Name: Diluido-skull técnica de ventana cortical para En Vivo Tomografía de Coherencia Óptica de imagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Aprende a crear una ventana craneal de cráneo adelgazado en ratones para imagen in vivo con tomografía de coherencia óptica. Esta técnica menos invasiva preserva la viabilidad cerebral y permite obtener información estructural y funcional del sistema nervioso.

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Este trabajo fue apoyado por la prueba de UC Discovery subvención Concepto y por el NIH (R00 EB007241). Los autores también desean agradecer a Jacqueline Hubbard por su ayuda en este experimento.

1. Preparación quirúrgica <ol><li> Ratones hembra CD 1 entre las edades de 6-8 semanas se usaron en nuestros experimentos. </li><li> Se anestesia el ratón con una inyección intraperitoneal de una combinación de ketamina y xilazina (80 mg / kg ketamine/10 mg / kg de xilazina). Coloque el ratón sobre una almohadilla homeotérmico para garantizar una temperatura corporal óptima a ~ 37 ° C. Supervisar continuamente el nivel de anestesia por probar reflejos animal (por ejemplo, pellizcar pie con fórceps romos) e inyectar más anestesia cuando sea necesario. </li><li> Lubricar ambos ojos con un ungüento de lágrima artificial. Elimine los pelos en el cuero cabelludo con una navaja de afeitar y depilar residual usando 70% almohadillas con alcohol. Aplique una capa delgada de crema de depilación Nair sobre el cuero cabelludo y esperar 2 minutos para que haga efecto. Limpie suavemente el pelo Nair y restantes humedecido con solución salina hisopos de algodón y almohadillas de preparación con alcohol. Scalp ahora debe estar completamente sin pelo. </li><li> Desinfecte cuero cabelludo con un palo betadine hisopo y limpiar con 70% de etanol almohadillas de preparación. </li><li> Envuelva cuidadosamente el animal en paños quirúrgicos para garantizar una temperatura óptima del cuerpo de ~ 37 ° C y montar el animal en un marco estereotáxico para inmovilizar el cráneo. Golpee suavemente el cráneo para asegurar su estabilidad. Una lista de los materiales utilizados se proporcionan en la Tabla 1. </li></ol> 2. Diluido-skull Preparación ventana cortical <ol><li> Inicie la incisión en el punto de la línea media entre los ojos. Continuar caudalmente hasta el punto de la línea media entre las orejas. Parte de la piel con pinzas. </li><li> Localizar el área a ser diluido con un microscopio de disección y se retire suavemente la fascia usando unas pinzas. Seque el cráneo con hisopos de algodón estériles antes de crear la ventana cortical adelgazada. En nuestros experimentos, hemos creado un 4 × 4 mm adelgazada ventana craneal ~ 1 mm posterior y lateral al bregma. </li><li> Comience el adelgazamiento de la calavera con una fresa redonda de carburo con el tamaño de la broca de 0,75 mm en un taladro quirúrgico utilizando sólo su luz movimiento de barridoy. No aplique presión directa en el cráneo. Deje de perforar cada segundo 20-30 para eliminar el polvo de hueso con solución salina estéril y torundas de algodón y evitar el sobrecalentamiento del cráneo. La solución salina también ayuda a disipar el calor por todo el cráneo. </li><li> Una vez que la capa exterior del hueso compacto se elimina por completo la capa media del hueso esponjoso debe ser visible. Puede haber un poco de sangrado como los vasos sanguíneos son más evidentes en la capa de hueso esponjoso. Cambie a una fresa de piedra verde y continuar perforando con mucho cuidado ya que la capa esponjosa es más delicado. La fresa de piedra verde se retire el material menos hueso al crear uniformidad en toda la ventana craneal. Detener la perforación de vez en cuando para quitar el polvo de hueso y para enfriar el cráneo. </li><li> Finalmente, cuando el cráneo se ha vuelto más transparente y la vasculatura del cerebro es ahora visible, empezar a pulir el cráneo con una fresa de pulido. Esto permitirá una más precisa adelgazamiento mientras alisar el cráneo. Compruebe delgadez de la skull golpeando suavemente sobre ella con fórceps. Deje de pulido cuando el cráneo se vuelve ligeramente flexible. </li><li> La ventana craneal adelgazado ahora debe ser completamente lisa y reflectante y listo para la formación de imágenes (Figura 1). Debido a la naturaleza de los tejidos altamente dispersión del cerebro, el cráneo debe ser diluido a por lo menos 55 micras de profundidad de penetración óptima. Una lista de los materiales utilizados se proporcionan en la Tabla 1. </li></ol> 3. Tomografía de Coherencia Óptica de imagen <ol><li> Después de la cirugía se ha completado, compruebe tasa de respiración de los animales y los reflejos para asegurar un nivel adecuado de anestesia y administrar anestesia adicional si es necesario. Eliminar el animal a la estructura estereotáxica, mantener los animales envuelto en paños quirúrgicos, y el transporte de animales a la estación de formación de imágenes. </li><li> Antes de imágenes para verificar si existen signos reflejos y aplicar lágrimas artificiales adicional si es necesario. Montar los animales en el marco estereotáxico para asegurar el cráneo. </li><li> Lugar animal bajoOctubre cámara y la posición de la TSCW bajo el haz óptico (Figura 2). Una vista en sección transversal del cráneo y el cerebro ahora se puede visualizar (Figura 3). </li><li> La adquisición de datos puede comenzar una vez área de interés se encuentra. Para los propósitos de formación de imágenes, se utiliza espejos galvo para conseguir una ventana de imagen con una anchura de 4,0 mm. Una profundidad de imagen de 2 mm se obtuvo con 6 mW de potencia incidente y un punto focal 1 mm por debajo del cráneo adelgazada. Cada área transversal consistió de 2.048 cortes axiales con una velocidad de adquisición de 0,14 seg por imagen. </li><li> Exploraciones volumétricas del cerebro también se puede obtener mediante la recopilación de una serie de 2D imágenes transversales mediante el uso de dos conjuntos de espejos galvo de barrido XY con la primera espejo galvo barrido del haz en la dirección sagital y el segundo espejo de escaneo galvo en el coronal dirección. </li></ol>

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<li>Gill, A. S., Rajneesh, K. F., Owen, C. M., Yeh, J., Hsu, M., Binder, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+optical+detection+of+cerebral+edema+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Early optical detection of cerebral edema in vivo.</a> J. Neurosurg. 114, 470-477 (2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Proyección de imagen con OCT y un cráneo adelgazado-es una novela de neuroimagen técnica que sólo se ha investigado recientemente 15, 16. En nuestros experimentos, hemos demostrado la viabilidad de la SD-OCT imágenes a través de un TSCW en un modelo de ratón in vivo. A partir de nuestros resultados, el cráneo se adelgaza a aproximadamente 55 micras y con la profundidad de penetración se obtiene en aproximadamente 1 mm con una resolución de imagen de 8 micras y 20 micras en la dirección axial y latera...

Desde su introducción en la década de 1990, octubre se ha utilizado ampliamente para formación de imágenes biológicas de la estructura tisular y la función 2. Octubre genera imágenes transversales mediante la medición de retardo del eco de tiempo de 4 luz dispersada por la aplicación de fuente bajo la luz coherencia con un interferómetro de Michelson fibra óptica 2,4. SD-OCT, también conocido como dominio de Fourier OCT (OCT-DF), fue introducido por primera vez en 1995 5, y ofrece una modalidad de imagen superior en comparación con el tradicional dominio de tiempo OCT (OCT-DT). En SD-octubre, el brazo de referencia se mantiene estacionaria que resulta en una velocidad alta y ultra adquisición de imagen de alta resolución 6-9. Actualmente, los modelos TSCW se han utilizado en gran medida para aplicaciones in vivo de imágenes del cerebro de dos fotones microscopía en lugar de una craneotomía tradicional. Estos TSCW se han utilizado conjuntamente con una placa de cráneo personalizado o un cubreobjetos de vidrio 10-13 para proporcionar adicional imaging estabilidad. En nuestros estudios, hemos observado que los accesorios de este tipo no son necesarios para octubre de imagen cuando se utiliza un TSCW. Por lo tanto, la falta de una placa de cráneo o cubierta de vidrio se desliza permite una gama más amplia de tamaño de imagen de la ventana ya que pueden interferir con el haz óptico y modificar las imágenes octubre Una preparación adelgazada cráneo ha demostrado ser ventajosa en los estudios de imágenes del cerebro usando microscopía de dos fotones 10-13. En nuestros experimentos, utilizamos un sistema SD-OCT para la imagen de la corteza en vivo a través de un TSCW. Nuestra costumbre SD-OCT configuración de imagen contiene una banda ancha, de baja coherencia fuente de luz que consiste en dos diodos superluminiscente (SLD) con centro en 1295 nm con un ancho de banda de 97 nm que resulta en una resolución axial y lateral de 8 micras y 20 micras, respectivamente 14 . Con nuestro dispositivo de formación de imágenes ópticas, prevemos que las imágenes a través de un TSCW tiene un gran potencial en la identificación y la visualización de las estructuras y funciones en la juntacerebro ptically denso tejido.

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiales </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> La ketamina </td><td> Phoenix Pharmaceuticals </td><td> 57319-542-02 </td><td></td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> Akorn, Inc. </td><td> 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> Lágrimas artificiales Ungüento </td><td> Rugby </td><td> 0536-6550-91 </td><td></td></tr><tr><td> Nair </td><td> Church &amp; Dwight Co., Inc. </td><td> 4010130 </td><td></td></tr><tr><td> Estéril Alcohol Prep Pad </td><td> Kendall Healthcare </td><td> 6818 </td><td></td></tr><tr><td> Aplicadores con punta de algodón </td><td> Fisherbrand </td><td> 23-400-115 </td><td></td></tr><tr><td> Betadine solución bastoncillo con hisopo </td><td> Purdue Productos &lt;/ Td&gt; <td> 67618-153-01 </td><td></td></tr><tr><td> Solución salina, 0,9% </td><td> Phoenix Pharmaceuticals </td><td> 57319-555-08 </td><td></td></tr><tr><td> Estereotáctica Frame </td><td> Stoelting </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Alta velocidad Taladro quirúrgico </td><td> Foredom </td><td></td><td> 38.000 rpm </td></tr><tr><td> Carburo de fresa redonda </td><td> Stoelting </td><td></td><td> 0,75 mm </td></tr><tr><td> Dura-Green Stones </td><td> Shofu </td><td></td><td> Shank: HP Forma: BA1 </td></tr><tr><td> CompoMaster gruesa y pulidora CompoMaster </td><td> Shofu </td><td></td><td> Forma: Mini-Pt. </td></tr><tr><td> SpaceDrapes </td><td> Braintree Scientific, Inc. </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

diluido-skull técnica de ventana cortical para<em&gt; en vivo</em&gt; tomografía de coherencia Óptica de imagen

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Tomografía de Coherencia Óptica (OCT) es una técnica de imagen biomédica con alta resolución espacial y temporal. Con su enfoque mínimamente invasivo octubre se ha utilizado ampliamente en oftalmología, dermatología, gastroenterología y 1-3. Usando una ventana adelgazado-skull cortical (TSCW), empleamos dominio espectral OCT (SD-OCT) modalidad como una herramienta para la imagen de la corteza en vivo. Comúnmente, un cráneo abierto-se ha utilizado para neuroimagen, ya que proporciona más versatilidad, sin embargo, un enfoque TSCW es menos invasiva y es un medio eficaz para la formación de imágenes a largo plazo en los estudios de neuropatología. Aquí, se presenta un método de creación de un TSCW en un modelo de ratón para la formación de imágenes in vivo octubre de la corteza cerebral.

Después de crear una ventana adelgazada sobre la corteza cerebral de la vasculatura ahora debería ser más visualmente prominente (Figura 1) y permitirá una profundidad de imagen más profundo (hasta 1 mm). La corteza derecha se adelgaza a aproximadamente 55 micras, en comparación con un cráneo normal medido a 140 micras (figura 1) y proporciona una mayor claridad óptica. Además adelgazamiento a 10-15 micras es posible 11 no obstante, es necesario que el uso de cubreobjetos de ...

Se presenta un método de creación de una ventana adelgazada cráneo cortical (TSCW) en un modelo de ratón para<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de OCT de la corteza cerebral.

Diluido-skull técnica de ventana cortical para<em&gt; En Vivo</em&gt; Tomografía de Coherencia Óptica de imagen

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

El objetivo general de este procedimiento es crear una ventana craneal delgada del cráneo en un modelo de ratón para obtener imágenes de tomografía de coherencia óptica in vivo del cerebro. Esto se logra primero anestesiando al animal y preparándolo para la cirugía. A continuación, adelgace el cráneo con varias rebabas dentales.El paso final es obtener imágenes OCT del cerebro in vivo a través de la delgada ventana craneal del cráneo. En última instancia, la información estructural y funcional del cerebro se puede obtener a partir de las imágenes OCT resultantes. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la craniectomía o las ventanas de cubreobjetos, es que la ventana finical es menos invasiva y tiene más probabilidades de mantener la integridad biológica y la viabilidad del cerebro.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de trastornos neurológicos, ya que la OCT proporciona una alta resolución espacial y temporal y proporciona una penetración de profundidad superior en comparación con la microscopía confocal y la microscopía de dos fotones. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades para crear una superficie de cráneo uniformemente delgada sin introducir fracturas de cráneo o sangrado subdural. Para comenzar este procedimiento, anestesia a un ratón CD de entre seis y ocho semanas de edad con una inyección intraperitoneal de ketamina y xilacina.A continuación, coloque el ratón sobre una almohadilla o manta homeomática para garantizar la temperatura corporal óptima de aproximadamente 37 grados centígrados durante la preparación quirúrgica, controle continuamente el nivel de anestesia probando los reflejos del animal e inyecte más anestesia cuando sea necesario. A continuación, lubrique ambos ojos con el ungüento de lágrimas artificiales. Retira el vello del cuero cabelludo con la maquinilla.A continuación, retira los restos de pelo recortado con una almohadilla o un hisopo. Después de eso, aplique una capa delgada de crema depilatoria sobre el cuero cabelludo. Después de dos minutos, limpie suavemente la crema y el cabello restante con solución salina, hisopos de algodón humedecidos y almohadillas de preparación con alcohol.Ahora desinfecte el cuero cabelludo con un bastoncillo Betadine y límpielo con almohadillas de preparación de etanol al 70%. A continuación, monta al animal en un marco estereotáxico para inmovilizar el cráneo. Golpea ligeramente el cráneo para asegurar su estabilidad.En este procedimiento, comience la incisión en el cuero cabelludo en el punto de la línea media entre los ojos. Continúe mimosamente hasta el punto de la línea media entre la parte de las orejas, la piel se colgala con pinzas. A continuación, localice el área que se va a diluir bajo un microscopio de disección.Use fórceps para raspar el cráneo y eliminar cualquier fascia residual. Luego seque el cráneo con hisopos de algodón estériles antes de crear una ventana cortical adelgazada de cuatro por cuatro milímetros de aproximadamente un milímetro de torema posterior y lateral. Use un taladro manual quirúrgico con una rebaba redonda de carburo con un ligero movimiento de barrido para adelgazar el cráneo.No aplique presión directa sobre el cráneo. Deje de perforar cada 20 a 30 segundos para eliminar el polvo óseo con solución salina estéril e hisopos de algodón, y para evitar el sobrecalentamiento del cráneo. La solución salina también ayudará a disipar el calor en todo el cráneo.Una vez que la capa externa del hueso compacto se ha eliminado por completo, la capa media del hueso esponjoso debe ser visible. Puede haber un ligero sangrado ya que los vasos sanguíneos son más evidentes en la capa ósea esponjosa. Cambie a una rebaba de piedra verde y continúe perforando con mucho cuidado.Como la capa esponjosa es más delicada, la rebaba de piedra verde eliminará menos material óseo y asegurará la uniformidad en toda la ventana craneal. Deje de perforar de vez en cuando para eliminar el polvo óseo y enfriar el cráneo. Finalmente, cuando el cráneo se haya vuelto más transparente y la vasculatura en el cerebro sea visible, comience a pulir el cráneo con una fresa pulidora, verifique el grosor del cráneo golpeándolo suavemente con pinzas para detener el pulido.Cuando el cráneo se vuelve ligeramente flexible, la ventana craneal adelgazada ahora debe ser completamente lisa y reflectante y estar lista para la toma de imágenes. Debido a la naturaleza de los tejidos del cerebro altamente dispersos, el cráneo debe adelgazarse a al menos 55 micras para una penetración óptima en profundidad. Una vez finalizada la cirugía, verifique la frecuencia respiratoria del animal a través de la inspección visual y los reflejos para garantizar el nivel adecuado de anestesia y administre anestesia adicional Si es necesario, coloque al animal debajo de la cámara OCT, luego coloque la ventana craneal del cráneo delgado debajo del haz óptico.Ahora se puede visualizar una vista transversal del cráneo y el cerebro. Puede comenzar la adquisición de datos. Una vez localizada la zona de interés para la obtención de imágenes, se explora el haz de OCT sobre una ventana cortical de imagen con un ancho de 4,0 milímetros y se obtiene una profundidad de imagen de dos milímetros con seis milivatios de potencia incidente y una focal de 0,1 milímetros por debajo del cráneo delgado.Cada área de sección transversal consistió en 2048 escaneos axiales con una tasa de adquisición de 0,14 segundos por imagen. Este método en particular nos ha permitido identificar estructuras específicas en nuestras imágenes transversales de OCT. Esta figura muestra una imagen OCT parasagital de la corteza debajo de un cráneo normal, y aquí muestra una imagen OCT parasagital debajo de un cráneo delgado.Las estructuras del cerebro son más visibles bajo una ventana craneal delgada en comparación con un cráneo normal. Además, también se obtiene una imagen OCT de corte transversal coronal para facilitar la identificación de las estructuras de la línea media. Las exploraciones volumétricas del cerebro también se pueden obtener mediante la recopilación de una serie de imágenes transversales en 2D mediante el uso de dos conjuntos de espejos gal O para la exploración XY, con el primer espejo gal O escaneando el haz en la dirección sagital y el segundo espejo gal escaneando la dirección coronal.Una vez dominada, esta técnica se puede completar en 10 minutos si se realiza correctamente. Si bien es importante intentar este procedimiento para adelgazar uniformemente el cráneo para garantizar una penetración adecuada de la señal durante las imágenes de OCT, después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar una ventana cortical de cráneo delgada para fines de imágenes de OCT.

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

Se describe un método para visualizar repetidamente microglia murina y los monocitos...

Una delgada del cráneo ventana Técnica para la crónica de dos fotones En vivo Imágenes de la microglía murina en los modelos de la neuroinflamación

En este material de vídeo y complementaria, se muestra un protocolo para la...

Imagen crónica de la corteza visual del ratón usando una preparación de Diluido-cráneo

Se presenta un método para formar una ventana de imagen en el cráneo del ratón que se extiende milímetros y es estable durante meses sin inflamación del cerebro. Este método es muy adecuado para estudios longitudinales de flujo de sangre, la dinámica celular, y células / estructura vascular utilizando microscopía de dos fotones.

Un pulido y reforzado Diluido cráneo-Ventana para a largo plazo de imágenes del cerebro de ratón

Mediante la combinación de un pulido y reforzado delgada cráneo (puertos) craneal ventana y glioblastoma (GBM) la inyección de células, se puede observar la iniciación glioma y el crecimiento de las células de GBM inyectados en el cerebro de un ratón vivo longitudinalmente.

Imágenes Glioma Iniciación<em&gt; En Vivo</em&gt; A través de un pulido y reforzado fina calavera ventana craneal

Las imágenes de lapso de tiempo en el animal vivo proporcionan información valiosa sobre la reorganización estructural en el cerebro intacto. Aquí, presentamos una preparación de cráneo adelgazado que permite la obtención de imágenes transcraneales de estructuras sinápticas marcadas con fluorescencia en la corteza del ratón vivo mediante microscopía de dos fotones.

De dos fotones<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación

Aquí, describimos un enfoque de microscopía óptica semi-invasiva para la inducción de un coágulo fototrombótico de Bengala Rosa en la corteza somatosensorial de un ratón in vivo.  Se describen los aspectos técnicos del procedimiento de imagen, desde la inducción de un evento fototrombótico hasta la aplicación y la recopilación de datos.

Rosa de Bengala Photothrombosis por imagen óptica confocal<em&gt; En Vivo</em&gt;: Un modelo de solo recipiente Stroke

Este manuscrito describe un procedimiento para realizar un seguimiento de la remodelación de la vasculatura cerebral durante la acumulación de placa amiloide in vivo usando longitudinal microscopía de dos fotones. Una preparación-cráneo adelgazada permite la visualización de los tintes fluorescentes para evaluar la progresión del daño cerebrovascular en un modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer.

Longitudinal<em&gt; En Vivo</em&gt; Obtención de imágenes de la vasculatura cerebral: Importancia de las enfermedades del sistema nervioso central

Se describe un procedimiento experimental para medir la actividad neuronal a través de dos ventanas ópticas arriba bilateral corticies somatosensorial primaria (S1) en Thy1-GCaMP6s de ratones transgénicos usando fotones 2 (2P) microscopia en vivo.

Imágenes de la actividad neuronal en la corteza somatosensorial primaria usando Thy1-ratones transgénicos GCaMP6s

Aquí se presenta un protocolo para la implantación de una ventana craneal crónica para la obtención de imágenes longitudinales de células cerebrales en ratones despiertos y con la cabeza restringida.

Implantación de una ventana craneal para imágenes repetidas in vivo en ratones despiertos

Introdujimos una técnica de imagen novedosa llamada Tomografía de Interferencia Óptica Multicapa (OMLIT), que permite la imagen imparcial de todas las células en muestras cerebrales a mesoescala y puede integrarse perfectamente en el flujo de trabajo de imagen de la microscopía electrónica de barrido serial basada en cinta en la misma muestra.

Un método de imagen óptica compatible con microscopía electrónica de barrido para el mapeo cerebral mesoscópico de todas las células

Aprende a crear una ventana craneal de cráneo adelgazado en ratones para imagen in vivo con tomografía de coherencia óptica. Esta técnica menos invasiva preserva la viabilidad cerebral y permite obtener información estructural y funcional del sistema nervioso.

Diluido-skull técnica de ventana cortical para

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