La implantación de fibra óptica para la estimulación optogenético crónica en el tejido cerebral

El objetivo del siguiente experimento es activar y estudiar los circuitos neuronales a largo plazo en ratones despiertos que se comportan. Este método es una adaptación del concepto descrito originalmente en Sparta etal. Esto se logra ensamblando primero un cable de acoplamiento de fibra óptica, que conecta la junta rotativa óptica al implante de fibra óptica.

A continuación, la fibra óptica se implanta sobre el tejido cerebral de interés para crear un pasaje para que la luz viaje directamente al canal de las neuronas que expresan la redina. Finalmente, la fuente de luz se conecta a la junta giratoria óptica para crear un camino conectado en serie desde la fuente de luz hasta el tejido cerebral. En última instancia, la activación inducida por la luz de las neuronas que expresan el canal redsin puede evaluarse sobre la base de estudios in vivo, electrofisiológicos y de comportamiento.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como las cánulas guía, es que minimiza el daño al tejido cerebral causado por la inserción y extracción repetidas de una fibra óptica. Aunque este método puede proporcionar información sobre la función de los circuitos neuronales, también se puede aplicar a otros sistemas para comprender mejor los mecanismos dependientes de la sinapsis y los circuitos que subyacen a ciertos tipos de trastornos neurológicos. La demostración visual de este método es fundamental.

Dado que los pasos de implantación son difíciles de dominar, cada paso aparentemente menor contribuye en gran medida a la estabilidad y fiabilidad generales del método. Comience cortando 35 milímetros de una fibra óptica de 125 micras de diámetro con un núcleo de 100 micras colocando un trazado de carburo con punta de cuña perpendicular a la fibra óptica y marcando la fibra en un solo movimiento unidireccional seguido de tirar hacia afuera. Ahora, inserte un feral cerámico lc con un diámetro de 127 micras con un lado convexo apuntando hacia abajo en un tornillo de banco y luego inserte la pieza de fibra óptica en el feral.

La fibra óptica debe deslizarse suavemente y sobresalir marginalmente más allá del extremo convexo del salvaje. A continuación, aplique una gota de epoxi de fibra óptica curable por calor recién preparado en el extremo plano del feral y luego aplique una pistola de calor sobre el epoxi. El epoxi debe llenar el feral a medida que se calienta y se cura cuando se vuelve negro.

Después del curado, limpie cualquier epoxi de los lados del feral, luego, con un disco de pulido de fibra óptica lc, haga patrones de rotación circulares para pulir el extremo convexo del feral en óxido de aluminio Hojas de pulido en una almohadilla de pulido en cuatro grados decrecientes. A continuación, corte la fibra óptica en el extremo plano a la longitud adecuada para dirigirse a la región de interés. Para probar la fibra óptica pulida, inserte el extremo pulido del implante en el manguito del acoplador.

Hasta que se sienta el contacto directo con el salvaje contrario, un implante defectuoso tendrá un punto focal débil cerca de la punta de la fibra óptica, mientras que un buen implante transmitirá un círculo concéntrico suave de luz sin salida. Potencias de hasta 10 milivatios almacenan los implantes terminados en espuma hasta su uso. Comience este paso midiendo y luego marcando una fibra óptica de 220 micras de diámetro con un núcleo de 200 micras para permitir que un ratón se mueva libremente, pero no permitir que el ratón mastique la fibra.

A continuación, inserte la fibra óptica en un trozo de tubo de furación con un diámetro interior ligeramente mayor y una longitud ligeramente más corta que los de la fibra óptica. Ahora, peque alrededor de 25 milímetros de un extremo de la fibra óptica e insértelo en el extremo metálico de un ensamblaje feral FC MM multimodo. Con un diámetro de 230 micras hasta que se detenga, la fibra óptica debe sobresalir por el extremo salvaje.

A continuación, asegure la conexión con cianoacrilato en el extremo metálico y cubra la conexión con un conector Pula el extremo salvaje con un disco de pulido FC como se acaba de demostrar. Después de pelar el otro extremo de la fibra óptica, insértelo en un feral cerámico lc con solo el extremo convexo distal. A continuación, aplique una gota de epoxi en el extremo plano y caliente hasta que se cure como se acaba de demostrar.

Después de pulir el extremo convexo del feral como se acaba de demostrar, deslice una funda de labranza lc sobre el extremo convexo del feral hasta que el feral alcance el punto medio de la manga. Luego, coloque un tubo termorretráctil sobre el tubo de ación y el manguito y caliente el tubo termorretráctil para asegurar y proteger la conexión. Finalmente, conecte el feral a la fuente láser y luego pruébelo midiendo la salida de luz a través del acoplador con un espectrofotómetro, la pérdida de luz entre la salida del láser y la salida del acoplador medida no debe exceder el 30% antes de comenzar la cirugía.

Desinfecte el área quirúrgica con alcohol de perfil isop seguido de una solución de clorhexidina. A continuación, coloque el mouse en la plataforma estereotáxica y asegure la cabeza asegurándose de que el cráneo esté nivelado. Aplicar pomada oftálmica en los ojos del animal para prevenir la sequedad y el dolor postoperatorio.

Ahora haga una incisión a través de la línea media del cuero cabelludo para exponer el cráneo desde las órbitas del ojo hasta la sutura lambda. Use pinzas de serafín para retener la piel y mantener el acceso al cráneo. Luego, use un palillo dental para grabar un patrón a cuadros en toda la superficie del cráneo.

Lave los residuos resultantes con solución salina estéril. Después de secar completamente, use un hisopo de algodón para aplicar peróxido de hidrógeno al 3% en el cráneo expuesto durante aproximadamente dos o tres segundos para crear microporos. A continuación, lave el cráneo varias veces con solución salina más estéril y séquelo bien.

Después de grabar, lavar y secar el patrón de tablero de ajedrez en el cráneo, nuevamente, inserte el implante salvaje de fibra óptica en el soporte de la sonda y luego conéctelo al brazo estereotáxico. Determine la ubicación del orificio con un atlas estereotáctico calibrado según bgma y lambda. A continuación, utilice un taladro dental rotatorio para hacer una pequeña craneotomía con orificio de fresa de menos de un milímetro de diámetro por encima de la región de interés, teniendo cuidado de no romper la duramadre ni dañar ningún tejido.

Usando el brazo estereotáxico coloque el implante en su lugar directamente sobre la región de interés, el salvaje debe descansar sobre el tejido craneal circundante. Ahora use un palillo de dientes estéril para aplicar una capa delgada y uniforme de cemento dental recién preparado a través del cráneo y sobre la parte inferior del implante. Teniendo cuidado de no entrar en contacto con la piel del animal, la capa base de cemento dental debe cubrir la mayor superficie posible en el cráneo.

El aspecto más difícil de este procedimiento es aplicar el cemento dental sin que toque la masa de piel. Para asegurar el éxito, aplique pequeñas cantidades de cemento a la vez en capas delgadas y espere a que cada capa se seque por completo antes de agregar la siguiente. Aplique capas uniformes del cemento dental para formar un pequeño montículo en la parte superior del cráneo y alrededor del implante.

Deje los tres a cinco milímetros del extremo convexo del feral limpios de cemento para permitir una conexión suave y sin obstrucciones. A continuación, sutura el cuero cabelludo sobre el montículo de cemento dental y alrededor del implante, se puede utilizar un adhesivo de unión veterinaria para una unión adicional después de la sutura. Finalmente, aplique analgésicos tópicos y antibióticos en la piel de la sutura y alrededor de la base del implante, y luego coloque al ratón en una jaula para la recuperación postoperatoria.

El ensamblaje adecuado del implante y el acoplador de fibra óptica da como resultado una pérdida mínima de fotones entre la fuente de luz y el extremo de la fibra óptica en la región de interés. Mientras que la fibra óptica pulida debe transmitir la luz en un círculo concéntrico uniforme similar al círculo que se muestra aquí, como se puede ver en esta imagen con una implantación y sutura cuidadosas, el implante no causa irritación visible al ratón y puede permanecer en su lugar para estudios a largo plazo sin ninguna degradación significativa de la fibra óptica o de la cantidad de luz transmitida. Los ensayos de comportamiento funcional en un ratón despierto muestran una respuesta directa a la estimulación A través de una fibra óptica implantada sobre la corteza motora, como lo demuestran estos datos de video de electrofisiología in vivo que muestran la activación de las neuronas objetivo a través del implante y la respuesta conductual del animal durante la estimulación cerebral. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la fotoestimulación de regiones cerebrales específicas, para responder preguntas adicionales, como ¿cuáles son los patrones de conectividad de circuitos asociados con las células objetivo?

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo ensamblar implantes de fibra óptica y cordones acopladores, y cómo implantarlos sobre el tejido cerebral que expresa porteadores optogenéticos.