Name: El análisis de la accesibilidad al disolvente de los residuos de cisteína en Maize rayado fino virus Partículas similares al virus producidas en Nicotiana benthamiana Plantas y reticulación de péptidos a VLPs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprende a analizar la accesibilidad al disolvente de residuos de cisteína en partículas similares al virus de Maize rayado fino producidas en Nicotiana benthamiana. Este método permite unir péptidos mediante reticulación química para aplicaciones en nanotecnología.

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1. Virus Inoculación y purificación de las VLP plantas de Nicotiana benthamiana <ol><li> Producir recubiertas T7-ARN transcritos de Potato virus X (PVX)-basados ​​en plásmidos vectores que transportan MRFV de tipo salvaje (wt) y las proteínas Cys-mutado capa (CP) 12 genes, utilizando T7-mMessage mMachine de Ambion Kit. </li><li> Para cada reacción de transcripción T7, inocular dos hojas completamente expandidas de N. benthamiana con 10 reacciones mu l y se incuban las plantas durante 10 días en invernadero, a 60% de humedad durante 16 h con luz (25.000-30.000 lux) a 25 ° C y 8 horas de oscuridad a 20 ° C. </li><li> Harves camisetas N. benthamiana infectadas por el virus hojas 10 días después de la inoculación (dpi), pese el tejido de la planta (50 gramos), y meterlo en hielo. </li><li> Homogeneizar el material vegetal en una mezcladora en presencia de 100 ml de una solución enfriada de 0,5 M de citrato sódico, pH 5,5 (uso 2 ml de tampón por gramo de tejido de la planta). </li><li> Filtrar homogeneizado a través de 3 capas de cheeseclanto y clarificar por centrifugación a 27.000 xg durante 30 min. Transferir el sobrenadante a un cilindro graduado fría, medir el volumen y, a continuación, transferir a un matraz estéril fría. Descartar el sedimento. </li><li> Procesar el sobrenadante mediante la adición de 10% de polietilenglicol 8.000 (PEG 8.000), se agita durante 15 min a 4 ° C, y se incuba durante 45 min a 4 ° C para precipitar las partículas parecidas a virus-(VLPs)-PEG matriz. </li><li> Centrifugar la muestra a 27.000 xg durante 20 min a 4 ° C y retirar el sobrenadante. </li><li> Procesar el precipitado mediante la adición de 8 ml de 0,05 M tampón citrato de Na, 5,5 que contiene 2% de Triton X-100 pH. Remolino tubos de la centrífuga bien para liberar el sedimento. Transferir el sedimento y tampón a un vaso de precipitados estéril enfriada. Enjuague los tubos inmediatamente con 2 ml del mismo tampón y añadir al vaso de precipitados. Se agita la suspensión a 4 ° C hasta que los gránulos se disolvieron (generalmente 1 hr). </li><li> Clarificar por centrifugación durante 5 min a 27.000 xg, desechar el sedimento, y proceso el sobrenadante por centrifugación a 140.000 xg durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Resuspender el precipitado en 1 ml de 0,05 M de citrato sódico, pH 5,5 y colocar la suspensión en la parte superior de un gradiente de sacarosa al 10-40% hecha en 0,05 M de citrato sódico, pH 5,5. </li><li> Centrifugar el gradiente durante 3 horas a 140.000 xg a 4 ° C. </li><li> Brillar una luz sobre la parte superior del tubo de centrífuga y recoger la banda de dispersión de luz superior a 4 cm de la parte superior del tubo, se diluye con 0,05 M de citrato sódico, pH 5,5, y se centrifuga durante 3 horas a 140.000 xg a 4 ° C. </li><li> Resuspender el precipitado en 0,5 ml de agua estéril y se almacena a 4 ° C durante hasta seis meses. </li><li> Cuantificar la concentración de las VLP realizando un ensayo de proteínas de Bradford. El rendimiento de las VLP es de entre 1 y 3 mg / g de tejido de la planta. </li></ol> 2. Fluoresceína-5-maleimida-etiquetado Reacciones de VLPs <ol><li> Preparar una solución 1 mM de fluoresceína-5-maleimida (427,37 g / mol) en 50 mM de sodio Phosphate tampón, pH 7,0, 1 mM EDTA. Mezclar utilizando el vórtice y verificar la completa disolución. Evite que el tubo de la luz utilizando una lámina de aluminio. </li><li> Añadir fluoresceína-5-maleimida para VLPs producidas en la etapa 1 y mezclar. Usar un exceso molar de 25-veces de fluoresceína-5-maleimida para la cantidad molar de sulfhidrilos. Generalmente, usando 30 l de VLPs en la concentración de 1 g / l y 60 l de la solución de fluoresceína-5-maleimida produce resultados aceptables. </li><li> Se incuba la reacción durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. </li><li> Terminar la reacción mediante la adición de ditiotreitol (DTT) a una concentración final de 50 mM. </li><li> Eliminar sin reaccionar fluoresceína utilizando una columna de centrifugación de desalado (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) y centrifugación durante 2 min a 1.500 xg, a temperatura ambiente. </li><li> Para análisis SDS-PAGE, añadir 10 l de 2 x SDS-PAGE de tampón de muestra de Laemmli a 10 l de cada reacción. La tienda de la proteína marcada protegido de la luz a 4 º C hasta por un mes ode un solo uso en alícuotas a -20 ° C hasta 3 meses. </li></ol> 3. Etiquetado de Reacción y Determinación de Constitución Biotina <ol><li> Utilice la desalación columnas de centrifugado (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) para llevar a cabo un intercambio de tampón de agua a salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,0 de las VLPs producidas en el paso 1. </li><li> Preparar una solución madre 20 mM de maleimida-PEG2-biotina mediante la adición de 190 l de PBS en n-Weigh maleimida-PEG2-biotina y mezclar pipeteando arriba y abajo. </li><li> Añadir maleimida-PEG2-biotina a las VLPs y mezclar. Usar un exceso molar de 10 veces de reactivo de soluciones VLPs ≤ 2 mg / ml. </li><li> Se incuba la reacción a temperatura ambiente durante 4 h. </li><li> Eliminar no reaccionado maleimida-PEG2-biotina usando una columna de centrifugación de desalado (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) y centrifugación durante 2 min a 1.500 xg, a temperatura ambiente. </li><li> Determine los moles de biotina por moles de VLP utilizando el Kit de cuantificación Pierce Biotina (Thermo Scientific) y foguientes instrucciones del fabricante. </li></ol> 4. La reticulación de Cys 2-VLP y el péptido F <ol><li> VLPs que resultó en residuos de cisteína disponibles para la reticulación en el paso 2 (Cys 2-VLPs) se utilizó en la etapa siguiente. Preparar una nueva reticulación solución madre (28,63 mM) disolviendo 10 mg de NHS-peg4-maleimida reticulante en 680 l de sulfóxido de dimetilo. </li><li> Disolver un 17 (F)-amino ácido péptido largo (LLPNMOKDKEACAKAPL) en 50 l de tampón de conjugación (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) en una concentración de 0,1 mM. </li><li> Añadir 4 l de agente de reticulación a 50 l de péptido disuelto (proteína-NH2) en 1 mM de concentración final (que es un exceso molar de 10-veces para 0,1 mM de solución de péptido). </li><li> Se incuba la reacción durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Purificar reticulado péptido usando una columna de desalación (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) equilibrada con tampón de conjugación (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) mediante centrifugación a 1.500 xgdurante 1 min a temperatura ambiente. </li><li> Configurar una mezcla de reacción de la combinación de VLPs (proteína-SH) y reticulado péptido (proteína-NH2) en una relación molar determinada por el número de tioles y aminas activadas implicadas en la reacción y la diferencia de peso molecular entre VLPs y péptido. </li><li> Incubar la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Para el análisis de transferencia Western, mezclar el producto resultante conjugado 1:1 con tampón de Laemmli, hervir durante 10 min, y proceder con SDS-PAGE en un molde pre-10-20% Tris-Glicina gel (Invitrogen), seguido de electrotransferencia sobre una membrana de nitrocelulosa (Invitrogen). Bloquear las membranas con 1 x PBS, pH 7,2 que contiene 0,05% de Tween-20 (PBS-Tween) y 5% de polvo de leche descremada y la sonda con el péptido de anticuerpos específicos seguidos por la fosfatasa apropiada anticuerpo secundario marcado. </li></ol>

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<li>Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+viruses+as+biotemplates+for+materials+and+their+use+in+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).</li>
</ol>

La mención de los nombres comerciales de los productos comerciales de la publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación ni aprobación por el Departamento de Agricultura de EE.UU..

El método presentado aquí permite un análisis muy sensible y rápida de cisteínas reactivas presentes en la superficie de VLPs producidos por plantas así como en otros complejos de proteínas. Las maleimidas son tiol reactivos específicos, que reaccionan con sulfhidrilo libres que contienen moléculas para formar enlaces tioéter estables. Este método se basa en la especificidad de las maleimidas para reaccionar con grupos sulfhidrilo que no participan en las interacciones con otros aminoácidos. Preservar la estructura nati...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> El número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Thinwall, Ultra-Clear Tubos </td><td> Beckman </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> mMessage mMachine T7 Kit </td><td> Tecnologías de la Vida </td><td> AM1344M </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresceína-5-maleimida </td><td> Thermo Scientific Life Technologies </td><td> 46130 F150 </td><td> 46130 está fuera de orden con sustituto F150 </td></tr><tr><td> Pierce Biotina Kit cuantificación </td><td> Thermo Scientific </td><td> 28005 </td><td></td></tr><tr><td> EZ-Link maleimida PEG2-Biotina, No-Weigh Formato </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21901 </td><td></td></tr><tr><td> SM (PEG) n Reticuladores </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22107 </td><td></td></tr><tr><td> 10-20% de Tris-Glicina gel </td><td> Invitrogen </td><td> EC61352 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón de Laemmli </td><td> Bio-Rad </td><td> 1610737 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Glicina SDS funcionamiento de amortiguación </td><td> Invitrogen </td><td> LC2675 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Glicina Transfer Buffer </td><td> Invitrogen </td><td> LC3675 </td><td></td></tr><tr><td> Membrana de nitrocelulosa Sandwich Papel de Filtro </td><td> Invitrogen </td><td> LC2001 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfatasa Etiquetada anticuerpo purificado por afinidad para IgG de conejo </td><td> Kirkegaard y Perry Laboratories </td><td> 0751516 </td><td></td></tr><tr><td> NBT / BCIP sustrato de fosfatasa </td><td> Kirkegaard y Perry Laboratories </td><td> 508107 </td><td></td></tr></tbody></table>

el análisis de la accesibilidad al disolvente de los residuos de cisteína en<em&gt; maize rayado fino virus</em&gt; partículas similares al virus producidas en<em&gt; nicotiana benthamiana</em&gt; plantas y reticulación de péptidos a vlps

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Imitando y explotar las propiedades del virus y las características físico-químicas y físicas es una promesa de aportar soluciones a algunos de los desafíos más apremiantes del mundo. La enorme gama y los tipos de virus, junto con sus propiedades intrigantes potencialmente dar un sinfín de oportunidades para las aplicaciones en las tecnologías basadas en el virus. Los virus tienen la capacidad de auto-ensamblarse en partículas con forma discreta y tamaño, la especificidad de la simetría, la polivalencia, y propiedades estables bajo un amplio rango de condiciones de temperatura y pH. No es sorprendente que, con una gama tan notable de las propiedades, los virus se proponen para uso en biomateriales 9, las vacunas 14, 15, materiales electrónicos, herramientas, químicos y electrónicos molecular contenedores 4, 5, 10, 11, 16, 18, ​​12. A fin de utilizar los virus en la nanotecnología, deben ser modificados a partir de sus formas naturales para impartir nuevas funciones. Este desafiante proceso se puede realizar a través de varios mecanismos incluyendo la modificación genética del genoma viral y químicamente unir moléculas extrañas o deseada a los grupos reactivos de partículas de virus 8. La capacidad de modificar un virus depende principalmente de las propiedades físico-químicas y físicas del virus. Además, las modificaciones genéticas o físico-químico necesario llevar a cabo sin afectar negativamente a la estructura del virus nativo y la función virus. Rayado fino del maíz de virus (MRFV) proteínas de la capa auto-ensamblan en Escherichia coli productoras de VLPs estables y vacío que están estabilizadas por proteína-proteína y las interacciones que se pueden utilizar en aplicaciones basados ​​en virus tecnologías 8. VLPs producidas en plantas de tabaco se examinaron como un andamio sobre el que puede ser una variedad de péptidos covalentemente muestra 13. Aquí, se describen los pasos para 1) determinar cuál de las cisteínas accesible al disolvente en una cápside de virus están disponibles para la modificacióncatiónico, y 2) Bioconjugate péptidos a las cápsidas modificadas. Mediante el uso de los residuos de aminoácidos nativos o mutacionalmente inserta-ácidos y las tecnologías estándar de acoplamiento, una amplia variedad de materiales han sido presentados en la superficie de virus de plantas tales como, virus del mosaico del bromo 3, virus del moteado del clavel 12, caupí virus del moteado clorótico 6, del mosaico del tabaco 17 virus, virus mosaico amarillo del nabo 1, y MRFV 13.

La expresión transitoria de mutantes MRFV capa de proteínas (CP) genes en N. benthamiana plantas en un vector PVX VLPs basadas productoras se describe en la figura 1. La modificación capa MRFV gen de la proteína se amplifica por PCR y se coloca entonces bajo el control transcripcional del promotor subgenómico de CP duplicada en un vector basado en PVX, pP2C2S 2, (un regalo de D. Baulcombe, Laboratorios Sainsbury, Norwich, Inglaterra). En vitro la transcripción del ARN produc...

Un método para analizar la accesibilidad al disolvente del grupo tiol de residuos de cisteína de<em&gt; Maize rayado fino virus</em&gt; (MRFV)-partículas similares a virus (VLPs), seguido por un péptido reacción de reticulación se describe. El método tiene la ventaja de la disponibilidad de varios grupos químicos en la superficie de las VLP que pueden ser dianas para reacciones específicas.

El análisis de la accesibilidad al disolvente de los residuos de cisteína en<em&gt; Maize rayado fino virus</em&gt; Partículas similares al virus producidas en<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Plantas y reticulación de péptidos a VLPs

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en realizar un análisis de accesibilidad al disolvente de los residuos de cisteína en la superficie de partículas similares a virus o VLP, seguido del entrecruzamiento de péptidos con cisteína en las partículas similares a virus. Esto se logra primero clonando la proteína de la cubierta del virus del rayado fino del maíz o MRFV en un vector viral basado en el virus X de la papa. A continuación, se inoculan plantas de N. benthamiana con el virus modificado y se purifican las VLP del MRFV formadas a partir de la proteína de la cubierta. Finalmente, se entrecruzan las VLP y los péptidos utilizando amonio-PEG4-maleimida y se detectan mediante inmunotransferencia. Se obtienen resultados que identifican la producción de complejos péptido-VLP mediante análisis de inmunotransferencia. La técnica amplía la base de conocimientos sobre cómo modificar químicamente la superficie de virus y partículas similares a virus para producir nuevos materiales para la nanotecnología. Después de producir transcritos de ARN con caperuza T7 a partir de plásmidos vectoriales basados en el virus del eX de la papa que portan los genes de la proteína de la c

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Inmunología e Infección

Pruebas de interacción proteína-proteína es indispensable para la disección de la funcionalidad de las proteínas. Aquí, presentamos...

De proteínas de membrana de superposición de ensayo: Un protocolo de prueba de interacción entre las proteínas soluble e insoluble In vitro</em

Nivel de especies reactivas del oxígeno se eleva cuando las células encuentran condiciones de estrés. Aquí se muestra el ejemplo de la tinción Diaminobencidina 3'-3 ', así como el etiquetado cysTMT y espectrometría de masas para perfilar el proteoma redox...

Creación de perfiles proteoma redox tiol Uso del etiquetado de espectrometría de masas

Nanopartículas de plantas virales (VNPs) son prometedoras plataformas para aplicaciones en biomedicina. A continuación, se describen los procedimientos para la propagación de plantas VNP, purificación, caracterización y bioconjugación. Finalmente, mostramos la aplicación de VNPs para la recalada del tumor y la formación de imágenes mediante un modelo de xenotrasplante de ratón y de imágenes de fluorescencia.

Las nanopartículas virales para<em&gt; En vivo</em&gt; Imágenes de tumores

Fuente: Natilla, A., y Hammond, R. W. Análisis de la accesibilidad al solvente de residuos de cisteína en partículas similares a virus del virus del rayado fino del maíz producidas en plantas de Nicotiana benthamiana y reticulación de péptidos a partículas similares a virus. J. Vis. Exp. (2013)Este video demuestra la marcación fluorescente específica en un sitio de partículas tipo virus (VLPs) mutantes producidas en Nicotiana benthamiana utilizando un colorante reactivo con tiol, seguida de...

Marcado de residuos de cisteína accesibles en la superficie de partículas similares a virus diseñadas

Degradación de la proteína dirigida representa un mecanismo de regulación importante para la función celular. Se produce a través de una vía ubiquitina-proteasoma conservada, que se conecta polyubiquitin cadenas a la proteína diana que luego sirven "etiquetas" como moleculares para el proteasoma 26S. Aquí se describe un ensayo libre de células simple y confiable para la degradación proteasomal de proteínas.

Ensayo Proteasomal degradación en un sistema libre de células en las plantas

La determinación de la estructura de la solución de una proteína por un pequeño ángulo de dispersión de rayos X (SAXS) requiere muestras monodispersas. A continuación, se presentan dos posibilidades para asegurar un retraso mínimo entre la preparación de la muestra y de adquisición de datos: cromatografía de exclusión por tamaño en línea (SEC) y la cromatografía de intercambio iónico en línea (IEC).

Línea de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico en una SAXS Beamline

Análisis bioquímicos y estructurales de proteínas glicosiladas requieren cantidades relativamente grandes de muestras homogéneas. Aquí, presentamos un método químico eficiente para el glycosylation sitio-específico de proteínas recombinantes purificados de bacterias dirigiéndose a tioles reactivos de Cys.

Dirigida a tioles de la cisteína para in Vitro específica glicosilación de proteínas recombinantes

Aquí, presentamos un procedimiento para fluorescencia funcionalizar los disulfuros de Qβ VLP con dibromomaleimide. Describimos Qβ expresión y purificación, la síntesis de moléculas de dibromomaleimide funcionalizados y la reacción de Conjugación entre dibromomaleimide y Qβ. La partícula conjugada fluorescente amarillo resultante puede utilizarse como una sonda de fluorescencia dentro de las células.

Lo verbal-inducida fluorescentes pegilado Virus-como partículas por disulfuro de Dibromomaleimide química

Presentamos un protocolo general para identificar tramos cortos de secuencias de proteínas homolopégicos de patógenos de host (SSHHPS) incrustadas en la poliproteína viral. SSHHPS son reconocidos por proteasas virales y dirigen la destrucción dirigida de proteínas huésped específicas por varios virus del Grupo IV.

Análisis de SSHHPS Viral del Grupo IV utilizando métodos In Vitro y In Silico

Este protocolo describe la selección de marcadores plasmodesmales óptimos para análisis basados en microscopía confocal de proteínas dirigidas a plasmodesmos durante las interacciones virus-plasmodesmos o el transporte plasmodesmal.

Análisis microscópico confocal de la clasificación de proteínas a plasmodesmos en Nicotiana benthamiana

Aprende a analizar la accesibilidad al disolvente de residuos de cisteína en partículas similares al virus de Maize rayado fino producidas en Nicotiana benthamiana. Este método permite unir péptidos mediante reticulación química para aplicaciones en nanotecnología.

El análisis de la accesibilidad al disolvente de los residuos de cisteína en Maize rayado fino virus Partículas similares al virus producidas en Nicotiana benthamiana Plantas y reticulación de péptidos a VLPs (Video) | JoVE Journal

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