Diluido-skull técnica de ventana cortical para En Vivo Tomografía de Coherencia Óptica de imagen
19 de noviembre de 2012
Se presenta un método de creación de una ventana adelgazada cráneo cortical (TSCW) en un modelo de ratón para In vivo Imágenes de OCT de la corteza cerebral.
El objetivo general de este procedimiento es crear una ventana craneal delgada del cráneo en un modelo de ratón para obtener imágenes de tomografía de coherencia óptica in vivo del cerebro. Esto se logra primero anestesiando al animal y preparándolo para la cirugía. A continuación, adelgace el cráneo con varias rebabas dentales.
El paso final es obtener imágenes OCT del cerebro in vivo a través de la delgada ventana craneal del cráneo. En última instancia, la información estructural y funcional del cerebro se puede obtener a partir de las imágenes OCT resultantes. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la craniectomía o las ventanas de cubreobjetos, es que la ventana finical es menos invasiva y tiene más probabilidades de mantener la integridad biológica y la viabilidad del cerebro.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de trastornos neurológicos, ya que la OCT proporciona una alta resolución espacial y temporal y proporciona una penetración de profundidad superior en comparación con la microscopía confocal y la microscopía de dos fotones. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades para crear una superficie de cráneo uniformemente delgada sin introducir fracturas de cráneo o sangrado subdural. Para comenzar este procedimiento, anestesia a un ratón CD de entre seis y ocho semanas de edad con una inyección intraperitoneal de ketamina y xilacina.
A continuación, coloque el ratón sobre una almohadilla o manta homeomática para garantizar la temperatura corporal óptima de aproximadamente 37 grados centígrados durante la preparación quirúrgica, controle continuamente el nivel de anestesia probando los reflejos del animal e inyecte más anestesia cuando sea necesario. A continuación, lubrique ambos ojos con el ungüento de lágrimas artificiales. Retira el vello del cuero cabelludo con la maquinilla.
A continuación, retira los restos de pelo recortado con una almohadilla o un hisopo. Después de eso, aplique una capa delgada de crema depilatoria sobre el cuero cabelludo. Después de dos minutos, limpie suavemente la crema y el cabello restante con solución salina, hisopos de algodón humedecidos y almohadillas de preparación con alcohol.
Ahora desinfecte el cuero cabelludo con un bastoncillo Betadine y límpielo con almohadillas de preparación de etanol al 70%. A continuación, monta al animal en un marco estereotáxico para inmovilizar el cráneo. Golpea ligeramente el cráneo para asegurar su estabilidad.
En este procedimiento, comience la incisión en el cuero cabelludo en el punto de la línea media entre los ojos. Continúe mimosamente hasta el punto de la línea media entre la parte de las orejas, la piel se colgala con pinzas. A continuación, localice el área que se va a diluir bajo un microscopio de disección.
Use fórceps para raspar el cráneo y eliminar cualquier fascia residual. Luego seque el cráneo con hisopos de algodón estériles antes de crear una ventana cortical adelgazada de cuatro por cuatro milímetros de aproximadamente un milímetro de torema posterior y lateral. Use un taladro manual quirúrgico con una rebaba redonda de carburo con un ligero movimiento de barrido para adelgazar el cráneo.
No aplique presión directa sobre el cráneo. Deje de perforar cada 20 a 30 segundos para eliminar el polvo óseo con solución salina estéril e hisopos de algodón, y para evitar el sobrecalentamiento del cráneo. La solución salina también ayudará a disipar el calor en todo el cráneo.
Una vez que la capa externa del hueso compacto se ha eliminado por completo, la capa media del hueso esponjoso debe ser visible. Puede haber un ligero sangrado ya que los vasos sanguíneos son más evidentes en la capa ósea esponjosa. Cambie a una rebaba de piedra verde y continúe perforando con mucho cuidado.
Como la capa esponjosa es más delicada, la rebaba de piedra verde eliminará menos material óseo y asegurará la uniformidad en toda la ventana craneal. Deje de perforar de vez en cuando para eliminar el polvo óseo y enfriar el cráneo. Finalmente, cuando el cráneo se haya vuelto más transparente y la vasculatura en el cerebro sea visible, comience a pulir el cráneo con una fresa pulidora, verifique el grosor del cráneo golpeándolo suavemente con pinzas para detener el pulido.
Cuando el cráneo se vuelve ligeramente flexible, la ventana craneal adelgazada ahora debe ser completamente lisa y reflectante y estar lista para la toma de imágenes. Debido a la naturaleza de los tejidos del cerebro altamente dispersos, el cráneo debe adelgazarse a al menos 55 micras para una penetración óptima en profundidad. Una vez finalizada la cirugía, verifique la frecuencia respiratoria del animal a través de la inspección visual y los reflejos para garantizar el nivel adecuado de anestesia y administre anestesia adicional Si es necesario, coloque al animal debajo de la cámara OCT, luego coloque la ventana craneal del cráneo delgado debajo del haz óptico.
Ahora se puede visualizar una vista transversal del cráneo y el cerebro. Puede comenzar la adquisición de datos. Una vez localizada la zona de interés para la obtención de imágenes, se explora el haz de OCT sobre una ventana cortical de imagen con un ancho de 4,0 milímetros y se obtiene una profundidad de imagen de dos milímetros con seis milivatios de potencia incidente y una focal de 0,1 milímetros por debajo del cráneo delgado.
Cada área de sección transversal consistió en 2048 escaneos axiales con una tasa de adquisición de 0,14 segundos por imagen. Este método en particular nos ha permitido identificar estructuras específicas en nuestras imágenes transversales de OCT. Esta figura muestra una imagen OCT parasagital de la corteza debajo de un cráneo normal, y aquí muestra una imagen OCT parasagital debajo de un cráneo delgado.
Las estructuras del cerebro son más visibles bajo una ventana craneal delgada en comparación con un cráneo normal. Además, también se obtiene una imagen OCT de corte transversal coronal para facilitar la identificación de las estructuras de la línea media. Las exploraciones volumétricas del cerebro también se pueden obtener mediante la recopilación de una serie de imágenes transversales en 2D mediante el uso de dos conjuntos de espejos gal O para la exploración XY, con el primer espejo gal O escaneando el haz en la dirección sagital y el segundo espejo gal escaneando la dirección coronal.
Una vez dominada, esta técnica se puede completar en 10 minutos si se realiza correctamente. Si bien es importante intentar este procedimiento para adelgazar uniformemente el cráneo para garantizar una penetración adecuada de la señal durante las imágenes de OCT, después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar una ventana cortical de cráneo delgada para fines de imágenes de OCT.
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Descripción general
Este artículo presenta un método para crear una ventana cortical con cráneo adelgazado (TSCW) en un modelo murino, que permite la obtención de imágenes mediante tomografía de coherencia óptica (OCT) in vivo de la corteza cerebral. La técnica está diseñada para ser menos invasiva que los métodos tradicionales, preservando la integridad biológica del cerebro.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Técnicas de Imagen
- Estudios In Vivo
Antecedentes
- La tomografía de coherencia óptica (OCT) es una técnica de imagen no invasiva.
- Métodos tradicionales como la craneotomía pueden ser más invasivos y dañinos.
- Mantener la viabilidad cerebral durante la obtención de imágenes es crucial para obtener resultados precisos.
- El enfoque de cráneo delgado busca abordar estas preocupaciones.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método menos invasivo para la obtención de imágenes cerebrales.
- Mejorar la viabilidad del cerebro durante los procedimientos de obtención de imágenes.
- Obtener información estructural y funcional a partir de imágenes de tomografía de coherencia óptica (OCT).
Métodos Utilizados
- Anestesia del modelo de ratón antes de la cirugía.
- Reducción del grosor del cráneo utilizando fresas dentales.
- Obtención de imágenes de OCT a través del cráneo adelgazado.
- Evaluación de la información estructural y funcional cerebral a partir de las imágenes.
Resultados principales
- El método de cráneo delgado permite exitosamente la obtención de imágenes in vivo.
- Las imágenes obtenidas proporcionan valiosas perspectivas estructurales y funcionales.
- La técnica muestra potencial para mantener la viabilidad cerebral.
- Menos invasiva que los métodos tradicionales, reduce el daño potencial.
Conclusiones
- La ventana cortical con cráneo adelgazado es una alternativa viable para la obtención de imágenes cerebrales.
- Este método mejora la capacidad de estudiar la función cerebral in vivo.
- Las aplicaciones futuras podrían ampliarse a diversos estudios neurológicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Esta técnica permite la obtención de imágenes longitudinales mínimamente invasivas de la estructura y función corticales in vivo, lo que apoya la validación de objetivos en modelos de enfermedades neurodegenerativas. Al preservar la integridad cerebral, aumenta la confianza predictiva en estudios preclínicos y reduce la variabilidad biológica que podría dificultar la evaluación de la respuesta a fármacos. El método se posiciona como una plataforma reutilizable para la reducción de riesgos mecanicistas en las etapas iniciales de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante imágenes corticales estructurales y funcionales longitudinales.
- Valor operativo: Proporciona un sistema relevante para la enfermedad que permite evaluar la interacción con el objetivo y la modulación de vías a lo largo del tiempo.
- Valor predictivo: Facilita la alineación de biomarcadores y la preparación para cribados fenotípicos al ofrecer lecturas estructurales cuantitativas de alta resolución.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para la evaluación de compuestos en pasos posteriores con acceso óptico consistente.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante el adelgazamiento uniforme del cráneo y ventanas de imagen estables.
- Escalabilidad: Facilita la reutilización de la plataforma en múltiples sesiones de imagen, reduciendo la carga de preparación por sujeto.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la relevancia de la enfermedad al permitir la obtención de imágenes en redes corticales intactas y fisiológicamente activas.
- Valor operativo: Apoya la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica con mínima variación en los procedimientos.
- Reducción de riesgos: Disminuye las variables de confusión derivadas del trauma quirúrgico, mejorando la fiabilidad de los datos para decisiones de avance o interrupción.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la optimización del fármaco líder, proporcionando lecturas de imágenes estructurales y funcionales que aportan información sobre la comprensión mecanicista y los efectos del compuesto.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir imágenes in vivo repetidas de las respuestas corticales frente a perturbaciones.
- Selección: Proporciona disponibilidad para ensayos mediante la preparación reproducible de ventanas y una penetración estable de la señal para la selección longitudinal de compuestos.
- Análisis: Genera mediciones cuantitativas de variables dependientes, incluyendo el grosor cortical, la densidad vascular y la delimitación de capas estructurales, para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al preservar la viabilidad cortical y permitir la correlación con resultados conductuales o moleculares.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma de imagen reutilizable en lugar de un procedimiento terminal, apoyando diseños de estudios longitudinales en múltiples ramas experimentales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista mediante la visualización directa y repetida de la microestructura cortical.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y la reproducibilidad mediante protocolos definidos de adelgazamiento y criterios de visualización del punto final.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir múltiples puntos de datos por sujeto, reduciendo el uso de animales y aumentando el poder estadístico.
- Impacto en la cartera: Orienta la priorización ajustada al riesgo al proporcionar lecturas estructurales y funcionales tempranas que se correlacionan con el potencial de modificación de la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas microquirúrgicas y familiaridad con la fijación estereotáxica y el uso de fresas dentales.
- Depende del acceso a sistemas de OCT de dominio espectral con software de escaneo adecuado y control de espejos galvanométricos para la adquisición volumétrica.
- Necesita una estandarización entre equipos para garantizar una calidad constante de la ventana y una interpretación uniforme de los datos.
- Implica consideraciones de adaptación entre cepas y edades de ratones, ya que el grosor del cráneo y la respuesta de curación pueden variar.
- Está limitado por la necesidad de habilidad técnica para evitar fracturas del cráneo o hemorragias subdurales durante el adelgazamiento, lo cual puede comprometer la calidad de la señal y el bienestar animal.
