Name: La implantación de fibra óptica para la estimulación optogenético crónica en el tejido cerebral (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Aprende a implantar fibra óptica para estimulación optogenética crónica en tejido cerebral de ratones despiertos. Este método minimiza el daño tisular y permite estudiar circuitos neuronales a largo plazo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nos gustaría reconocer que esta técnica fue descrita originalmente por Esparta et al., 2012, y ha sido fácilmente adaptado para su uso en nuestro laboratorio.

* Todos los materiales, junto con los respectivos fabricantes y / o proveedores se enumeran a continuación el protocolo. 1. Asamblea de los implantes <ol><li> Preparar una mezcla de epoxi curable por calor de fibra óptica mediante la adición de 100 mg de catalizador a 1 g de resina. </li><li> Mida y corte aproximadamente 35 mm de fibra óptica de 125 micras con núcleo de 100 micras al anotar con un escribano de cuña punta de carburo. Coloque el escribano perpendicular a la fibra óptica y la puntuación en un movimiento único, unidireccional. Cortar la fibra completamente dañará el núcleo de la fibra. </li><li> Inserte un casquillo cerámico LC con un 127 micras llevaban en el vicio, con el lado convexo hacia abajo. </li><li> Insertar la fibra óptica en el casquillo. La fibra óptica debe deslizarse suavemente y ligeramente sobresale más allá del extremo convexo de la férula (Figura 1a). </li><li> Aplique una gota de epoxi fibra termocurable óptico hasta el extremo plano y el calor con una pistola de calor hasta que se vuelve negro epoxy. El epoxi debellenar la férula medida que se calienta y curado antes. El epoxi se cura dentro de ~ 1 min de la aplicación de calor constante. </li><li> Limpiar cualquier epoxi a lo largo de los lados de la virola, como se obstruirá interfaz con el acoplador. </li><li> Pulir el extremo convexo de la férula utilizando un disco de pulido LC fibra óptica (FOPD) en hojas de óxido de aluminio de pulido sobre la almohadilla de pulido (Figura 1b). Haga movimientos circulares de rotación y pulir en cuatro grados en el siguiente orden: 5, 3, 1 0,3 micras grano. </li><li> Cortar la fibra óptica en el extremo plano a la longitud adecuada de manera que se dirige a la región de interés. La longitud puede ser determinada usando el atlas estereotáxico. </li><li> Probar el implante mediante la conexión al láser a través del cable del acoplador se describe a continuación. El extremo pulida del implante se inserta en el manguito del acoplador y debe estar en contacto directo con el casquillo opuesto. El implante debe ser capaz de mantener 10 mW de salida de luz, medida en la punta de the implante de fibra. Un implante mal tendrá un punto focal débil cerca de la punta de la fibra óptica. </li><li> La tienda de los implantes acabados (Figura 1c) en la espuma hasta su uso. </li></ol> 2. Asamblea de cable de fibra óptica acoplador <ol><li> Preparar una mezcla de epoxi curable por calor de fibra óptica como anteriormente. </li><li> Medir y cortar una longitud apropiada de fibra óptica 220 micras con núcleo de 200 micras al anotar con una punta trazadora de cuña punta de carburo. La longitud de la fibra debe permitir el ratón para mover libremente alrededor de la vivienda, pero no permiten el ratón para masticar a través de la fibra. </li><li> Insertar la fibra óptica en una longitud de tubería de bifurcación ligeramente más largo que la longitud de la fibra óptica. El tubo debe tener un diámetro interior ligeramente mayor que el de fibra óptica. </li><li> Franja de ~ 25 mm en un extremo de la fibra óptica y la inserta en el extremo metálico de un multimodo MM FC Ferrule Asamblea con 230 micras llevaba hasta el tope. La fibra óptica debe sobresalir a través de la ferrufinal le (Figura 2a). </li><li> Asegurar la conexión con cianoacrilato (pegamento) en el extremo de metal. Cubra la conexión con un conector de arranque y pulir el final con una férula FOPD FC. Haga movimientos circulares de rotación y pulido en cuatro grados en el siguiente orden: 5, 3, 1, 0,3 m de grano (Figura 2b). </li><li> Pelar y el otro extremo de la fibra óptica en un LC de casquillo cerámico (230 micras Identificación del orificio de fijación) con el extremo distal convexa. Aplique una gota de epoxi para el extremo plano y el calor hasta que esté curado. </li><li> Pulir el extremo convexo de la férula utilizando un FOPD FC en hojas de aluminio pulido de óxido como se ha descrito anteriormente. </li><li> Deslizar un manguito LC collar sobre el extremo convexo de la férula hasta el punto medio del manguito. </li><li> Lugar de calor tubo retráctil sobre el tubo de bifurcación y el manguito y el calor para asegurar y proteger la conexión (figura 2c). </li><li> Pruebe el acoplador mediante la conexión a la fuente de láser y la medición de la luz Sal.ut a través del acoplador con un espectrofotómetro. La pérdida de luz entre la salida del láser y la salida del acoplador medido no debe exceder de 30%. </li></ol> 3. Implantación quirúrgica * Este es un procedimiento puntas de sólo. Los instrumentos son estériles pero los guantes no necesitan ser debido a la manipulación constante entre los instrumentos y el equipo. <ol><li> Se anestesia el ratón con una inyección intraperitoneal de ketamina / xilazina mezcla de 100 y 10 mg / kg, respectivamente, utilizando una aguja de calibre 30. </li><li> Afeitar el cuero cabelludo con las tijeras. Limpie el cuero cabelludo con un 70% de alcohol isopropílico seguido de Betasept limpiar (4% de solución de clorhexidina) durante dos minutos, repitiendo una vez. </li><li> Coloque el ratón en la plataforma sterotaxic y asegurar la cabeza, asegurando que el cráneo es plano. Aplique ungüento oftálmico de los ojos para evitar la sequedad y el dolor postoperatorio. Mantenga la anestesia con isoflurano volatilizado (1-3% diluido con oxígeno en función del estado fisiológico del mouse, que deben ser controlados continuamente por la respuesta a un pinzamiento del rabo). </li><li> Hacer una incisión a través de la línea media del cuero cabelludo, el cráneo de la exposición de las órbitas de los ojos de lambda. Empujar a un lado del tejido conectivo como sea necesario. </li><li> Utilice abrazaderas Serafin para contener la piel y mantener un acceso al cráneo (Figura 3a). </li><li> Etch un patrón de cuadros a lo largo de la superficie del cráneo con un palillo de dientes. Lave los residuos lejos con solución salina estéril. Secar bien. </li><li> Aplicar el peróxido de hidrógeno (3%) en el cráneo expuesto con un bastoncillo de algodón para ~ 2-3 seg para crear microporos. Lavar varias veces y secar bien. Alternativamente, las anclas pueden ser atornillado en el cráneo, como se describe en Sparta et al. (2012). </li><li> Una vez más, grabar un patrón de cuadros en todo el cráneo con un palillo de dientes y lavar los restos con solución salina. Secar bien. </li><li> Uso de una herramienta rotativa, hacer un pequeño agujero de Burr craneotomía (&lt;1 mm de diámetro) con una broca estéril(Autoclave) por encima de la región de interés, determinado por el atlas estereotáxico calibrado a bregma y lambda. Tenga cuidado de no romper la dura o dañar ningún tejido. Lavar y secar bien los residuos. </li><li> Insertar la férula de fibra óptica (implante) en el soporte de la sonda y conectar con el brazo estereotáxica. </li><li> Posicionar el implante en su sitio directamente encima de la región de interés utilizando el brazo estereotáxico (Figura 3b). Si la inserción de la fibra óptica en el tejido cerebral, la fibra debe avanzar lentamente a una velocidad de ~ 2 mm / min. La férula debe descansar en el cráneo restante. </li><li> Preparar una mezcla de cemento dental. La mezcla debe tener una viscosidad lo suficientemente baja como para aplicar fácilmente a través del cráneo. Mezcla será utilizable durante 2-4 min. </li><li> Usando un palillo de dientes estéril, aplicar una capa fina y uniforme de cemento dental a través del cráneo y sobre la parte inferior del implante. La capa de base de cemento dental debe cubrir la superficie tanto en el cráneo comoposible. No dejar que el cemento dental entrar en contacto con la piel del ratón. Esto conducirá a una mayor dificultad en la sutura, así como irritación para el ratón. Si el cemento dental entra en contacto con la piel, dejar que se seque parcialmente de tal manera que toda la capa de cemento se puede desprender antes de la configuración. </li><li> Deje que se seque por completo. </li><li> Aplicar incluso capas de cemento dental para formar un pequeño montículo sobre el cráneo y alrededor del implante, permitiendo que cada capa se seque por completo (Figura 3c). Deja ~ 3-5 mm del extremo convexo de la férula limpia de cemento para permitir una conexión sin problemas y sin obstrucciones. </li><li> Suture el cuero cabelludo sobre el montículo de cemento dental y alrededor del implante mediante estériles de un solo uso suturas de seda trenzadas (6-0) con una aguja C22. Quitar después de 7 días. Opcional: Bond Uso Veterinario para la unión adicional después de la sutura. Asegúrese de usar Bond Vet mínimo. El exceso puede causar daño grave en la piel debido a las ralladuras. </li><li> INMEDIATAMy después de la cirugía, el ratón debe ser inyectada por vía subcutánea con Ketprophen (5 mg / kg) para disminuir el dolor postoperatorio. Esto se debe repetir 24 horas más tarde. Aplicar analgésicos tópicos (bupivicaína) y antibióticos (Neosporin) a la piel se sutura y alrededor de la base del implante. </li><li> Coloque el ratón en una jaula sobre una manta de calefacción para la recuperación de la anestesia. Coloque el ratón en una jaula estéril, la recuperación postoperatoria. La jaula de recuperación no debería contener la ropa de cama con el fin de mantener la temperatura y evitar la asfixia. El ratón puede ser devuelto a la jaula original, o una nueva jaula una vez despierto. </li></ol> Ensamblaje correcto del implante de fibra óptica y los resultados del acoplador en una mínima pérdida de fotones entre la fuente de luz y el extremo de la fibra óptica en la región de interés. Bien pulido fibra óptica debe transmitir la luz de manera uniforme, concéntrico círculo (Figura 2d). Con la implantación cuidadosa y la sutura, el implante no causa irritación visible ael ratón y puede permanecer en su lugar para estudios a largo plazo (Figura 3D,&gt; 1 mes, observaciones no publicadas) sin ninguna degradación significativa de la fibra óptica o de la cantidad de luz transmitida. Implantación inadecuada o la sutura puede causar irritación y puede resultar en el ratón rascado a través de su cuero cabelludo, dejando al descubierto el cemento dental, o rotura de la virola del cemento dental debido a la manipulación persistente. Un diagrama esquemático del sistema ensamblado se puede ver en la Figura 4. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig1.jpg" /> Figura 1. Asamblea de la fibra óptica implantables. (A) La fibra óptica se inserta en el casquillo, que sobresale ligeramente más allá del extremo convexo indicado por la punta de flecha. (B) El extremo convexo de la férula se pule con un FOPD en grados progresivamente más finos de hojas de pulido. (C) El opt acabado de fibra implantableic. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50004/50004fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig2.jpg" /> Figura 2. Asamblea de acoplador de fibra óptica utilizada para atar la fibra óptica de la junta rotativa al implante. (A) La fibra óptica se pegue a través del conjunto casquillo. (B) La parte del conjunto de casquillo se inserta en los grados FOPD y pulido utilizando progresivamente más finos de papel de pulido. (C) El manguito de casquillo está montado sobre el casquillo y se fija con tubo termocontráctil. (D) El acoplador de fibra óptica terminado debe producir una luz concéntrica con pérdida mínima de fotones. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig3.jpg" /> Figura 3. Implantación quirúrgica de las fibras ópticas. (A) La superficie entera de la cranium está expuesta y el tejido conectivo se borra. (B) El implante de fibra óptica se mantiene en posición con el brazo estereotáxica. (C) el cemento dental se aplica la fijación del implante de fibra óptica en el cráneo. (D)&gt; 1 mes después de la implantación, la piel se ha curado alrededor del implante y no hay signos de irritación. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig4.jpg" /> Figura 4. Diagrama esquemático del sistema funcional

<ol><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Light-Induced+Activation+of+Neural+Circuitry+in+Trangenic+Mice+Expressing+Channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54, 205-218 (2007).</li>
<li>Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 165-16 (2010).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li>
<li>Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+and+imaging+technologies+for+circuit+based+neuroanatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy.</a> Nature. 461, 900-907 (2009).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits%3A+technology+for+probing+mammalian+brain+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).</li>
<li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450, 420-424 (2007).</li>
<li>Sparta, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).</li>
<li>Stuber, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+transmission+from+the+amygdala+to+nucleus+accumbens+facilitates+reward+seeking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking.</a> Nature. 475, 377-380 (2011).</li>
<li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+a+hippocampal+engram+activates+fear+memory+recall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall.</a> Nature. 484, 381-385 (2012).</li>
</ol>

Optogenética es una técnica nueva y potente que permite un control sin precedentes sobre determinados subtipos neuronales. Esto puede explotarse para modular los circuitos neuronales con precisión anatómica y temporal, evitando al mismo tiempo la indiscriminada de tipo celular y efectos invasivos de la estimulación eléctrica a través de un electrodo. La implantación de la fibra óptica permite la estimulación consistente, crónica de los circuitos neuronales en varias sesiones en despierto, comportándose ratones con daño ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo o equipo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo # </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> LC Ferrule manga </td><td> Precision Products fibra (PFP) </td><td> SM-CS125S </td><td> 1,25 mm ID </td></tr><tr><td> FC MM Pre-ensamblado Conector </td><td> PFP </td><td> MM-CON2004-2300 </td><td> 230 m Ferrule </td></tr><tr><td> Miller FOPD-LC Disc </td><td> PFP </td><td> M1-80754 </td><td> Para el LC casquillos </td></tr><tr><td> Bifurcación tubo </td><td> PFP </td><td> FF9-250 </td><td> 900 m OD, ID 250 micras </td></tr><tr><td> MM LC Memory Ferrule 1,25 mm </td><td> PFP </td><td> MM-FER2007C-1270 </td><td> ID 127 micras Diámetro </td></tr><tr><td> MM LC Memory Ferrule 1,25 mm </td><td> PFP </td><td> MM-FER2007C-2300 </td><td> 230 mID Bore </td></tr><tr><td> Heat epoxi curable, el endurecedor y la resina </td><td> PFP </td><td> ET-353ND-16OZ </td><td></td></tr><tr><td> FC / PC y SC / PC Conector de disco de pulido </td><td> Thorlabs </td><td> D50-FC </td><td> Por FC casquillos </td></tr><tr><td> Potencia óptica digital y medidor de energía </td><td> Thorlabs </td><td> PM100D </td><td> Espectrofotómetro </td></tr><tr><td> Polishing Pad </td><td> Thorlabs </td><td> NRS913 </td><td> 9 &quot;x 13&quot; 50 Durómetro </td></tr><tr><td> Óxido de aluminio Pulido (pulido) Hojas: 0,3, 1, 3, 5 sémola micras </td><td> Thorlabs </td><td> LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P </td><td></td></tr><tr><td> La fibra multimodo estándar Revestimiento Duro </td><td> Thorlabs </td><td> BFL37-200 </td><td> Bajo OH, 200 Core micras, 0,37 NA </td></tr><tr><td> Herramienta pelacables de fibra </td><td> Thorlabs </td><td> T10S13 </td><td> Clad / Coa: 200 micras / 300 micras </td></tr><tr><td> SILICA / sílice de fibra óptica </td><td> Polymicro Tecnologías </td><td> FVP100110125 </td><td> High-OH, UV mejorada, 0,22 NA </td></tr><tr><td> 1x1 junta rotativa con fibra óptica </td><td> lentes dóricas </td><td> FRJ_FC-FC </td><td></td></tr><tr><td> Mono con fibra óptica Patchcord </td><td> lentes dóricas </td><td> MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC </td><td></td></tr><tr><td> Tubo termorretráctil, 1/8 pulgadas </td><td> Allied Electronics </td><td> 689-0267 </td><td></td></tr><tr><td> Heat gun </td><td> Allied Electronics </td><td> 972-6966 </td><td> 250 W, 750-800 ° F </td></tr><tr><td> Aplicadores con punta de algodón </td><td> Puritan Medical Products Company </td><td> 806-WC </td><td></td></tr><tr><td> Adhesivo de tejido Vetbond </td><td> Fischer Scientific </td><td> 19-027136 </td><td></td></tr><tr><td> Flash dentadura acrílica de base </td><td> Yates Motloid </td><td> ColdPourPowder + Liq </td><td></td></tr><tr><td> BONN miniatura Iris Scissors </td><td> Miltex Integra </td><td> 18-1392 </td><td> 3-1/2 &quot;(8,9 cm), hojas rectas, 15 mm </td></tr><tr><td> Johns Hopkins Bulldog Clamp </td><td> Miltex Integra </td><td> 7-290 </td><td> 1-1/2 &quot;(3,8 cm), curvada </td></tr><tr><td> MEGA-Torque eléctrico Motor Lab </td><td> Vector </td><td> EL-S </td><td></td></tr><tr><td> Panther Burs-Ball # 1 </td><td> Clarkson Laboratorio </td><td> 77,1006 </td><td></td></tr><tr><td> Violet Blue Laser System </td><td> CrystaLaser </td><td> CK473-050-S </td><td> Longitud de onda: 473 nm </td></tr><tr><td> Fuente de alimentación del laser </td><td> CrystaLaser </td><td> CL-2005 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 2 Pinzas laminectomía </td><td> Fine Ciencia Herramientas </td><td> 11223-20 </td><td></td></tr><tr><td> Sonda </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 10140-02 </td><td></td></tr><tr><td> 5 &quot;Straight Hemostat </td><td> EXCELTA </td><td> 35-PH </td><td></td></tr><tr><td> Vise con base pesada </td><td> Altex Electronics </td><td> PAN381 </td><td></td></tr></tbody></table>

la implantación de fibra óptica para la estimulación optogenético crónica en el tejido cerebral

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidar los patrones de conectividad neuronal ha sido un reto tanto para la neurociencia básica y clínica. Electrofisiología ha sido el estándar de oro para el análisis de los patrones de conectividad sináptica, pero emparejados registros electrofisiológicos puede ser a la vez engorroso y limitar experimentalmente. El desarrollo de optogenética ha introducido un método elegante para estimular las neuronas y circuitos, tanto in vitro como in vivo 1 y 2,3. Mediante la explotación de células de tipo actividad promotora específica para conducir la expresión de opsina en poblaciones neuronales discretas, uno precisamente puede estimular genéticamente definidos subtipos neuronales en circuitos distintos 4-6. Métodos bien descritos para estimular las neuronas, incluyendo la estimulación eléctrica y / o manipulaciones farmacológicas, son a menudo de tipo celular indiscriminada, invasiva, y puede dañar los tejidos circundantes. Estas limitaciones podrían alterar la función normal sináptica y / o comportamiento del circuito. Además, debidoa la naturaleza de la manipulación, los métodos actuales son a menudo aguda y terminal. Optogenética proporciona la capacidad de estimular las neuronas de una manera relativamente inocuo, y en las neuronas genéticamente dirigidos. La mayoría de los estudios que implican en optogenética in vivo actualmente utiliza una fibra óptica de guía a través de una cánula implantada 6,7, sin embargo, las limitaciones de este método incluyen tejido dañado cerebro con la inserción repetida de una fibra óptica, y la rotura potencial de la fibra en el interior de la cánula. Dado el creciente campo de la optogenética, un método más fiable de la estimulación crónica es necesario para facilitar estudios a largo plazo con el mínimo daño tisular colateral. Aquí nos proporcionan nuestro protocolo modificado como un artículo de vídeo para complementar el método eficaz y elegantemente descrito en Sparta et al. 8 para la fabricación de un implante de fibra óptica y su fijación permanente en el cráneo de ratones anestesiados, así como el montaje de la fibraacoplador óptico de conectar el implante a una fuente de luz. El implante, conectado con fibras ópticas a un láser de estado sólido, permite un método eficiente para photostimulate crónicamente circuitería neuronal funcional con menos daño al tejido 9, usando pequeñas correas desmontables,. Fijación permanente de los implantes de fibra óptica proporciona coherente, a largo plazo in vivo en estudios optogenético de los circuitos neuronales en ratones despiertos, comportándose 10 con el daño tisular mínima.

El desarrollo de optogenética ahora proporciona el medio para estimular las neuronas precisamente definidos genéticamente y circuitos, ambos<em&gt; In vitro</em&gt; Y<em&gt; In vivo</em&gt;. Aquí se describe el montaje y la implantación de una fibra óptica para la fotoestimulación crónica del tejido cerebral.

La implantación de fibra óptica para la estimulación optogenético crónica en el tejido cerebral

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

El objetivo del siguiente experimento es activar y estudiar los circuitos neuronales a largo plazo en ratones despiertos que se comportan. Este método es una adaptación del concepto descrito originalmente en Sparta etal. Esto se logra ensamblando primero un cable de acoplamiento de fibra óptica, que conecta la junta rotativa óptica al implante de fibra óptica.A continuación, la fibra óptica se implanta sobre el tejido cerebral de interés para crear un pasaje para que la luz viaje directamente al canal de las neuronas que expresan la redina. Finalmente, la fuente de luz se conecta a la junta giratoria óptica para crear un camino conectado en serie desde la fuente de luz hasta el tejido cerebral. En última instancia, la activación inducida por la luz de las neuronas que expresan el canal redsin puede evaluarse sobre la base de estudios in vivo, electrofisiológicos y de comportamiento.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como las cánulas guía, es que minimiza el daño al tejido cerebral causado por la inserción y extracción repetidas de una fibra óptica. Aunque este método puede proporcionar información sobre la función de los circuitos neuronales, también se puede aplicar a otros sistemas para comprender mejor los mecanismos dependientes de la sinapsis y los circuitos que subyacen a ciertos tipos de trastornos neurológicos. La demostración visual de este método es fundamental.Dado que los pasos de implantación son difíciles de dominar, cada paso aparentemente menor contribuye en gran medida a la estabilidad y fiabilidad generales del método. Comience cortando 35 milímetros de una fibra óptica de 125 micras de diámetro con un núcleo de 100 micras colocando un trazado de carburo con punta de cuña perpendicular a la fibra óptica y marcando la fibra en un solo movimiento unidireccional seguido de tirar hacia afuera. Ahora, inserte un feral cerámico lc con un diámetro de 127 micras con un lado convexo apuntando hacia abajo en un tornillo de banco y luego inserte la pieza de fibra óptica en el feral.La fibra óptica debe deslizarse suavemente y sobresalir marginalmente más allá del extremo convexo del salvaje. A continuación, aplique una gota de epoxi de fibra óptica curable por calor recién preparado en el extremo plano del feral y luego aplique una pistola de calor sobre el epoxi. El epoxi debe llenar el feral a medida que se calienta y se cura cuando se vuelve negro.Después del curado, limpie cualquier epoxi de los lados del feral, luego, con un disco de pulido de fibra óptica lc, haga patrones de rotación circulares para pulir el extremo convexo del feral en óxido de aluminio Hojas de pulido en una almohadilla de pulido en cuatro grados decrecientes. A continuación, corte la fibra óptica en el extremo plano a la longitud adecuada para dirigirse a la región de interés. Para probar la fibra óptica pulida, inserte el extremo pulido del implante en el manguito del acoplador.Hasta que se sienta el contacto directo con el salvaje contrario, un implante defectuoso tendrá un punto focal débil cerca de la punta de la fibra óptica, mientras que un buen implante transmitirá un círculo concéntrico suave de luz sin salida. Potencias de hasta 10 milivatios almacenan los implantes terminados en espuma hasta su uso. Comience este paso midiendo y luego marcando una fibra óptica de 220 micras de diámetro con un núcleo de 200 micras para permitir que un ratón se mueva libremente, pero no permitir que el ratón mastique la fibra.A continuación, inserte la fibra óptica en un trozo de tubo de furación con un diámetro interior ligeramente mayor y una longitud ligeramente más corta que los de la fibra óptica. Ahora, peque alrededor de 25 milímetros de un extremo de la fibra óptica e insértelo en el extremo metálico de un ensamblaje feral FC MM multimodo. Con un diámetro de 230 micras hasta que se detenga, la fibra óptica debe sobresalir por el extremo salvaje.A continuación, asegure la conexión con cianoacrilato en el extremo metálico y cubra la conexión con un conector Pula el extremo salvaje con un disco de pulido FC como se acaba de demostrar. Después de pelar el otro extremo de la fibra óptica, insértelo en un feral cerámico lc con solo el extremo convexo distal. A continuación, aplique una gota de epoxi en el extremo plano y caliente hasta que se cure como se acaba de demostrar.Después de pulir el extremo convexo del feral como se acaba de demostrar, deslice una funda de labranza lc sobre el extremo convexo del feral hasta que el feral alcance el punto medio de la manga. Luego, coloque un tubo termorretráctil sobre el tubo de ación y el manguito y caliente el tubo termorretráctil para asegurar y proteger la conexión. Finalmente, conecte el feral a la fuente láser y luego pruébelo midiendo la salida de luz a través del acoplador con un espectrofotómetro, la pérdida de luz entre la salida del láser y la salida del acoplador medida no debe exceder el 30% antes de comenzar la cirugía.Desinfecte el área quirúrgica con alcohol de perfil isop seguido de una solución de clorhexidina. A continuación, coloque el mouse en la plataforma estereotáxica y asegure la cabeza asegurándose de que el cráneo esté nivelado. Aplicar pomada oftálmica en los ojos del animal para prevenir la sequedad y el dolor postoperatorio.Ahora haga una incisión a través de la línea media del cuero cabelludo para exponer el cráneo desde las órbitas del ojo hasta la sutura lambda. Use pinzas de serafín para retener la piel y mantener el acceso al cráneo. Luego, use un palillo dental para grabar un patrón a cuadros en toda la superficie del cráneo.Lave los residuos resultantes con solución salina estéril. Después de secar completamente, use un hisopo de algodón para aplicar peróxido de hidrógeno al 3% en el cráneo expuesto durante aproximadamente dos o tres segundos para crear microporos. A continuación, lave el cráneo varias veces con solución salina más estéril y séquelo bien.Después de grabar, lavar y secar el patrón de tablero de ajedrez en el cráneo, nuevamente, inserte el implante salvaje de fibra óptica en el soporte de la sonda y luego conéctelo al brazo estereotáxico. Determine la ubicación del orificio con un atlas estereotáctico calibrado según bgma y lambda. A continuación, utilice un taladro dental rotatorio para hacer una pequeña craneotomía con orificio de fresa de menos de un milímetro de diámetro por encima de la región de interés, teniendo cuidado de no romper la duramadre ni dañar ningún tejido.Usando el brazo estereotáxico coloque el implante en su lugar directamente sobre la región de interés, el salvaje debe descansar sobre el tejido craneal circundante. Ahora use un palillo de dientes estéril para aplicar una capa delgada y uniforme de cemento dental recién preparado a través del cráneo y sobre la parte inferior del implante. Teniendo cuidado de no entrar en contacto con la piel del animal, la capa base de cemento dental debe cubrir la mayor superficie posible en el cráneo.El aspecto más difícil de este procedimiento es aplicar el cemento dental sin que toque la masa de piel. Para asegurar el éxito, aplique pequeñas cantidades de cemento a la vez en capas delgadas y espere a que cada capa se seque por completo antes de agregar la siguiente. Aplique capas uniformes del cemento dental para formar un pequeño montículo en la parte superior del cráneo y alrededor del implante.Deje los tres a cinco milímetros del extremo convexo del feral limpios de cemento para permitir una conexión suave y sin obstrucciones. A continuación, sutura el cuero cabelludo sobre el montículo de cemento dental y alrededor del implante, se puede utilizar un adhesivo de unión veterinaria para una unión adicional después de la sutura. Finalmente, aplique analgésicos tópicos y antibióticos en la piel de la sutura y alrededor de la base del implante, y luego coloque al ratón en una jaula para la recuperación postoperatoria.El ensamblaje adecuado del implante y el acoplador de fibra óptica da como resultado una pérdida mínima de fotones entre la fuente de luz y el extremo de la fibra óptica en la región de interés. Mientras que la fibra óptica pulida debe transmitir la luz en un círculo concéntrico uniforme similar al círculo que se muestra aquí, como se puede ver en esta imagen con una implantación y sutura cuidadosas, el implante no causa irritación visible al ratón y puede permanecer en su lugar para estudios a largo plazo sin ninguna degradación significativa de la fibra óptica o de la cantidad de luz transmitida. Los ensayos de comportamiento funcional en un ratón despierto muestran una respuesta directa a la estimulación A través de una fibra óptica implantada sobre la corteza motora, como lo demuestran estos datos de video de electrofisiología in vivo que muestran la activación de las neuronas objetivo a través del implante y la respuesta conductual del animal durante la estimulación cerebral. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la fotoestimulación de regiones cerebrales específicas, para responder preguntas adicionales, como ¿cuáles son los patrones de conectividad de circuitos asociados con las células objetivo?Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo ensamblar implantes de fibra óptica y cordones acopladores, y cómo implantarlos sobre el tejido cerebral que expresa porteadores optogenéticos.

fiber-optic-implantation-for-chronic-optogenetic-stimulation-brain

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Las neuronas nacidas de adultos del bulbo olfatorio puede ser controlado usando optogenetically Channelrhodopsin2 que expresan lentiviral inyección en la corriente migratoria rostral y fotoestimulación crónica con una miniatura implantado LED.

Transducción viral selectiva de adultos nacidos en las neuronas olfativas de las enfermedades crónicas En vivo Estimulación Optogenetic

El reciente desarrollo de herramientas de la neurociencia, que combinan la genética y la óptica, denominada "optogenética", permite el control sobre la actividad de circuitos neuronales con un nivel sin precedentes de la resolución espacial y temporal. Aquí les ofrecemos un protocolo para la integración en la grabación vivo con la manipulación optogenética de subconjuntos definidos genéticamente las neuronas piramidales corticales y subicular prefrontales.

Un método para la alta fidelidad Optogenética control de un individuo neuronas piramidales<em&gt; En vivo</em

optogenética se ha convertido en una poderosa herramienta para su uso en experimentos de neurociencia conductual. Este protocolo ofrece una guía paso a paso para el diseño y la configuración de sistemas láser, y proporciona un protocolo completo para llevar a cabo estimulaciones optogenéticas in vivo múltiples y simultáneas compatibles con la mayoría de los paradigmas de pruebas de comportamiento de roedores.

In vivo optogenético la estimulación del sistema nervioso central de roedores

Este protocolo describe los pasos y el análisis de datos necesarios para realizar con éxito la resonancia magnética funcional optogenética (ofMRI). ofMRI es una técnica novedosa que combina la lectura de fMRI de alto campo con la estimulación optogenética, lo que permite el mapeo específico del tipo de célula de los circuitos neuronales funcionales y su dinámica en todo el cerebro vivo.

RM funcional Optogenética

Aquí, presentamos un método de distribución de vectores de la expresión viral en el cerebro utilizando películas de fibroína de seda. Este método permite entrega dirigida de vectores de expresión utilizando fibras ópticas recubiertas de seda/AAV, ahusado de las fibras ópticas y ventanas craneales.

En Vivo Específica la expresión de proteínas de Optogenetic usando películas de seda/AAV

Con la manipulación optogenética de poblaciones neuronales específicas o regiones cerebrales, el comportamiento se puede modificar con alta resolución temporal y espacial en animales en movimiento libre. Mediante el uso de diferentes herramientas optogenéticas en combinación con fibras ópticas implantadas crónicamente, se puede realizar una variedad de modulaciones neuronales y pruebas de comportamiento.

Manipulación optogenética de la actividad neuronal para modular el comportamiento en ratones que se mueven libremente

Aquí, presentamos el método de fabricación de un sistema optrode con fibras ópticas para la entrega de luz y una matriz de electrodos para la grabación neuronal. Los experimentos in vivo con ratones transgénicos que expresan canalrodopsina-2 muestran la viabilidad del sistema para la estimulación optogenética simultánea y el registro electrofisiológico.

Optrode Array para modulación optogenética simultánea y grabación neuronal eléctrica

Este protocolo detalla un procedimiento quirúrgico para realizar una cirugía de la médula espinal y para implantar y asegurar un vástago óptico sobre la médula espinal en roedores.

Implantación de dispositivos optoelectrónicos en la médula espinal de los roedores

Hemos desarrollado un enfoque simplificado y rentable para la fabricación de electrodos y hemos realizado grabaciones de señales en múltiples regiones en ratones que se mueven libremente. El uso de la optogenética, junto con la electrofisiología multirregional y el registro de señales de calcio, permitió la revelación de las actividades neuronales en todas las regiones del modelo de convulsiones.

Un método integrado para crear optrodes electrofisiológicos flexibles y convenientes para el registro in vivo en múltiples regiones

Este protocolo proporciona un método integrado que incluye la administración viral, la implantación de optrode, la inducción fototrombótica, el registro simultáneo de la actividad de astrocitos y neuronales, y la estimulación optogenética de los astrocitos. Este método integrado tiene como objetivo proporcionar una investigación simultánea de la relación astrocito-neurona a lo largo de las etapas agudas a crónicas del ictus isquémico.

Un método integrado para el modelado fototrombótico del ictus y el registro in vivo de la actividad neuronal y astrocítica en ratones en comportamiento

Aprende a implantar fibra óptica para estimulación optogenética crónica en tejido cerebral de ratones despiertos. Este método minimiza el daño tisular y permite estudiar circuitos neuronales a largo plazo.

La implantación de fibra óptica para la estimulación optogenético crónica en el tejido cerebral

Explorar más videos