Name: Analizar el desarrollo de células murinas Schwann largo de los axones en crecimiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Aprende a analizar el desarrollo de células de Schwann a lo largo de axones en crecimiento usando ganglios cervicales superiores de ratón. Este ensayo en matrices de colágeno con NGF mejora los métodos tradicionales al incluir el hábitat natural celular.

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Queremos dar las gracias a Arumae Urmas para compartir un protocolo de colágeno y Fey y Jutta Hinz Ursula por su excelente asistencia técnica. Además queremos agradecer a Christian F. Ackermann, Ulrike Engel y la Nikon Imaging Center en la Universidad de Heidelberg y también por la amabilidad de Joachim Kirsch ayuda para el shoting video. El trabajo fue financiado parcialmente a través de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 592).

1. Preparación de geles de colágeno <ol><li> Preparar un medio de acción, que contiene 455 l MEM 10x, 112 l 7,5% NaHCO 3, 50 y glutamina l NaOH. La concentración y la cantidad de la solución de NaOH depende de la preparación de colágeno de cola de rata (ver 1,2), el volumen final del medio de archivo de ser 1.000 l. </li><li> Preparar colágeno de cola de rata de acuerdo con Ebendal (1). Almacenar la solución de colágeno a 4 ° C. Una degradación de la solución de colágeno no se puede observar. Después de la preparación de un nuevo lote, estimar la concentración de NaOH necesaria para el medio de almacén (ver 1,1). Utilice el indicador de pH del medio para la valoración de la cantidad y la concentración de NaOH. 800 l ácido de cola de rata colágeno tiene a su vez un tono de rojo cuando se mezcla con 210 l de la media de valores. Si la concentración de NaOH es demasiado baja, la solución de colágeno se volverá amarilla, debido a que el indicador de pH del medio. Añadir el colágeno al medio y se mezcla sin producing burbujas. Realice estos pasos en el hielo. La polimerización se produce dentro de 2 horas después de la solución de colágeno y el medio de archivo se han mezclado y la nueva solución se incuba a 37 ° C. Pruebe esto antes de comenzar el experimento. 1,3) Mezclar 800 l de solución de colágeno con l 210 de media de valores (ver 1.2). Place 100 l de esta solución en los pocillos de una diapositiva cámara 8 también. Incubar los portas a 37 ° C, 5% de CO 2 y condiciones de humedad en una incubadora de cultivo celular. Preparar los geles de colágeno bajo un banco de cultivo celular y las condiciones estériles. El colágeno gelatiniza dentro de 2 h. </li></ol> 2. Disección de SCG embrionarias <ol><li> Cosecha embriones de ratones preñados de tiempo (E16-18) desde el útero y los mantienen en PBS hasta que se necesita más. </li><li> Disecciona un embrión desde el amnios. Decapita el caudal del embrión nivel clavicular. Fijar la cabeza en una bandeja inferior de silicio con &quot;insecto-agujas&quot;. El lado ventral de la cabeza tiene que enfrentarse a usted unad que tiene que ver la región submandibular. La fijación permite una preparación más fácil. </li><li> Quitar la piel de la región submandibular izquierda y derecha, y con ella el tejido conectivo subcutáneo. </li><li> Retire las glándulas salivales submandibulares de su ubicación para despejar la vista hacia el hioides, los músculos infrahyoidal y el músculo esternocleidomastoideo. </li><li> Retire con cuidado estos músculos para borrar la vista hacia la laringe y la tráquea. Eliminar la tráquea y la laringe. Las arterias carótidas son entonces visible por ambos lados en los músculos prevertebral. El SCG se encuentra en la bifurcación de las arterias carótidas y tiene una forma oval. Retire con cuidado los ganglios y colocarlos en PBS. Retire los ganglios suavemente de las herramientas de disección si se adhieran a ellos. Es beneficioso el uso de fórceps, así como un soporte de aguja montada con una &quot;aguja insecto&quot; para la eliminación SCG. </li><li> Una vez en PBS, los ganglios almacenar a temperatura ambiente en PBS hasta que se diseccionaron enoulos ganglios de la GH. A continuación, limpie los ganglios de los vasos sanguíneos y tejido conectivo. Realizar la disección de SCG y la limpieza bajo un microscopio de disección coloca bajo una cabina de flujo laminar. </li><li> Finalmente, colocar los ganglios explantados en los geles de colágeno gelatinizados con la ayuda de agujas de jeringa montada en una jeringa para un manejo más fácil. </li><li> Incubar los explantes CGS en el colágeno gelatinizado en una incubadora de cultivo celular a 37 º C, con condiciones de 5% de CO 2 y húmedo. </li></ol> 3. El tratamiento de los explantes de SCG <ol><li> Después de 1-2 horas de incubación, el colágeno cubrir explante SCG que contiene 100 l con medio Neurobasal cultivo celular que contenía suplemento B27, glutamina y antibióticos. Ahora los pocillos de los portaobjetos de cámara de contener un volumen de 200 l (100 gel l y 100 l medio). Añadir otra l 200 del medio, sin embargo, ahora que contiene NGF (60 ng / ml) para facilitar el crecimiento axonal. En consecuencia, la concentración de NGF final es 30 ng / ml. </li><li><ol class="lalpha"><li> Para investigar la aparición de SC migración, añadir factores adicionales directamente en días in vitro 0 (DIV0). Disolver los factores en el medio que contiene NGF en la concentración necesaria doble (2). </li><li> Con el fin de analizar el impacto en la SC, que ya comenzaron a emigrar a lo largo de los axones, agregan factores adicionales en DIV3 hasta DIV4 (parada potencial del experimento). Con este fin, retirar cuidadosamente 180 ml ​​de la solución, en DIV3, y añadir 200 l NGF medio nuevo que contenía y los factores adicionales de interés en la concentración doble (2). </li></ol></li></ol> 4. Time-lapse de imágenes El uso de un microscopio invertido para los análisis. Objetivos pueden utilizar diversos, definir el campo de visión y la ampliación. Un aspecto importante, sin embargo, es la distancia de trabajo del objetivo utilizado, como formación de imágenes de los explantes SCG se realiza a través de la lámina de vidrio y el colágenogel. La velocidad de grabación de 1/10-30 minutos mostró buenos resultados (2). Sin embargo, este aspecto tiene que ser ajustado a la pregunta científica. Un normal cámara CCD puede ser utilizado para la adquisición de imágenes. Para una imagen en tiempo lapso de un cultivo celular cámara de incubación tiene que ser unida a la platina del microscopio. Incubar el tejido durante la formación de imágenes a 37 ° C, con condiciones de 5% de CO 2 y húmedo. Iniciar el sistema de incubación de una hora antes del inicio de formación de imágenes. Esto permite que las partes de microscopio (por ejemplo objetivo), incluyendo la cámara de diapositivas para ajustar a la temperatura y evita las derivas de temperatura inducidas. Definir áreas específicas de análisis (en el explante y entre diferentes explantes) con la ayuda del software del microscopio y una etapa motorizada controlada por software (configuración multiposición) para análisis simultáneos de diferentes condiciones aplicadas a los explantes de SCG. Para el tiempo de imágenes a intervalos de tejido de tipo salvaje así como el tejido de los animales transgénicos se pueden utilizarmarcando el SCS (S100B: GFP) (3). Para fluoróforos de formación de imágenes de una fuente de luz fluorescente tiene que ser aplicado en la configuración micropscope. Usa los filtros estándar. 5. Cuantificación de SC distancias de migración <ol><li> En el punto final (por ejemplo DIV4), fijar los geles de colágeno con 4% de PFA en el portaobjetos para cámara de 3-4 horas. Consecutivamente lavar los geles de colágeno 5 veces durante 10 min con PBS. Aplicar protocolos estándar para inmunocitoquímica (2). Si es nuevo para la preparación de SCG, verificar la identidad del ganglio como un ganglio simpático por inmunohistoquímica contra la tirosina hidroxilasa (TH) un marcador común para las células catecolaminérgicas. Durante inmunohistoquímica (después de que el anticuerpo primario), la transferencia de los geles de colágeno que contiene explantes a placas de 24 pocillos, que tienen un mayor volumen, lo cual es beneficioso para el lavado de los geles. </li><li> Después de inmunohistoquímica, coloque cuidadosamente los geles de colágeno en portaobjetos de vidrio. Cuidadosamenteeliminar la solución remanente y dejar que el colágeno seco / reducir a dos dimensiones. Esto permite facilitar las medidas de distancias (2). Después de esto, montar las muestras. </li><li> Por último, medir distancias de migración con la ayuda de Fiji (NIH) de software. No hay plugins especiales son necesarias para este fin. Para permitir que las mediciones correctas en micras, comprobar los metadatos de imagen correcta y la configuración en el Fiji, la imagen y la escala. Use Fiji también para la cuantificación de las células. </li></ol>

<ol><li>Ebendal, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEbendal%2C+T+%22Use+of+collagen+gels+to+bioassay+nerve+growth+factor+activity%22">Use of collagen gels to bioassay nerve growth factor activity</a>. Rush, R. A. IBRO Handh, John Wiley & Sons Ltd. (1989).</li>
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<li>Gumy, L. F., Bampton, E. T. W., Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycaemia+inhibits+Schwann+cell+proliferation+and+migration+and+restricts+regeneration+of+axons+and+Schwann+cells+from+adult+murine+DRG%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Hyperglycaemia inhibits Schwann cell proliferation and migration and restricts regeneration of axons and Schwann cells from adult murine DRG.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 37 (2), 298-311 (2008).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., Kurokawa, H., Morimura, T., Hanyu, A., Hama, H., Osawa, H., Kashiwagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
<li>Park, D., Don, A. S., Massamiri, T., Karwa, A., Warner, B., MacDonald, J., Hemenway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+cell+death+using+an+Hsp90+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of cell death using an Hsp90 ligand.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (9), 2832-2835 (2011).</li>
<li>Shcherbo, D., Souslova, E. A., Goedhart, J., Chepurnykh, T. V., Gaintzeva, A., Shemiakina, I. I., Gadella, T. W. J., Lukyanov, S., Chudakov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+and+reliable+FRET%2FFLIM+pair+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins.</a> BMC Biotechnology. 9, 24(2009).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El desarrollo del sistema nervioso periférico es un proceso excitante. Cuando el desarrollo se ha completado, los axones se envainado por SCS a lo largo de toda la longitud, que puede, en los seres humanos, a menudo ser más de 100 cm. Para este fin, el número correcto de los CSs requeridas tiene que ser establecido durante el desarrollo y los SCS también tienen que moverse a lo largo de los axones que se extienden a la periferia para asegurar la cobertura completa axonal. Esto es válido para los axones mielinizados unme...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> MEM 10 veces </td><td> Gibco </td><td> 21430 </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonato de sodio (7,5%) </td><td> Gibco </td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamina </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Merck </td><td> 109137 </td><td></td></tr><tr><td> NGF </td><td> Roche </td><td> 1058231 </td><td> De I + D # 556-NG-100 </td></tr><tr><td> Medio Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103 </td><td></td></tr><tr><td> B27 Suplemento </td><td> Gibco </td><td> 17504 </td><td></td></tr><tr><td> antibióticos </td><td> Gibco </td><td> 15640 </td><td></td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> Gibco </td><td> 14040 </td><td></td></tr><tr><td> agujas de insectos </td><td> FST </td><td> 26002-20 </td><td></td></tr><tr><td> jeringa con aguja </td><td> Braun </td><td></td><td> BD # 300013 </td></tr><tr><td> 8 Deslice la cámara bien </td><td> Lab Tek </td><td> 177402 </td><td></td></tr></tbody></table>

analizar el desarrollo de células murinas schwann largo de los axones en crecimiento

Analyzing Murine Schwann Cell Development Along Growing Axons

El desarrollo de los nervios periféricos es un proceso intrigante. Las neuronas envían axones inervan a los objetivos específicos, que en los seres humanos son a menudo más de 100 cm de distancia del soma de la neurona. La supervivencia neuronal durante el desarrollo depende de factores de crecimiento derivados de meta-, sino también sobre el soporte de las células de Schwann (SCS). Para este axones ensheath finales SC de la región del soma neuronal (o la transición de la central en el sistema nervioso periférico) a la sinapsis o unión neuromuscular. Células de Schwann son derivados de la cresta neural y migran como precursores a lo largo de los axones emergentes hasta el axón está cubierto con SCS. Esto muestra la importancia de la SC de migración para el desarrollo del sistema nervioso periférico y subraya la necesidad de investigar este proceso. Con el fin de analizar SC desarrollo, una configuración que se necesita al lado de los SCS también incluye su sustrato fisiológico para la migración, el axón. Debido al desarrollo intrauterino <em&gt; in vivo imágenes a intervalos de tiempo, sin embargo, no es factible en los vertebrados placentarios como el ratón (Mus musculus). Para evitar esto, hemos adaptado el superior ganglio cervical (SCG) Técnica de explante. Tras el tratamiento con factor de crecimiento nervioso (NGF) explantes SCG extender axones, seguido de precursores SC migran a lo largo de los axones del ganglio de la periferia. La belleza de este sistema es que el SC se derivan de una piscina de SC endógeno y que migran a lo largo de sus axones propios fisiológicos que están creciendo, al mismo tiempo. Este sistema es especialmente interesante, ya que el desarrollo SC largo de los axones pueden ser analizados por time-lapse, abriendo nuevas posibilidades para obtener información sobre la migración SC.

El crecimiento axonal se facilita de SCG explantes tras el tratamiento con NGF (4) (esquema película S1 Figura 1 esquema). Este proceso es fácilmente visible por cualquier microscopio invertido y puede ser seguido por imagen de lapso de tiempo (película S2). Si un científico es algo nuevo para la disección de SCG de embriones de ratón es muy recomendable una validación de la técnica por un simple anti-tirosina hidroxilasa (TH) inmunohistoquímica. TH es un marcador común para las neurona...

Aquí se describe una célula de Schwann (CS) ensayo de migración en el que las SC son capaces de desarrollar a lo largo de los axones se extienden.

Analizar el desarrollo de células murinas Schwann largo de los axones en crecimiento

The  development of peripheral nerves is an intriguing process. Neurons send out  axons to innervate specific targets, which in humans are often more than ...

El objetivo del siguiente experimento es analizar el desarrollo de las células schwan a lo largo de los axones en crecimiento, su hábitat natural. Esto se logra mediante el primer paso de ganglios cervicales superiores ex explan, o S cgs de embriones de ratón en matrices de colágeno. Los S cg se tratan con factor de crecimiento nervioso o NGF, que facilita el crecimiento axonal de las neuronas SCG de forma coronal.Además del crecimiento axonal desde el explan, se pueden observar células de schwan endógenas migrando a lo largo de los axones extendidos hacia la periferia. El desarrollo de las células de Schwan se puede analizar mediante imágenes de lapso de tiempo y también mediante el análisis de punto final de tejido fijo, lo que permite mediciones de distancia. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el ensayo de migración por arañazo, es que el hábitat natural de las células del cisne está incluido en este ensayo.La demostración visual de este método es fundamental. Ya que el correcto ensamblaje de las métricas de colágeno y la correcta disección de los sgs son claves para el éxito. Estos pasos no son especialmente difíciles de aprender.Solo necesi

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En este artículo se pretende describir en forma gradual el uso...

El análisis de Schwann-astrocito interacciones utilizando In Vitro Ensayos

Este video muestra el modelo de coculturación de un explante de ganglio de raíz dorsal y células de Schwann. En condiciones de cocultivo, el ácido ascórbico promueve la diferenciación de las células de Schwann en formas mielinizantes. Las células de Schwann mielinizantes envuelven los axones varias veces para crear una vaina de mielina, que es esencial para la función nerviosa.

Co-cultivo de un explante de ganglios de raíz dorsal con células de Schwann para la mielinización de neuronas

Las técnicas de microscopía óptica junto con ensayos bioquímicos dilucidan la implicación de la exocitosis mediada por SNARE en la ramificación de los axones dependiente de la netrina. Esta combinación de técnicas permite identificar los mecanismos moleculares que controlan la ramificación de los axones y el cambio de forma de las células.

Utilizando metodologías combinadas para definir el papel de la membrana plasmática de entrega Durante Axon ramas y morfogénesis neuronal

Este protocolo describe el aislamiento de neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) aisladas de ratas y el cultivo de neuronas DRG en un sistema de cultivo celular estático preestirado para mejorar la alineación de los axones, con el posterior cocultivo de células de Schwann (SC) para promover la mielinización.

Un Enfoque para Mejorar la alineación y la mielinización de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal

Existen células del estroma de la médula (MSC) con potencial neural dentro de la médula ósea. Nuestro protocolo enriquece esta población de células a través de un preacondicionamiento hipóxico y luego las dirige a convertirse en células maduras de Schwann.

Precondicionamiento hipóxico de las células progenitoras derivadas de la médula como fuente para la generación de células maduras de Schwann

Aquí, describimos un protocolo para la visualización de proyección de la neurona de motor y arborización de axon en embriones de ratón Hb9::GFP transgénicos. Después de inmunotinción para las neuronas motoras, se utilizó microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación a los embriones de la imagen para el posterior análisis cuantitativo. Este protocolo es aplicable a otros procesos de navegación de la neurona en el sistema nervioso central.

Visualización de la navegación del axón Motor y cuantificación de arborización de Axon en embriones de ratón utilizando microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación

Aquí, proporcionamos un método para analizar el comportamiento del crecimiento de axons en matrices 3D, imitando su desarrollo natural.

Generación de hidrogeles a base de colágeno 3D para analizar el crecimiento y el comportamiento axonal durante el desarrollo del sistema nervioso

Un ensayo de rebanada ex vivo permite que el crecimiento del nervio oculomotor se intermiera en tiempo real. Los cortes se generan mediante la incrustación de embriones E10.5 IslMN:GFP en agarosa, cortando en un vibratome, y creciendo en una incubadora de etapa superior. El papel de las vías de orientación de axón se evalúa mediante la adición de inhibidores a los medios de cultivo.

Cultivo de rebanadas de Oculomotor Ex Vivo de ratones embrionarios con tecnología GFP para imágenes de lapso de tiempo de crecimiento del nervio oculomotor

En el sistema de cocultivo de los ganglios de la raíz dorsal y las células de Schwann, se puede estudiar la mielinización del sistema nervioso periférico. Este modelo proporciona oportunidades experimentales para observar y cuantificar la mielinización periférica y estudiar los efectos de compuestos de interés en la vaina de mielina.

Mielinización in vitro de axones periféricos en un cocultivo de explantes de ganglio de raíz dorsal de rata y células de Schwann

Durante el desarrollo de la corteza cerebral, las neuronas y las células gliales se originan en la zona ventricular que recubre el ventrículo y migran hacia la superficie cerebral. Muchos genes están involucrados en este proceso. Este protocolo introduce la técnica para la obtención de imágenes en time-lapse de las neuronas migratorias y los progenitores gliales.

Imágenes de lapso de tiempo de neuronas migratorias y progenitores gliales en cortes de cerebro de ratón embrionario

Aprende a analizar el desarrollo de células de Schwann a lo largo de axones en crecimiento usando ganglios cervicales superiores de ratón. Este ensayo en matrices de colágeno con NGF mejora los métodos tradicionales al incluir el hábitat natural celular.

Analizar el desarrollo de células murinas Schwann largo de los axones en crecimiento

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