Secuencial Foto-blanqueamiento para Precisar las células individuales de Schwann en la unión neuromuscular

El objetivo general del siguiente experimento es delinear células de schwan individuales en la unión neuromuscular utilizando microscopía confocal. Este protocolo utiliza ratones transgénicos que expresan GFP en células de schwan terminales y axonales. El primer paso es diseccionar una explicación de músculo nervioso.

A continuación, se realiza un blanqueamiento secuencial de todas las células de Schwan excepto una en una unión neuromuscular dada, revelando la morfología de una sola célula. Finalmente, se crea un mapa de baja potencia. El tejido se fija y se utiliza para la inmunohistoquímica para visualizar cualquier marcador deseado en relación con la célula de Schwan sin blanquear restante.

Los resultados muestran la morfología de una sola célula y, si se desea, la microscopía de lapso de tiempo o el análisis de colocalización inmunohistoquímica en tejido fijo basado en imágenes confocal. Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre la morfología y el territorio de las células de cisne individuales en la unión neuromuscular. También se puede aplicar a otros sistemas como líneas celulares, cortes de cerebro vivos o incluso a otras especies como el pez cebra.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se necesita cierta experiencia para identificar una unión neuromuscular suficientemente superficial y no perder el tiempo en estructuras que simplemente no valen la pena el esfuerzo Antes de comenzar la cirugía, oxigenar y enfriar la solución de timbre durante al menos 15 minutos. Coloque una placa de cultivo de tejidos de 15 centímetros con hielo bajo un microscopio. Cúbrelo con una placa de metal.

Coloque la placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros llena de solución de timbre en la placa de metal. Coloque la piedra de oxigenación en la solución. El siguiente paso es seleccionar un ratón que tenga sus células de cisne y axones marcados en diferentes colores.

Después de que el ratón haya sido sacrificado, rocíelo con etanol Para evitar la contaminación del pelaje, use unas tijeras grandes para hacer una incisión en la línea media sobre el esternón y dos incisiones paralelas al borde inferior de la caja torácica. Retire la piel, abra el abdomen y diseccione los músculos pectorales con incisiones cerca de la inserción muscular en el esternón. Use fórceps para sujetar el cartílago xifoides y corte el diafragma justo debajo del cartílago xifoides.

Disecciona el diafragma a lo largo de sus inserciones costales. De vez en cuando, humedezca el tejido con una solución de ringer para evitar que se seque, utilizando pinzas para sujetar la caja torácica mediante el proceso xifoides. Comience a cortar las costillas de la columna vertebral lo más cerca posible de sus inserciones.

Los cortes izquierdo y derecho deben converger por encima del corazón hacia el ojo de popa del manubrio. Trate de evitar cortar los vasos sanguíneos principales, especialmente las venas subclavias. Para una mejor visibilidad.

Levante suavemente la preparación mientras sujeta la apófisis xifoides con fórceps. Ahora haga un corte transversal justo debajo del ojo de popa del manubrium para quitar el tórax y transfiera el explan X al plato de 10 centímetros con la solución de timbre preparada. Coloque el plato en la placa de metal y el plato lleno de hielo debajo del microscopio debajo del microscopio.

Con unas tijeras de resorte pequeñas, retire los restos de timo, pleura, diafragma y músculos pectorales. Con unas tijeras de resorte pequeñas, diseccione todas las costillas que no se inserten en el esternón. Corta el pañuelo entre las costillas.

Esto permite que el X explan quepa en un plato recubierto de protección SIL de 3,5 centímetros. Ahora, usando de ocho a 10 alfileres de minuchin acortados, fije la X explan, evitando el músculo ocular triangular severo que se señala aquí. Dos alfileres deben atravesar las partes cartilaginosas del esternón, y dos alfileres deben atravesar las partes cartilaginosas más blandas entre las costillas.

Evite perforar las costillas debajo o cerca del músculo triangular. Continúe sujetando hasta que las costillas estén algo separadas. Fijar el músculo en una posición ligeramente estirada.

Transfiera el plato recubierto de protector de umbral de 3,5 centímetros a un microscopio confocal equipado con un láser Argonne y objetivos de inmersión en agua. Para una microscopía de lapso de tiempo, inserte el plato recubierto de protector de umbral de 3,5 centímetros en el anillo calefactor. Instale un sistema de superfusión e instale una sonda de temperatura.

Asegúrese de que nada toque la explicación, el borde del plato o la capa del cigarro. Para la microscopía de lapso de tiempo, caliente la X explan, pero para el blanqueo de células de schwan la temperatura ambiente es mejor. Ahora, con un objetivo aéreo de Forex, observe el patrón de inervación del músculo triangular del ojo de popa y encuentre la banda de la placa del extremo del ojo de popa triangular.

Cambie al objetivo de cono de inmersión de 20 x y comience a buscar regiones superficiales dentro de las áreas de la banda nplate. La capa superior de las costillas y la proximidad de los nervios intercostales son buenas regiones candidatas. Cambie al objetivo de cono de inmersión de 100 x o 60 x para verificar el control individual y mjs.

Lo ideal es localizar una NMJ cubierta por varias células de schwan que se localice muy superficialmente. Es fundamental para el éxito de este protocolo encontrar su unión neuromuscular superficial y plana. Dado que la unión neuromuscular está innovando las fibras musculares cilíndricas, tiende a envolverse alrededor de la fibra y las manos a menudo no tienen el ángulo perfecto para la obtención de imágenes. Seleccione solo las uniones neuromusculares que son superficiales, planas y en la superficie, ahora usando un objetivo de apertura numérica de 100 x 1.0.

Con un zoom de 2,5, obtenga una imagen confocal del NMJ. Esta configuración proporciona un tamaño de píxel de aproximadamente 0,1 micrómetros, lo que garantiza un muestreo espacial adecuado de acuerdo con el criterio de Nyquist. A continuación, fotoblanquea la célula de schwan aparcando el rayo láser de 488 nanómetros en el centro del núcleo utilizando la máxima potencia durante cinco segundos.

A continuación, vuelva a concentrarse en la célula y juzgue el resultado del blanqueo. Si es necesario, repita el paso de blanqueo nuevamente hasta que los niveles de GFP se reduzcan a niveles cercanos al fondo, luego adquiera otra imagen. Es fundamental asegurarse de que la región blanqueada esté fuera de cualquier superposición entre dos celdas.

Si hay superposición, el blanqueo en una segunda celda será obvio. Cuando se realiza correctamente, este enfoque da como resultado células finales claramente reveladas, a menudo con una morfología bastante sorprendente que uno no podría haber adivinado antes de comenzar el procedimiento. Repita el proceso de blanqueo hasta que todas menos una de las células de schwan estén blanqueadas.

La última célula de Schwan sin blanquear es adecuada para la microscopía confocal de lapso de tiempo. Después de completar las imágenes de lapso de tiempo, haga un mapa de estos njs tomando una imagen a 100 x sin zoom, luego imágenes de la región usando el objetivo de 20 x y repita el proceso usando el objetivo de cuatro x. Este mapa es necesario para encontrar njs siguiendo la química inmunohística de un músculo fijo.

Después de la obtención de imágenes y el blanqueo, desfije el modelo y transfiéralo a un tubo de 50 mililitros con al menos 15 mililitros de PFA al 4%. Luego coloque el tubo en hielo durante una hora después de enfriar el pañuelo durante una hora, enjuáguelo con glicina 0.1 molar en PBS durante al menos 10 minutos. A continuación, transfiera el explan fijo a una placa de cultivo de tejido recubierta con un protector de seda de cinco centímetros llena de PBS 0,01 molar y prepárese para diseccionar aún más el explan.

Primero, corte una forma trapezoidal con un lado paralelo al esternón y el otro a través de las transiciones de hueso a cartílago. Este contiene el músculo triangular en su superficie. A continuación, retire las costillas inferiores con un corte horizontal o transesternal para que se pueda acceder libremente al extremo mimado del músculo triangular.

Ahora inserte una aguja hipodérmica como un alfiler en la parte superior del trapecio. A continuación, retira el músculo triangular. Primero, use fórceps para sostener suavemente la esquina del músculo.

Y en segundo lugar, use una jeringa y una aguja como un microbisturí para cortar paralelo al plano de la pared torácica. Una vez que se libera la parte mimada del músculo, inserte otra aguja debajo del músculo a través de la pared torácica para inmovilizar la preparación. Mientras corta las inserciones del tejido conectivo, retire el músculo del tórax tirando suavemente de las pinzas.

Por último, retire la grasa y los restos de vasos sanguíneos con pinzas. Ten cuidado de no arrancar los nervios. El músculo triangular ya está listo para la inmunohistoquímica.

Se preparó un modelo de ojo de popa triangular utilizando ratones que expresan GFP bajo el promotor de PLP para la visualización ex vivo de células de schwan. Los axones se podían visualizar simultáneamente cruzando P-L-P-G-F-P con el muslo de un OFP y tres ratones. Utilizando el protocolo descrito, la morfología de las células de schwan terminales individuales se reveló con un detalle sorprendentemente alto mediante el blanqueo de las dos células de schwan terminales vecinas y las primeras células de schwan axonales vivas.

Las uniones neuromusculares de las que se obtuvieron imágenes se rastrearon utilizando el mapa creado previamente y se escanearon a alta resolución en el tejido fijo siguiendo microscopía confocal en vivo, se fijó y tiñó el explan triangular de popa. Aquí se muestran los receptores de acetilcolina marcados con bungalow toin acoplado a Alexa 6 47 en rojo y vesículas sinápticas marcadas con un anticuerpo antis sinaptofisina en blanco. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar la morfología de las células individuales, que inicialmente estaban todas marcadas por la misma proteína fluorescente y empaquetadas demasiado densamente para resolverse individualmente.

Nuestro ejemplo muestra la unión neuromuscular, pero hay muchas otras aplicaciones potenciales.