Analizar el desarrollo de células murinas Schwann largo de los axones en crecimiento

El objetivo del siguiente experimento es analizar el desarrollo de las células schwan a lo largo de los axones en crecimiento, su hábitat natural. Esto se logra mediante el primer paso de ganglios cervicales superiores ex explan, o S cgs de embriones de ratón en matrices de colágeno. Los S cg se tratan con factor de crecimiento nervioso o NGF, que facilita el crecimiento axonal de las neuronas SCG de forma coronal.

Además del crecimiento axonal desde el explan, se pueden observar células de schwan endógenas migrando a lo largo de los axones extendidos hacia la periferia. El desarrollo de las células de Schwan se puede analizar mediante imágenes de lapso de tiempo y también mediante el análisis de punto final de tejido fijo, lo que permite mediciones de distancia. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el ensayo de migración por arañazo, es que el hábitat natural de las células del cisne está incluido en este ensayo.

La demostración visual de este método es fundamental. Ya que el correcto ensamblaje de las métricas de colágeno y la correcta disección de los sgs son claves para el éxito. Estos pasos no son especialmente difíciles de aprender.

Solo necesitan práctica primero. Mientras trabajaba en un cultivo de tejidos, la capucha comprendió nuestras condiciones con todas las soluciones en hielo. Prepare el medio de cultivo y el colágeno de cola de rata de acuerdo con las instrucciones del protocolo escrito.

Mezclar, 800 microlitros de colágeno de cola de rata con 210 microlitros del medio culata. Sin introducir burbujas, la solución debe permanecer de color rojo. Si la solución se vuelve amarilla, entonces la solución de colágeno Ratal es demasiado ácida y debe rehacerse con una mayor concentración de pipeta de hidróxido de sodio 100 micro liberación de la solución en cada pocillo de un portaobjetos de varios pocillos y asegurarse de que el fondo de cada pocillo esté completamente cubierto.

Coloque los platos en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante dos horas. Después de la cosecha, los embriones E 16 a E 18 se colocan en una placa de Petri que contiene PBS, luego se diseccionan del amnios y se decapitan a un nivel cordal de la clavicular. A continuación, las regiones de la cabeza y el cuello se transfieren a una placa con fondo de silicona y, mientras se observa a través de un microscopio de disección, se utilizan agujas de insecto para fijar el tejido en las regiones submandibular y clavicular.

Ahora use fórceps para extirpar la piel y el tejido subcutáneo de la región submandibular. A continuación, extirpe las glándulas salivales submandibulares para revelar los músculos suprahioides, infrahiales y esternocleidomastoides. A continuación, utilice fórceps para extraer cuidadosamente los músculos infrahiales y esternocleidomastoideos para revelar la laringe y la tráquea.

Agarre la tráquea con las pinzas y levante la tráquea y la laringe. Una vez que se han extirpado la laringe y la tráquea, las arterias carótidas son visibles, son ambos lados de los músculos prevertebrales. Los ganglios cervicales superiores se encuentran en la bifurcación de las arterias carótidas y se pueden identificar como de forma ovalada.

Use fórceps y un soporte para agujas montado con una aguja de insecto para extraer los ganglios cervicales superiores y colóquelos en un plato nuevo que contenga PBS, luego diseccione los vasos sanguíneos o el tejido conectado de los ganglios. Con la ayuda de agujas de jeringa, retire los geles de colágeno gelatinizado de la incubadora y use agujas de jeringa montadas en jeringas para transferir los ganglios a los geles. Coloque los explantes en la incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono y condiciones húmedas durante una o dos horas.

Después de una a dos horas de incubación, los explantes del ganglio cervical superior se recuperan de la incubadora de cultivo de tejidos y se agregan 100 microlitros de medio neuro basal que contiene glutamina y antibióticos del suplemento B 27 a cada explicación. Posteriormente, 200 microlitros de medio neurobasal que contienen 60 nanogramos por mililitro. También se añade NGF a los pocillos para facilitar el crecimiento axonal.

También se pueden agregar sustancias de prueba en este momento, que se define como día cero in vitro para estudiar el efecto sobre las células de cisne que ya han comenzado a migrar. Las sustancias axons se pueden administrar a los tres días in vitro eliminando 180 microlitros del medio existente y reemplazándolo por 200 microlitros de medio que contiene la sustancia de interés y NGF al doble de la concentración final, las imágenes de lapso de tiempo se realizan utilizando una configuración de microscopio invertido que permitirá la incubación de cultivos celulares paralelos y la obtención de imágenes de lapso de tiempo para comparar diferentes sustancias de prueba. En un experimento, se recomienda un ajuste de varias posiciones en el punto final del experimento.

Después de fijar los explantes dentro de los portaobjetos de cultivo con 4% de PFA durante tres a cuatro horas y lavar con PBS, realizar la inmunohistoquímica para validar el explante X, ya que el SCG bloquea el tejido con PBS que contiene 10% de suero de burro normal y 2% de tritton X 100 durante dos horas. A continuación, siga con la incubación primaria de anticuerpos en solución bloqueante durante la noche. Al día siguiente de la incubación de anticuerpos primarios, transfiera el X explan que contiene geles a una placa de 24 pocillos, después de lavar con PBS, incubar con anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia durante dos horas mientras está protegido de la luz, luego lavar con PBS e incubar con una solución húmeda durante 10 minutos.

Después de lavar varias veces, coloque los geles de colágeno que contienen el explan X en un microscopio, deslice y seque los portaobjetos y posteriormente móntelos con ternera. Utilice un microscopio fluorescente estándar para obtener imágenes para su posterior análisis cuantitativo. Es útil si el software del microscopio es capaz de registrar metadatos.

El análisis cuantitativo de las imágenes obtenidas se puede realizar con el software Fiji o ImageJ, que se puede utilizar de forma gratuita para aplicaciones científicas. En esta película se demuestra el crecimiento axonal de un SCGX EXPLAN esquemático durante cuatro días in vitro. La inmunohistoquímica se puede realizar al cuarto día in vitro para identificar claramente el ganglio explantado.

Como ganglio simpático, se pueden observar células de schwan migrando a lo largo del axón, moviéndose desde el ganglio cervical superior a la periferia. Este video muestra el mismo patrón de migración que se acaba de ver con un aumento mayor. Las distancias de migración se pueden medir fácilmente en muestras con contratinción para núcleos con DPI midiendo la distancia desde los núcleos de las células de schwan principales hasta el borde de la SCG explantada en múltiples ubicaciones como se muestra en el esquema y la imagen de una muestra tratada con NGF marcada con DPI a los cuatro días in vitro, esta película muestra la migración de células de schwan en el borde de una muestra de SCG.

La combinación de campo claro y fluorescencia permite la visualización de los cisne positivos para S 100 GFP y los axones. Por último, esta película muestra la migración de las células de Schwan en el borde de un ganglio cervical superior ex explan. Aquí solo se muestra el canal de fluorescencia, lo que permite una interpretación más fácil de las células schwan positivas para S 100 GFP.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar análisis cuantitativos adicionales, como la cuantificación de la proliferación de una célula o la cuantificación de la apoptosis de una célula. Por supuesto, se debe realizar la inmunohistoquímica adecuada para el análisis de los puntos finales o se deben utilizar los animales transgénicos específicos para mostrar los efectos en el contexto vivo.