Todo el monte ARN fluorescente In situ La hibridación de Drosophila Los embriones

Aquí se describe un fluorescente de todo el montaje

Este procedimiento describe un método optimizado de peces para evaluar las características de expresión y localización de ARN en embriones de Drosophila de montaje entero. Esto se logra sintetizando primero una sonda de ARN marcada, complementaria a un Sr. NA o un ARN no recubrimiento de interés, mediante la transcripción in vitro de una plantilla de ADN seleccionada adecuadamente. Paralelamente, se utilizan jaulas de población de moscas para recolectar, fijar y permear embriones de la etapa de desarrollo deseada.

Después de varios pasos posteriores a la fijación, los embriones se hibridan con la sonda de ARN antisentido marcada. Finalmente, después de un lavado exhaustivo de las muestras, la sonda hibridada se detecta mediante inmunomarcaje con un anticuerpo específico y reactivos de detección conjugados con fluorocromo, proporcionando así una lectura sensible de la distribución del ARN objetivo. En última instancia, los resultados producen señales fluorescentes altamente resueltas que se analizan mediante microscopía de fluorescencia estándar para documentar las características de expresión espacial y temporal del ARN objetivo durante la embriogénesis de Drosophila.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el Northern blot o el R-T-P-C-R, es que se puede evaluar la expresión de ARN dentro de una muestra de tejido intacta. Si bien este método está destinado al análisis de las propiedades de expresión de ARN en embriones tempranos de Drosophila, también se puede emplear para el análisis de embriones en etapas posteriores de desarrollo de tejido diseccionado de larvas o moscas adultas. Un aspecto importante de nuestro procedimiento es el aumento del número de muestras que podemos lograr mediante la realización de peces en el lugar de PCR, lo que aumenta sustancialmente el rendimiento del enfoque.

Los miembros del laboratorio que demuestran este procedimiento incluyen resistencia a la investigación de pregrado, estudiantes de posgrado y becarios postdoctorales. Comience con jaulas de población bien alimentadas. Reemplace el plato con un plato de levadura de jugo de manzana y deje las moscas durante una hora a 25 grados centígrados.

Luego, reemplace la placa de levadura de jugo de manzana para cosechar embriones en etapa temprana. Incubar la jaula a 25 grados centígrados y esperar hasta que se haya alcanzado la etapa de desarrollo deseada de los embriones mientras espera en una campana química, mezcle los productos químicos para hacer formaldehído al 37% en un vial de inhalación de vidrio. Hervir la solución hasta que el polvo de PFA se disuelva por completo.

Luego enfríelo a temperatura ambiente y fíltrelo en un nuevo vial de centelleo. A continuación, prepare una solución de fijación bifásica. Combine PBS con 37% de formaldehído en un vial de centelleo y luego agregue heptano cuando esté listo.

Coseche los embriones del plato de jugo de manzana a temperatura ambiente, agua del grifo y barrido delicado con un pincel fino. Transfiera los embriones resuspendidos a una canasta y enjuáguelos con agua tibia del grifo. A continuación, recubre los embriones durante 90 segundos bañando la cesta en una solución fresca de lejía al 3%.

Luego retira la lejía con agua tibia del grifo hasta que el olor a lejía desaparezca. Para recoger los embriones, desmonte la cesta de recogida y transfiera suavemente los embriones a la solución de fijación bifásica. Usando el pincel, los embriones se acumularán en la interfaz entre las capas de PBS y heptano.

Ahora selle los viales de centelleo, fíjelos a un mezclador de vórtice y agítelos durante 20 minutos en la configuración más baja. Después de la agitación, deseche la mayoría de las fases PBS inferior y heane superior con una pipeta de pasto. A continuación, aspire la mezcla restante en la pipeta y abandone con cuidado la fase inferior sin perder los embriones.

Depositar los embriones en un tubo de 1,5 mililitros que contiene una solución bifásica de 500 microlitros de heptano y 500 microlitros de metanol. Agite el tubo vigorosamente durante 30 a 45 segundos para romper las membranas de la rótula. Una vez agrietados, los embriones se hundirán en el metanol.

Deseche la fase superior y los embriones no agrietados y agregue un mililitro de metanol. Ahora agite brevemente el tubo durante cinco segundos y lave los embriones tres veces con metanol. Después de los lavados, los embriones pueden almacenarse durante varios meses a menos 20 grados centígrados.

Comience añadiendo 500 microlitros de PK a cada uno de los embriones e incube las muestras durante 10 minutos a temperatura ambiente sin agitar. Tenga mucho cuidado de dañar las muestras digiriéndolas en exceso con proteína a k, o mediante una manipulación descuidada. Durante la incubación PK, mezcle los embriones cada dos minutos inyectándolos con una pipeta.

Después de 10 minutos, pon los embriones en hielo durante una hora. Después de una hora, retire la solución PK a temperatura ambiente. Lavar los embriones dos veces con glicina en PBT durante dos minutos.

Ahora, fije las muestras durante 20 minutos en un mililitro de 3,7% de formaldehído en PBT con balanceo. Lave el formaldehído con cinco enjuagues en PBT. A continuación, enjuague los embriones con un mililitro de solución de PBT y HI de volúmenes iguales, y sustituya la mezcla por 0,5 a un mililitro de solución pura.

En este punto, los embriones pueden almacenarse durante varios días o semanas a menos 20 grados centígrados. En una placa de 96 pocillos, alícuota de 10 a 15 microlitros de embriones asentados por pocillo. Utilice una punta de diámetro ancho para evitar dañar los embriones.

Ahora prepare la solución de prehibridación hirviendo 100 microlitros de solución de hype por muestra. Bueno, durante cinco minutos, enfríe la solución de Pre-Hype en hielo durante cinco minutos y luego agregue 100 microlitros a cada plato que contiene las muestras de embriones. Recupere la sonda de ARN preparada cuantificada por un espectrofotómetro NanoDrop.

Además, para verificar la calidad de la sonda, ejecute uno o dos microlitros de la misma en un agrogel. Ahora, para cada muestra, diluya unos 100 nanogramos de sonda en 100 microlitros de solución de HI. Es vital trabajar en condiciones libres de ARN.

Al manipular la sonda. Calienta la solución a 80 grados centígrados durante tres minutos. Luego enfríelo sobre hielo durante al menos cinco minutos.

Se puede mantener refrigerado durante varias horas. Recupere la placa y retire la solución Pre-Hype de los embriones por aspiración. A continuación, añada 100 microlitros de solución de hype con la sonda de ARN a cada uno.

Bien hibridar la sonda a 56 grados centígrados durante 12 a 16 horas al día siguiente. Una serie de cinco soluciones se precalientan a 56 grados centígrados. La primera es pura solución de exageración y la última es PBT puro.

Los otros tres son la dilución de HI en PBT. Una vez calentadas, enjuague rápidamente las muestras una vez en una solución pura de exageración. A continuación, realice tres lavados de 15 minutos, comenzando con la solución de hype menos diluida seguida de cada una de las diluciones sucesivas.

Por último, lave las muestras cuatro veces durante cinco minutos en PBT puro. A continuación, lleve las muestras a temperatura ambiente. Ahora proceda con las aplicaciones de anticuerpos para detectar la sonda y mejorar la mezcla de muestras.

Durante estos pasos, la placa se puede colocar en una pequeña caja que se puede acoplar a un mezclador mutante utilizando el protocolo descrito, el gen de regla de par clásico se analizó en distintas etapas de la embriogénesis. El análisis de los peces reveló cómo la amplia expresión inicial en la porción media del embrión en la etapa embrionaria cuatro se refina en un patrón de rayas segmentadas. En etapas posteriores, los peces se realizaron utilizando varias sondas de ARN antisentido y marcadas con embriones de Drosophila de cero a cuatro horas de edad.

Las sondas hibridadas se detectaron mediante incubaciones secuenciales con un antígeno biotinilado y un anticuerpo ávido de estreptococos en HRP y ceramida. Las muestras fueron montadas y analizadas por microscopía de fluorescencia. Se observó un amplio mosaico de resultados de peces en estos embriones de la etapa cuatro a siete Al intentar este procedimiento, es importante tomar precauciones en varios pasos, como proteger sus sondas de ARN y la degradación trabajando en condiciones libres de ARN y utilizando suministros libres de ARN.

Una vez que se domina este básico, se pueden agregar pasos adicionales al método para hacer experiencia de etiquetado múltiple con el fin de visualizar diferentes ARN o marcadores de proteínas específicas en la misma muestra. Después de ver este video, tendrá una buena idea de cómo realizar la hibridación fluorescente en C dos para documentar la expresión o la dinámica de localización subcelular de su ARN favorito durante la embriogénesis de Drosophila Happy Fishing.