La detección de Modificadores melanoma utilizando un modelo de pez cebra Tumor autóctona

El objetivo general del siguiente experimento es detectar modificadores del melanoma mediante un modelo de tumor autógeno de pez cebra. Esto se consigue mediante la creación de animales transgénicos en los que los melanocitos expresan un gen de interés y los peces están predispuestos al melanoma. La siguiente aparición del melanoma se puntúa para evaluar si el gen de interés altera la iniciación del tumor.

A continuación, se realizan ensayos de invasión tumoral y específicos de células para determinar cualquier impacto adicional del gen de interés en los melanomas y los melanocitos premalignos. Por último, se trasplantan células de melanoma para medir cómo el gen de interés afecta la frecuencia de las células iniciadoras de melanoma en tumores establecidos. Los resultados muestran cómo un gen candidato afecta a varias propiedades de los melanocitos y los melanomas, incluida la invasión de inicio y la capacidad de trasplante.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la transgénesis de la línea germinal, para el estudio de los genes candidatos al cáncer es que se ahorra tiempo, esfuerzo y gastos, y el rendimiento aumenta mediante el ensayo. Varios aspectos de la tumorgénesis en animales transgénicos de campanilla La demostración de este procedimiento será Sherania agar, una estudiante graduada en mi laboratorio Para generar construcciones para inyectar. Comience por crear clones de entrada intermedia de puerta de entrada por PCR, amplificando el marco de lectura abierto de longitud completa de los genes de interés y recombinándolos en P don R 2 21.

A continuación, utilice la tecnología de puerta de enlace multisitio para recombinar el gen promotor de mifa específico de melanocitos de interés y la señal de poliadenilación en el vector mini Cooper para colocar los genes de interés bajo el control del promotor de mifa, inyecte 25 picogramos de cada clon, junto con 25 picogramos de TOL, dos transposiciones de ARNm en embriones de pez cebra transgénicos triples de una célula. Mifa BRAF FP 53. Los animales mutantes son deficientes en melanocitos y propensos a la transformación y formación de melanoma.

Junto con el gen de interés. El vector mini Cooper contiene un mini gen MVA salvador. Por lo tanto, los animales inyectados con éxito desarrollarán melanocitos rescatados, que expresan el gen de interés.

Incubar los embriones inyectados a 28,5 grados centígrados a las 24 horas después de la fecundación o HPF. Retire los embriones muertos a las 72 horas después de la fertilización utilizando un microscopio de disección bajo luz incidente sobre un fondo blanco. Seleccionar animales transgénicos con melanocitos rescatados.

Cuando los animales alcancen los cuatro días después de la fertilización, transfiéralos a tanques de tres litros en el vivero de la instalación de pez cebra. A los dos meses de edad, seleccione los animales con al menos un área de rescate de melanocitos mayor de cuatro milímetros cuadrados. Examinar semanalmente a los animales seleccionados para detectar la presencia de tumores.

Aislar animales portadores de tumores para su estudio. Dibuje las curvas de supervivencia libre de melanoma con la edad en semanas en el absa y el porcentaje de supervivencia libre de melanoma en la ordenada. Comparar animales con melanocitos que expresan un gen de interés para controlar animales que expresan EGFP y melanocitos.

Utilice una prueba de rango logarítmico para determinar si las dos curvas son estadísticamente diferentes. Para realizar un ensayo de invasión tumoral. Comience seleccionando peces cebra aislados que desarrollen tumores dorsalmente en una región entre el límite posterior del cerebro posterior y el borde anterior de la aleta dorsal.

Dos semanas después de la aparición del melanoma, use trica para sacrificar al pez después de fijarlo e incrustarlo en parafina. Realizar secciones transversales de cinco micrómetros a través de las lesiones. Uno. Cada 50 micrómetros atraviesan toda la lesión para poder identificar el punto de invasión más profundo.

Use hematina y eoína para teñir las secciones. Evaluar la invasión tumoral midiendo si las células tumorales permanecen fuera del estrato colágeno, si son compactas, invaden la musculatura dorsal o si invaden más profundamente la columna vertebral. Determine la diferencia estadística entre los dos conjuntos de muestras para realizar la tinción inmunológica.

Anestesiar al pez en 0,17 miligramos por mililitro de trica con luz incidente bajo un microscopio de disección. Use pinzas afiladas de punta fina para arrancar las escamas dorsales. Teniendo cuidado de no dañar el melanocito que contiene la mitad de la escamas.

Coloque las escamas directamente de las pinzas en un mililitro de fijador e incube a temperatura ambiente mientras gira durante más o menos de dos horas. Transfiera los peces al agua de los peces y monitoree a los peces para confirmar la recuperación exitosa para blanquear los melanocitos pigmentados. Primero lave las básculas fijas en PBST dos veces durante cinco minutos a temperatura ambiente.

A continuación, agregue un mililitro de solución de lejía recién hecha y cúbrala con parfum o cerraduras de tapa para evitar que el gas reviente los tubos. Continúa decolorando hasta que el pigmento desaparezca. A continuación, lávese en PBST cuatro veces cada cinco minutos a temperatura ambiente.

Incubar durante al menos 30 minutos en solución de bloque, luego incubar con aproximadamente 400 microlitros de anticuerpo primario y solución de bloque durante la noche a temperatura ambiente al día siguiente, lavar las escamas tres veces durante 30 minutos en PBS a temperatura ambiente, incubar con anticuerpo secundario durante dos horas a toda la noche a temperatura ambiente. Después de pararse con dpi, aplique una gota de escudo vectorial a una diapositiva de vidrio y monte las escalas de modo que el lado cóncavo de las escamas quede hacia abajo contra la diapositiva. Coloque una cubierta de vidrio sobre las muestras.

Use esmalte de uñas transparente para sellar los bordes y observe los portaobjetos bajo un microscopio fluorescente. Después de un receptor radiante, el pez Casper de dos a tres meses de edad con 25 grays de irradiación gamma un día antes del trasplante. Permita que los peces se recuperen en el agua de los peces.

Use trica para eutanasiar un pez portador de tumores, corte el tumor y colóquelo en una placa de Petri con aproximadamente cinco mililitros de filtro esterilizado 0.9 XPBS con 5% de FBS, con una navaja, corte el tumor mientras está en solución trabajando a temperatura ambiente y con una pipeta P 1000 itere para producir células individuales. Sube el volumen a 25 mililitros. Filtre la solución a través de un filtro de malla de 40 micrómetros y centrifuga en una centrífuga de mesa a 453 RCF durante 10 minutos.

Vuelva a suspender el pellet en 0.9%PBS 5%FBS a la concentración deseada. Con un hemocitómetro, calcule el número exacto de células y diluya la suspensión celular para que el volumen final de inyección sea de aproximadamente cinco microlitros. Por ejemplo, si se van a inyectar 50.000 células, la suspensión celular debe diluirse hasta una concentración final de 10.000 células por microlitro.

Agite el tubo que contiene la suspensión celular cada pocos minutos para evitar la aglomeración de las celdas con etanol al 100% y XPBS 0.9. Lave una jeringa Hamilton de 7, 0, 1 y 10 microlitros con punta biselada de calibre 26 s dos o tres veces antes de cargar la jeringa con cinco microlitros de la suspensión de celdas. Después de anestesiar el pez receptor irradiado en trica, colóquelo de lado sobre una toallita húmeda Kim.

Estabilice el pez con una mano e inserte la aguja con el bisel hacia arriba en un ángulo de 45 grados en el flanco del pez por encima de la cavidad peritoneal. Aproximadamente a mitad de camino entre el límite posterior del cerebro posterior y el borde anterior de la aleta dorsal. Presione suavemente el émbolo.

Permita que los peces se recuperen en agua dulce y observe a los peces diariamente para detectar el injerto tumoral. Si se ha producido un injerto, también se puede observar un crecimiento continuo y el desarrollo de la enfermedad. Se inyectaron embriones de pez cebra BRAF FP 53 MIFA con el mini vector Cooper que contenía el conjunto de oncogenes de melanoma DB uno o EGFP, cada uno bajo el control del promotor de MFA, como se muestra aquí.

Las curvas de incidencia tumoral de los adultos revelaron que el SET DB uno aceleró significativamente la aparición del melanoma en comparación con el control EGFP como se observa aquí, la tinción de hematina y EOSINA muestra que los melanomas que expresan SET DB uno fueron más invasivos localmente que los melanomas de control EGFP. Esta figura muestra escamas dorsales de pez cebra blanqueadas o sin blanquear que se tiñeron con un anticuerpo que reconoce el factor de transcripción mifa localizado en el núcleo para evaluar la capacidad de trasplante del tumor. Se aislaron células de melanoma de un pez BRAF FP 53 mifa inyectado con mini taza R-E-G-F-P 50.000 células se inyectaron subcutáneamente en un receptor de Casper mutante que había sido irradiado el día anterior con 25 grises, como se puede ver aquí a las dos semanas de edad.

Las células pigmentadas derivadas de donantes se reconocieron fácilmente. Así, tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del cáncer estudiaran las consecuencias funcionales de los cambios genéticos asociados al melanoma mediante el uso del pez cebra. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo detectar los modificadores del melanoma mediante ensayos, las diferencias en la invasión de inicio del tumor, la expresión génica y la capacidad de trasplante utilizando un modelo de tumor automático de pez cebra.