura 2B). Si se realiza una vez-lapse de imágenes después del blanqueo, seleccione hasta 3 NMJs que están relativamente cerca entre sí para aumentar el rendimiento. </li><li> Adquirir una imagen confocal de la UNM antes de foto-blanqueamiento SCs individuales (Figura 2B). (Para obtener imágenes de resolución completa, por ejemplo en un microscopio Olympus FV1000, utilizar un 100x, 1,0 NA objetivo zoom y 2,5, lo que resulta en Nyquist-limitado muestreo de ~ 0,1 m por píxel.) </li><li> &quot;Park&quot; el haz de láser 488 nm de forma centralizada en el núcleo de un SC utilizando la máxima potencia durante 5 segundos (alternativamente un patrón de exploración eficaz en una pequeña región de interés puede ser utilizado, tal como el &quot;tornado scan&quot; función en un microscopio Olympus; como se utiliza un microscopio confocal, el láser se centró en los planos conjugados de imagen y, por tanto, a 488 nm con un objetivo de 1,0 NA, &lt;0,5 m de diámetro). Vuelva a centrarse en la célula y juez blanqueo resultado. Si es necesario, repita el paso blanqueo de nuevo hasta que los niveles de GFP son reducird hasta niveles cercanos a fondo. Adquirir una imagen después de la decoloración (Figura 2C). Es importante asegurarse de que la región blanqueada está fuera de cualquier superposición entre dos células - Si hay una superposición, el blanqueado en una segunda celda será obvio. </li><li> Repetir el paso anterior hasta que todos menos uno SC se blanquean (Figura 2D-E). El último &quot;blanquear&quot; SC es adecuado para confocal time-lapse microscopía. Reconstruir las células individuales por sustracción de imágenes, por ejemplo, utilizando software Photoshop, para delinear sola morfología SC y territorio (Figura 2F). Tenga en cuenta que restar dos magos añade ruido (por ejemplo, mediante la importación de ellos consecutivos en &quot;capas&quot; en Photoshop, y luego poner el canal superior a la &quot;diferencia&quot; en el menú desplegable en la parte superior de la pestaña de canales). Esto puede ser evitado mediante la opción &quot;Limpiar&quot; la función de los canales antes de la resta y recortar a la basura cualquier fondo que, obviamente, no se origina en lacélula blanqueada. Para optimizar el contraste, puede ser necesario ajustar el brillo de los dos canales en el &quot;nivel&quot; de la ventana. La imagen resultante de la célula blanqueada es el superpuesta a la imagen original de una sinapsis, pseudo-coloreado en un color único y transparente para colorear el territorio de la célula blanqueada en la imagen original (de hacer esto para todos blanqueada y el último , las células sin blanquear la imagen mostrada en la Figura resultados 2F). </li><li> Opcional: Inicio confocal time-lapse microscopía después del blanqueamiento todos menos un SC. Tome una imagen a intervalos fijos (por ejemplo cada 5 min a 10). Uso como potencia de láser poco como sea posible. Hasta 3 NMJs pueden ser reflejados en la misma sesión. </li><li> Hacer un mapa de los NMJs tiempo transcurrido tomando una imagen a 100x sin zoom, a continuación, imágenes de la región con los objetivos de 20x y 4x (Figura 2G-I). Este &quot;mapa&quot; es necesaria para encontrar NMJs siguientes inmunohistoquímica de un músculo determinado. </li><li> Para la imagenprocesamiento, convertir imágenes individuales en las proyecciones de máxima intensidad y guardar en formato tiff. Combine todos los z-proyectados puntos temporales en una pila y alinear en xy, por ejemplo, a través del &quot;stackreg&quot; plugin 10 en Fiji (un paquete basado en el código abierto de software ImageJ, National Institutes of Health). </li></ol> 3. La fijación y la inmunohistoquímica (Figura 3) Tiempo: Noche. <ol><li> Transferir el explante en un tubo de reacción de 50-ml que contiene al menos 15 ml de 4% de PFA retirando cuidadosamente los pins. Enviar a fijar la pared torácica anterior que contiene el músculo triangularis esternón durante 1 hora en hielo. Enjuague tejido fijado con glicina 0,1 M en PBS (para apagar fijador residual y por lo tanto reducir el fondo) durante al menos 10 min. Las muestras se pueden almacenar en este punto y procesados ​​posteriormente. </li><li> Transferir explante fija a una placa de 10-cm Sylgard cultivo de tejidos recubierto lleno con 0,01 M PBS. Cortar una forma trapezoidal con un siparalelo de hasta el esternón y el otro a través de las transiciones hueso-cartílago - contiene el músculo triangularis en su superficie. Retire las costillas inferiores con una horizontal (es decir, trans-esternal) cortado de modo que el extremo caudal del músculo triangularis puede ser visitado libremente (Figura 3A-D). </li><li> Insertar una aguja hipodérmica como un pasador en la parte superior del trapezoide (Figura 3E). El uso de una aguja hipodérmica unida a una jeringa de 1 ml y fórceps para extraer el músculo triangularis en la superficie suavemente sosteniendo en una esquina caudal del músculo y utilizando la aguja como un micro-bisturí. Asegúrese de que los cortes se realizan en paralelo al plano de la pared torácica. Una vez que la parte caudal del músculo se libera, insertar otra aguja hipodérmica como un pasador debajo del músculo a través de la pared torácica - esto inmoviliza la preparación y permite ejercer una tracción suave sobre el músculo usando fórceps (Figura 3F). A medida que se corte TISS conectivoinserciones ue, &quot;piel&quot; de distancia del músculo del tórax. Cortar apego caudal pasado con tijeras de primavera. Retire los restos de grasa y los vasos de sangre utilizando fórceps. Tenga cuidado de no rasgar lejos de los nervios Nota:. Utilice conjuntos separados de las herramientas y los platos para trabajar con tejido vivo y fijos. </li><li> Iniciar la inmunohistoquímica (usando un protocolo estándar) mediante la transferencia de muestras de tejido en solución de bloqueo durante 1 hora en un agitador a temperatura ambiente. Volumen más pequeño posible para la tinción es de 200 l usando una placa de 96 pocillos. </li><li> Aplicar el anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo, 200 l por pocillo, durante la noche a 4 ° C en un agitador. </li><li> Lavar en 0,01 M PBS tres veces durante 10 min. </li><li> Aplicar el anticuerpo secundario adecuado para 1-2 horas a temperatura ambiente se diluyó en solución de bloqueo. </li><li> Lavar en 0,01 M PBS tres veces durante 10 min. </li><li> Montar en anti-fading medio (por ejemplo Vectashield) y cubreobjetos. </li><li> Colocar el portaobjetos en la placa de metal magnético, imán lugar en la parte superiorde la muestra para aplanar durante unas pocas horas o durante la noche a 4 ° C. Selle con esmalte de uñas. </li></ol>

<ol><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
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<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li>
<li>Thompson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+with+photoswitchable+GFP+in+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells.</a> Society for Neuroscience. Program 241, (2008).</li>
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<li>Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+imaging+of+motor+axon+dynamics+in+murine+triangularis+sterni+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants.</a> Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).</li>
<li>McArdle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+the+triangularis+sterni+muscle+of+the+mouse+for+investigations+of+synaptic+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena.</a> J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).</li>
<li>Marinkovi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).</li>
<li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li>
<li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia%2C+neurons%2C+macrophages%2C+and+dendritic+cells+for+vital+examination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método de blanqueo SC presentado aquí es sencillo, rápido y versátil: (i) Se permite revelar única morfología SC y dinámica por microscopía confocal basado en un único transgén - lo cual es una ventaja significativa cuando se combina con el enfoque por ejemplo, modelos de enfermedades que requieren alelos adicionales . (Ii) El método es rápido, a partir de la disección para la fijación se puede realizar en un medio día. (Iii) El número de aplicaciones es muy amplio, ya que puede ser combinado con otros métod...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Company (ejemplo) </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Etanol 70% (vol / vol) de solución </td><td> Roth </td><td> T913.1 </td><td> en botella de spray </td></tr><tr><td> isoflurano </td><td> Forene, Abbott </td><td></td><td> cualquier otro anestésico aprobado puede ser utilizado para la anestesia letal </td></tr><tr><td> ratones transgénicos (PLP-GFP) </td><td></td><td></td><td> para obtener de fuentes citadas </td></tr><tr><td> disección con microscopio de luz fría iluminación </td><td> Olympus SZ51 </td><td></td><td> equipado con Schott KL 1500 LCD </td></tr><tr><td> fórceps #2 </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11233-20 </td><td></td></tr><tr><td> fórceps # 5 </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11295-00 </td><td></td></tr><tr><td> tijeras, grandes médicos </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 14108-09 </td><td></td></tr><tr><td> tijeras, primavera ángulo pequeño </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 15033-09 </td><td></td></tr><tr><td> en línea calentador </td><td> Warner Instruments </td><td> SF-28 </td><td></td></tr><tr><td> calentar el anillo para los platos de 3,5 cm </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0110 DH-35 </td><td></td></tr><tr><td> dos temperaturas canal de control del sistema </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-344B </td><td></td&gt; </tr><tr><td> sistema de bomba de superfusión </td><td></td><td></td><td> hecha a la medida </td></tr><tr><td> 15-cm placa de cultivo de tejidos </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td> lleno de hielo y cubierta por placa de metal </td></tr><tr><td> 10-cm placa de cultivo de tejido </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802.003 </td><td> con solución de Ringer oxigenada de </td></tr><tr><td> 3,5 cm de placa de cultivo de tejido </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1800.003 </td><td> lleno de Sylgard polímero </td></tr><tr><td> Sylgard polímero </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 Elastómero de silicona Kit </td><td></td></tr><tr><td> microscopio confocal </td><td> Olimpo </td><td> FV1000 </td><td> con láser de argón </td></tr><tr><td> 50-ml tubo de reacción </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 PP </td><td></td></tr><tr><td> PFA al 4% en PBS </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> cánula de 0,5 mm x 25 mm </td><td> Neolab </td><td> E-1510 </td><td></td></tr><tr><td> jeringa de 1 ml </td><td> Neolab </td><td> E-1496 </td><td></td></tr><tr><td> sinaptofisina anticuerpo </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0130 </td><td> conejo </td></tr><tr><td> anticuerpo secundario </td><td> Invitrogen </td><td> A-11012 </td><td> Alexa 594 </td></tr><tr><td> 24-así placa </td><td> Sarstedt </td><td> 83,1836 </td><td></td></tr><tr><td> 0,01 M PBS </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> 0,1 M de glicina en PBS </td><td> Roth </td><td> 3790.1 </td><td></td></tr><tr><td> cubreobjetos </td><td> Neolab </td><td> E-4132 </td><td></td></tr><tr><td> diapositivas </td><td> Neolab </td><td> E-4121 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector laboratorios </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> minutien pins × 10 </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 26002-20 </td><td> acortado a &lt;4 mm </td></tr><tr><td> α-Bungarotoxina acoplada a Alexa 594 </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> B-13423 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Solución de bloqueo </td></tr><tr><td> 0.01 M PBS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2% de Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> 10% suero normal de cabra </td><td> Abcam </td><td> ab7481 </td><td></td></tr><tr><td> 1% albúmina de suero bovino </td><td> Sigma </td><td> A7030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Campanero burbujeaba con 95% O 2/5% CO 2 </td></tr><tr><td> 125 mM NaCl </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> 2,5 mM KCl </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 1,25 mM NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td></td></tr><tr><td> 26 mM NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> 2 mM CaCl 2 </td><td> Sigma </td><td> 21114 </td><td></td></tr><tr><td> 1 mM MgCl 2 </td><td> Sigma </td><td> 63020 </td><td></td></tr><tr><td> 20 mM de glucosa </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla 1. Reactivos y equipos específicos. </td></tr></tbody></table>

secuencial foto-blanqueamiento para precisar las células individuales de schwann en la unión neuromuscular

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Secuencial foto-blanqueador proporciona una manera no invasiva para etiquetar SCs individuales en la unión neuromuscular. El NMJ es el mayor sinapsis del sistema nervioso de los mamíferos y ha servido como guía modelo para estudiar la estructura y la función sináptica. En ratón terminales NMJs motor axón formar pretzel-como sitios de contacto con las fibras musculares. El axón motor y su terminal están rodeados por SCS. En las últimas décadas, varias ratones transgénicos se han generado para visualizar las neuronas motoras y SC, por ejemplo Thy1-XFP 1 y Plp-GFP ratones 2, respectivamente. A lo largo de los axones motores, mielinizantes CSs axonales están dispuestas en que no se solapan entrenudos, separadas por nódulos de Ranvier, para habilitar la propagación saltatoria potencial de acción. En contraste, los CSs de terminales en la sinapsis son células gliales, que supervisar y promover la neurotransmisión, digerir los desechos y los axones de regeneración de guía. NMJs están bien tapado, hasta la mitad de una docena no myelginarios CSs terminales - estos, sin embargo, no puede ser resuelto individualmente por microscopía de luz, ya que están en contacto directo membrana 3. Existen varios enfoques para visualizar individualmente CSs terminales. Ninguno de estos es impecable, sin embargo. Por ejemplo, el relleno de tinte, donde las células individuales están empalado con un microelectrodo de tinte lleno, necesita destruir una célula marcada antes de llenar un segundo. Esto no es compatible con las posteriores grabaciones con lapso de tiempo 3. Multiespectral &quot;Brainbow&quot; etiquetado de los CSs se ha logrado mediante el uso de la expresión combinatoria de proteínas fluorescentes 4. Sin embargo, esta técnica requiere la combinación de varios transgenes y está limitada por el patrón de expresión de los promotores usados. En el futuro, la expresión de &quot;foto-conmutables&quot; proteínas en SC podría ser otra alternativa 5. Aquí presentamos secuencial foto-blanqueador, en donde las células individuales son blanqueados, y su imagen obtenida por sustracción. Creemosque este enfoque - debido a su facilidad y versatilidad - representa una adición duradera a la tecnología de la paleta neurocientífico, especialmente en lo que puede ser utilizado in vivo y se transfiere a otros tipos celulares, sitios anatómicos o especies 6. En el siguiente protocolo, que detalle la aplicación secuencial de blanqueo y posterior confocal de lapso de tiempo microscopía a las SC terminales en explantes de músculo triangularis esternón. Esta delgada, superficial y se diseca fácilmente nervio-músculo preparación 7,8 ha demostrado ser útil para el estudio de NMJ desarrollo, la fisiología y la patología 9. Por último, se explica cómo el músculo triangularis esternón se prepara después de la fijación de realizar una correlación alta resolución de imagen confocal, inmunohistoquímica o exámenes ultraestructurales.

Un ejemplo de un explante triangularis esternón plato listo para formación de imágenes se muestra en la Figura 1G. Este explante es particularmente adecuado para formación de imágenes NMJs ex vivo como el músculo triangularis consiste sólo en unas pocas capas de fibras musculares. Esto permite la obtención de imágenes de alta resolución a partir de explantes derivados de líneas de ratones transgénicos que seleccione ya sea SCS (Plp-GFP 2) y / o axones (Thy1-XFP <sup...

Visualización de las células individuales en los tejidos densamente empaquetadas, tales como terminales de las células de Schwann (SC) en las uniones neuromusculares (NMJs), es un reto. &quot;Sequential foto-blanqueamiento&quot; permite delimitar SCs individuales terminal, por ejemplo en el explante de músculo triangularis esternón, una conveniente preparación nervio-músculo, donde secuencial de blanqueamiento puede ser combinado con las imágenes de lapso de tiempo y<em&gt; Post-hoc</em&gt; Immunostainings.

Secuencial Foto-blanqueamiento para Precisar las células individuales de Schwann en la unión neuromuscular

El fotoblanqueo secuencial proporciona una forma no invasiva de marcar células satélite (CS) individuales en la unión neuromuscular (UNM). La UNM es la sinapsis más grande del sistema nervioso de los mamíferos...

El objetivo general del siguiente experimento es delinear células de Schwann individuales en la unión neuromuscular mediante microscopía confocal. Este protocolo utiliza ratones transgénicos que expresan GFP en células de Schwann terminales y axónicas. El primer paso consiste en diseccionar un explante de nervio y músculo.A continuación, se realiza el blanqueo secuencial de todas las células de Schwann excepto una en una unión neuromuscular determinada, lo que permite revelar la morfología de una sola célula. Finalmente, se crea un mapa de baja potencia. El tejido se fija y se utiliza para inmunohistoquímica con el fin de visualizar cualquier marcador deseado en relación con la célula de Schwann no blanqueada restante.Los resultados muestran la morfología de células individuales y, si se desea, análisis de microscopía de lapso de tiempo o de colocalización inmunohistoquímica en tejido fijado basados en imágenes confocales. Aunque este método puede proporcionar información sobre la morfología y el territorio de células individuales de tipo swan en la unión neuromuscular, también puede aplicarse a otros sistemas, como líneas celulares, cortes cerebrales vivos o incluso otras especies como el pez cebra.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se requiere cierta experiencia para identificar una unión neuromuscular suficientemente superficial y no perder tiempo en estructuras que simplemente no valen el esfuerzo. Antes de comenzar la cirugía, oxigene y enfríe la solución de Ringer durante al menos 15 minutos. Coloque una placa de cultivo de tejidos de 15 centímetros con hielo bajo un microscopio. Cúbrala con una placa metálica.Coloque la placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros llena con solución de Ringer sobre la placa de metal. Coloque la piedra de oxigenación en la solución. El siguiente paso consiste en seleccionar un ratón que tenga sus células de cisne y axones marcados con diferentes colores.Después de que el ratón haya sido sacrificado, rocíelo con etanol para prevenir la contaminación del pelaje; utilice tijeras grandes para realizar una incisión media sobre el esternón y dos incisiones paralelas al borde inferior de la caja torácica. Retire la piel, abra el abdomen y seccione los músculos pectorales mediante incisiones cercanas a la inserción muscular en el esternón. Use pinzas para sujetar el cartílago xifoides y corte el diafragma justo por debajo del cartílago xifoides.Disecar el diafragma a lo largo de sus inserciones costales. Humedecer ocasionalmente el tejido con solución de Ringer para evitar que se seque, utilizando pinzas para sostener la caja torácica por el proceso xifoides. Comenzar a cortar las costillas de la columna vertebral lo más cerca posible de sus inserciones.Los cortes izquierdo y derecho deben converger por encima del corazón hacia el manubrio esternal. Trate de evitar cortar vasos sanguíneos importantes, especialmente las venas subclavias. Para una mejor visibilidad.Levante suavemente la preparación sosteniendo el proceso xifoides con pinzas. A continuación, realice un corte transversal justo por debajo del manubrio esternal para remover el tórax y transfiera el X explante a la placa de 10 centímetros con la solución de Ringer preparada. Coloque la placa sobre la placa de metal y el recipiente con hielo bajo el microscopio.Con tijeras pequeñas de resorte, retire los restos del timo, la pleura, el diafragma y los músculos pectorales. Con tijeras pequeñas de resorte, seccione todas las costillas que no se insertan en el esternón. Corte el tejido entre las costillas.Esto permite que el explante X quepa en un platillo recubierto con guardia SIL de 3,5 centímetros. Ahora, utilizando de ocho a diez alfileres minuchin acortados, sujete el explante X, evitando el músculo esternal en forma de triángulo señalado aquí. Dos alfileres deben atravesar las partes cartilaginosas del esternón, y dos alfileres deben atravesar las partes cartilaginosas más blandas entre las costillas.Evite perforar las costillas debajo o cerca del músculo triangular. Continúe fijando hasta que las costillas estén algo separadas. Sujete el músculo en una posición ligeramente estirada.Transfiera el platillo recubierto con protector de umbral de 3,5 centímetros a un microscopio confocal equipado con un láser Argonne y objetivos de inmersión en agua. Para una microscopía de lapso de tiempo, inserte el platillo recubierto con protector de umbral de 3,5 centímetros en el anillo calefactor. Instale un sistema de sobrefusión y coloque una sonda de temperatura.Asegúrese de que nada toque el explante, el borde del platillo ni el recubrimiento del cigarrillo. Para la microscopía de lapso de tiempo, caliente el explante X, pero para el blanqueo de células de Schwann, la temperatura ambiente es mejor. Ahora, con un objetivo de aire Forex, observe el patrón de inervación del músculo esternocleidomastoideo triangular y localice la banda de la placa motora del músculo esternocleidomastoideo triangular.Cambie al objetivo de cono de inmersión de 20x e inicie la búsqueda de regiones superficiales dentro de las áreas de la banda nplate. Las regiones que se encuentran sobre las costillas y cerca de los nervios intercostales son candidatas adecuadas. Cambie al objetivo de cono de inmersión de 100x o 60x para examinar neuronas individuales y mjs.Localice idealmente una JMn cubierta por varias células de Schwann que se encuentre muy superficialmente. Es fundamental para el éxito de este protocolo encontrar uniones neuromusculares superficiales y planas. Dado que la unión neuromuscular innerva fibras musculares cilíndricas, tiende a envolver la fibra y a menudo no tiene el ángulo perfecto para la obtención de imágenes. Seleccione únicamente las uniones neuromusculares que sean superficiales, planas y estén en la superficie. Ahora, utilizando un objetivo de 100x con una apertura numérica de 1,0.Con un aumento de 2,5, adquiera una imagen confocal de la JNM. Estos ajustes proporcionan un tamaño de píxel de aproximadamente 0,1 micrómetros, asegurando un muestreo espacial adecuado según el criterio de Nyquist. Ahora, blanquee fotónicamente la célula de Schwann posicionando el haz láser de 488 nanómetros centralmente sobre el núcleo, utilizando la potencia máxima durante cinco segundos.A continuación, vuelva a enfocar la célula y evalúe el resultado del blanqueo. Si es necesario, repita el paso de blanqueo hasta que los niveles de GFP se reduzcan a niveles cercanos al fondo, y luego adquiera otra imagen. Es fundamental asegurarse de que la región blanqueada esté fuera de cualquier superposición entre dos células.Si hay superposición, el blanqueo en una segunda célula será evidente. Cuando se realiza correctamente, este enfoque da como resultado células finales claramente reveladas, a menudo con una morfología bastante sorprendente que no se habría podido adivinar antes de comenzar el procedimiento. Repita el proceso de blanqueo hasta que todas las células de Schwann, excepto una, hayan sido blanqueadas.La última célula de Schwann sin blanquear es adecuada para la microscopía confocal con lapso de tiempo. Después de completar la adquisición de imágenes con lapso de tiempo, realice un mapa de estas nj mediante la obtención de una imagen a 100 x sin zoom, seguida de imágenes de la región utilizando el objetivo de 20 x y repita el proceso utilizando el objetivo de 4 x. Este mapa es necesario para localizar las nj tras la inmunohistoquímica de un músculo fijado.Después de la imagen y el blanqueo, desmonte el explante y transfiéralo a un tubo de 50 mililitros con al menos 15 mililitros de PFA al 4%. Luego, coloque el tubo sobre hielo durante una hora; tras enfriar el tejido durante una hora, enjuáguelo con glicina 0,1 molar en PBS durante al menos 10 minutos. A continuación, transfiera el explante fijado a una placa de cultivo tisular de 5 centímetros recubierta con malla de seda y llena con PBS 0,01 molar y prepárese para continuar la disección del explante.Primero, corte una forma trapezoidal con un lado paralelo al esternón y el otro a través de las transiciones de hueso a cartílago. Esta contiene el músculo triangular en su superficie. A continuación, retire las costillas inferiores con un corte horizontal o transesternal para que el extremo caudal del músculo triangular pueda accederse libremente.Ahora inserte una aguja hipodérmica como un pasador en la parte superior del trapecio. A continuación, retire el músculo triangular. Primero, use pinzas para sostener suavemente la esquina inferior del músculo.Y segundo, utilice una jeringa y una aguja como un microescalpelo para cortar paralelamente al plano de la pared torácica. Una vez que se suelte la parte inferior del músculo, inserte otra aguja debajo del músculo a través de la pared torácica para inmovilizar la preparación. Mientras corta las inserciones del tejido conectivo, desprenda el músculo del tórax con tracciones suaves realizadas con la pinza.Finalmente, retire los restos de grasa y vasos sanguíneos utilizando pinzas. Tenga cuidado de no arrancar los nervios. El músculo triangular ya está listo para la inmunohistoquímica.Se preparó un ojo esternal triangular para la visualización ex vivo de células de Schwann utilizando ratones que expresan GFP bajo el promotor PLP. Las axonas pudieron visualizarse simultáneamente mediante el cruce de ratones P-L-P-G-F-P con ratones OFP tres del muslo. Mediante el protocolo descrito, la morfología de células de Schwann terminales individuales se reveló con un detalle sorprendentemente alto al blanquear las dos células de Schwann terminales vecinas y las primeras células de Schwann axonales en condiciones vivas.Las uniones neuromusculares obtenidas por imagen se rastrearon utilizando el mapa creado previamente y se escanearon con alta resolución en el tejido fijado tras la microscopía confocal en vivo; el esternón triangular fue fijado y teñido. Aquí se muestran los receptores de acetilcolina marcados con bungarotoxina conjugada a Alexa 647 en rojo y las vesículas sinápticas marcadas con un anticuerpo anti-sinaptofisina en blanco. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo visualizar la morfología de células individuales, que inicialmente fueron todas marcadas con la misma proteína fluorescente y estaban empaquetadas demasiado densamente como para resolverse individualmente.Nuestro ejemplo muestra la unión neuromuscular, pero existen muchas otras aplicaciones potenciales.

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