Name: La detección de Modificadores melanoma utilizando un modelo de pez cebra Tumor autóctona (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Aprenda a detectar modificadores de melanoma en oncología usando un modelo autóctono de tumor en pez cebra Danio rerio. Este método permite evaluar la iniciación y progresión tumoral de forma eficiente.

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Agradecemos al Dr. Leonard I. Zon en cuyo laboratorio estas técnicas fueron desarrolladas inicialmente; Kwan Kristen y el difunto Chi-Bin Chien para los regalos de los plásmidos utilizados en este trabajo, James Lister y Raible David para obtener ayuda con la tinción de anticuerpos, y por James Neiswender el vídeo de microinyección. Este trabajo fue financiado por el NIH subvención R00AR056899-03 a CJC

1. La detección de Onset Modificadores Melanoma <ol><li> Cree clones de entrada de puerta de enlace media por PCR amplificando el marco de cuerpo entero de lectura abierta de los genes de interés (GOI) y recombinación en pDONR 221 con BP Clonase II (Invitrogen). Use Multisite tecnología de Gateway (Invitrogen) para recombinarse p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit # 302 p3E_SV40polyA 6 y miniCoopR 5 para colocar los genes de interés bajo el promotor en el vector mitfa miniCoopR (Figura 1A). </li><li> Inyectar 25 picogramos de cada clon junto con 25 picogramos Tol2 transposasa mRNA en una célula Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); mitfa (lf) embriones de pez cebra triplemente homocigotos como se ha descrito previamente 7. Se incuban los embriones inyectados a 28,5 ° C. Retire los embriones muertos a las 24 HPF. </li><li> Seleccione los animales transgénicos con melanocitos rescatados a 72 HPF, colocando la placa de Petri que contiene los embriones inyectados en una disección microscópicase con luz incidente sobre un fondo blanco (fig. 1A). </li><li> Transfiera los animales a 3 tanques de L en el vivero de la instalación de pez cebra a 4 dpf a lo descrito previamente 8. </li><li> A los 2 meses, seleccionar los animales con al menos un área de rescate melanocitos mayor que 4 mm 2 (Figura 1A). Hay una fuerte correlación entre el grado de rescate de melanocitos en 72 HPF y el grado de rescate de melanocitos a los 2 meses. Cuando los embriones con rescate de los melanocitos se recogió en 72 hpf, la mayoría de ellos (~ 80%) tendrá al menos un área de rescate melanocitos mayor que 4 mm 2 a los 2 meses. </li><li> Pantalla de los animales seleccionados semanales para detectar la presencia de tumores (Figura 1B). Hay una fuerte correlación entre los cambios histopatológicos y morfológicas. Transición de benigno a maligno se reconoce como un cambio morfológico cuando las lesiones se elevó fuera de la superficie del animal. Aislar anima con el tumorls de estudio. </li><li> Dibujar libres melanoma curvas de supervivencia con la edad en semanas en las abscisas y el porcentaje de supervivencia libre de melanoma en la ordenada. Los animales con los melanocitos que expresan un gen de interés se comparan con los animales control que expresa EGFP (proteína verde fluorescente) en los melanocitos (Figura 1C). La aparición de tumores mediana para los animales inyectados con miniCoopR-EGFP es de aproximadamente 18 semanas. Determinar si las dos curvas son diferentes estadísticamente mediante la prueba de log-rank. </li></ol> 2. Ensayo de invasión tumoral <ol><li> Seleccione pez cebra aislado que desarrollan tumores dorsalmente, en una región entre el límite posterior del cerebro posterior y el borde anterior de la aleta dorsal (Figura 2A). </li><li> Dos semanas después de la aparición del melanoma eutanasia a los peces según las directrices especificadas por la American Veterinary Medical Association Panel sobre la eutanasia y aprobado por la Universidad de Massachusetts Medical School InsCuidado de Animales y el empleo Comisión titucional (IACUC). Específicamente, un pez se coloca en un plato con 0,6 mg / ml hasta tricaína movimiento branquial se detiene. </li><li> Hacer una incisión en la cavidad peritoneal de los peces con un escalpelo y luego coloque el pescado en 4% de paraformaldehído (PFA) durante la noche a 4 ° C para su fijación. </li><li> Tratar con 0,5 M EDTA durante la noche a 4 ° C para descalcificar. </li><li> Fijar con formalina en casete durante la noche, se deshidratan durante 1 hora, claro con xileno 3 veces durante 1 hora y luego se trata con parafina 2 veces durante 2 horas cada una a 60 ° C. </li><li> Insertar el tejido en parafina en un molde y dejar que se solidifique durante 30 min a 1 hr. </li><li> Hacer 5 micras secciones, una cada 50 micras. Las secciones deben ser transversal y a través de toda la lesión para que el punto más profundo de invasión puede ser identificado. Siga con hematoxilina y eosina. </li><li> Evaluar la invasión tumoral midiendo si las células tumorales permanecen fuera de la colágena compactum estrato, invadir la dorsalmusculatura o invadir adicional en la columna vertebral (Figura 2B, C). Determinar la diferencia estadística entre los dos grupos de muestras. </li></ol> 3. Antibody tinción de melanocitos Escala <ol><li> Maquillaje PO4 tampón con 80 ml ​​de 0,1 M Na 2 HPO 4 y 20 ml de 0,1 M NaH 2 PO 4. Asegúrese de que el pH es de 7,3. Maquillaje solución tampón 2x que contiene 8,0 g de sacarosa, 0,15 ml 0,2 M CaCl 2 y 90 ml de 0,2 M tampón de PO 4, pH 7,3. Si es necesario ajustar el pH a 7,3 con NaOH o HCl completar hasta 100 ml con tampón de PO 4. </li><li> A pesar hasta 300 mg PFA sólido y añade a un tubo de microcentrífuga. Añadir 5 mM NaOH a un volumen igual a la masa x 4,5, en mg, de PFA (por ejemplo, 450 ul 5 mM NaOH a 100 mg PFA). Se calienta a 60-70 ° C con agitación ocasional hasta que el PFA se disuelve. Decantar las partículas restantes y recuperar el 20% PFA sobrenadante. Haga fresca cada vez. </li><li> Preparar la solución de fijación que contiene 1x fix tampón y 4% PFA. </li><li> Se anestesia el pescado en 0,17 mg / ml tricaína. </li><li> Usando la luz incidente bajo un microscopio de disección arrancar escamas dorsales agudas utilizando pinzas de punta fina, teniendo cuidado de no dañar el medio que contiene los melanocitos de la escala (Figura 3A). Escalas lugar directamente desde las pinzas en 1 ml de solución de fijación y se incuba a temperatura ambiente, mientras se gira, por ≥ 2 hr. Transferir el pez en el agua los peces y controlar a los peces a confirmar una recuperación exitosa. </li><li> Para blanquear melanocitos pigmentados lavar escalas fijas en PBST (1x PBS pH 7,4, 0,1% Triton X-100) 2 veces durante 5 min a temperatura ambiente. Añadir 1 ml de lejía recién preparada que contiene 0,4 ml de solución de KOH al 10% y 0,15 ml de 30% de H 2 O 2 en 5 ml de dH 2 O. Ponga cerraduras Parafilm o gorra para evitar que el gas se rompa los tubos abiertos. Continuar hasta decoloración de pigmento se ha ido (10 min es típico) (Figura 3B, C). Lavar cuatro veces en PBST durante 5 min a temperatura ambientetura. </li><li> Bloquear por lo menos durante 30 minutos en solución de bloqueo compuesta por 1x PBS pH 7,4, 0,2% Triton X-100, 2 mg / ml de BSA, 1% de DMSO, 0,02% NaN 3 y 2% suero de cordero. Dejar de lado NaN 3, si el desarrollo de la reacción con HRP. </li><li> Incubar con anticuerpo primario en solución de bloqueo durante la noche a temperatura ambiente. Debe tener al menos 400 l de solución sobre las muestras para mantenerlas sumergidas. </li><li> Lavar las escalas 3 veces durante 30 minutos en PBST a temperatura ambiente. </li><li> Incubar con anticuerpo secundario de 2 horas a toda la noche en solución de bloqueo a temperatura ambiente. </li><li> Teñir durante 10 min con PBST DAPI mu M + 0,1. </li><li> Lavar 3 veces durante 5 min con PBST. </li><li> Montar la balanza sobre un portaobjetos de vidrio en una gota de Vectashield de modo que el lado cóncavo de la balanza está orientado hacia abajo hacia el portaobjetos y colocar un cubreobjetos de cristal sobre ellos. Selle los bordes de la diapositiva con esmalte de uñas transparente y observar las diapositivas con un microscopio de fluorescencia (Figura 3 D, E, F, G </strong&gt;). </li></ol> 4. Trasplante de Ensayo <ol><li> Preparar destinatario 2-3 meses de edad casper 9 peces por irradiación con 25 Gy de irradiación gamma, un día antes del trasplante 10. Permitir a los peces a recuperarse en el agua los peces. </li><li> Eutanasia a un pez portador del tumor como se ha descrito anteriormente (Sección 2,2). </li><li> Corte el tumor y lo puso en una caja de Petri con filtro de aproximadamente 5 ml de PBS esterilizado 0.9x con FBS al 5%. Cortar el tumor con una maquinilla de afeitar mientras está en solución. </li><li> Trabajando a temperatura ambiente, se tritura con una pipeta P1000 para obtener células individuales. Completar el volumen a 25 ml con PBS esterilizado por filtración 0.9x con FBS al 5%. </li><li> Filtrar a través de filtro de 40 de malla. </li><li> Haga girar en una centrífuga de mesa Eppendorf 5810R a 1.500 rpm (453 fcr) durante 10 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante y crea suspensión de células a la concentración de aproximadamente deseado (suponga 10 7 células para un 100 mm 3 tumor). </li><li> Calcular tque el número de células exacta usando un hemocitómetro y se diluye la suspensión de células de modo que el volumen de inyección final es de aproximadamente 5 l. Por ejemplo, si las células son 50.000 a inyectar, la suspensión celular se diluyó a una concentración final de 10.000 células / mL. Flick el tubo que contiene la suspensión de células cada pocos minutos para evitar la aglutinación de las células. </li><li> Lave un calibre 26s (punta biselada) jeringa l 701 N 10 Hamilton 2-3 veces con etanol al 100% y PBS 0.9x. Cargar la jeringa con 5 l de la suspensión celular. </li><li> Se anestesia el pez receptor irradiado en 0,17 mg / ml tricaína. Coloque el pescado en su lado en una Kimwipe húmedo (Figura 4A). </li><li> Estabilizar el pescado con una mano e inserte la aguja con el bisel hacia arriba en un ángulo de 45 ° en el flanco del pez encima de la cavidad peritoneal a medio camino entre el límite posterior del cerebro posterior y el borde anterior de la aleta dorsal. Suavemente el émbolo (Figura 4B). &lt;/ Li&gt; <li> Permiten a los peces recuperar en peces de agua dulce y observar los peces diaria para el injerto del tumor (Figura 4C). Si el injerto se ha producido, el continuo crecimiento y desarrollo de la enfermedad también puede ser observado. </li></ol>

<ol><li>Beroukhim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+somatic+copy-number+alteration+across+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers.</a> Nature. 463, 899-905 (2010).</li>
<li>Curtin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+sets+of+genetic+alterations+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Distinct sets of genetic alterations in melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).</li>
<li>Lin, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+genomic+diversity+and+tumor+dependency+in+malignant+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma.</a> Cancer Res. 68, 664-673 (2008).</li>
<li>Patton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+mutations+are+sufficient+to+promote+nevi+formation+and+cooperate+with+p53+in+the+genesis+of+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma.</a> Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).</li>
<li>Ceol, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+methyltransferase+SETDB1+is+recurrently+amplified+in+melanoma+and+accelerates+its+onset%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset.</a> Nature. 471, 513-517 (2011).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev. Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+of+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4, University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método miniCoopR permite la expresión de genes de interés en los melanocitos de pez cebra. Este enfoque tiene la ventaja del hecho de que el gen de pez cebra mitfa actúa células autónoma. Por esta razón, los melanocitos rescatadas por el vector miniCoopR son determinados para contener el minigen y cualquier gen de interés al que está acoplado físicamente. Melanocitos rescatados son claramente visibles y pueden ser obtenidos en los animales que fueron inyectados como una sola célula de los embriones. Un grado...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Reactivos de puerta de enlace de recombinación </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> miniCoopR </td><td></td><td></td><td> Referencia 5 </td></tr><tr><td> Mitfa anticuerpo </td><td></td><td></td><td> Referencia 5 </td></tr><tr><td> FITC cabra anti-conejo de anticuerpos IgG </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Labs </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> casper pez cebra </td><td></td><td></td><td> Referencia 9 </td></tr><tr><td> 701N 10 l Jeringa </td><td> Hamilton / Fisher </td><td> 14-824 </td><td> Ynbsp; </td></tr><tr><td> 40 mM de filtro </td><td> BD Falcon / Fisher </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140079 </td><td></td></tr></tbody></table>

la detección de modificadores melanoma utilizando un modelo de pez cebra tumor autóctona

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Los estudios genómicos de cáncer en humanos han arrojado una gran cantidad de información acerca de los genes que están alterados en los tumores 1,2,3. Un desafío que surge de estos estudios es que muchos genes están alterados, y puede ser difícil distinguir las alteraciones genéticas que impulsaron la tumorigénesis de aquellos que surgió incidentalmente durante la transformación. Para hacer esta distinción es beneficioso tener un ensayo que puede medir cuantitativamente el efecto de un gen alterado en la iniciación del tumor y otros procesos que permiten a los tumores a persistir y difundir. Aquí presentamos un medio rápido para detectar un gran número de candidatos modificadores de melanoma en el pez cebra utilizando un modelo de tumor 4 autóctona que abarca los pasos necesarios para la iniciación y el mantenimiento de melanoma. Un reactivo clave en este ensayo es el vector miniCoopR, que acopla una copia de tipo salvaje del factor de especificación mitfa melanocitos a un casete de recombinación Gateway en el que candidato melAnoma genes pueden ser recombinados 5. El vector miniCoopR tiene un minigen rescate mitfa que contiene el promotor, marco de lectura abierta y la región 3 &#39;no traducida del gen de tipo salvaje mitfa. Nos permite hacer construcciones con larga duración marcos de lectura abierta de modificadores de melanoma candidatos. Estos clones individuales pueden ser inyectados en célula única Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); mitfa (lf) embriones de pez cebra. El vector miniCoopR se integra por Tol2 transgénesis mediada 6 y rescata a los melanocitos. Debido a que están físicamente acoplado a la minigen mitfa rescate, genes candidatos se expresa en los melanocitos rescatadas, algunas de las cuales se transforman y se desarrollan en tumores. El efecto de un gen candidato en la iniciación melanoma y propiedades celulares de melanoma se puede medir usando libres melanoma curvas de supervivencia, los ensayos de invasión, tinción de anticuerpos y ensayos de trasplante.

Uno de células Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); mitfa (lf) embriones de pez cebra fueron inyectados con el vector que contiene el oncogén miniCoopR melanoma SETDB1 5 o EGFP, cada uno bajo el control del promotor mitfa. Los embriones con rescate de melanocitos se seleccionaron y se dejó madurar. A los 2 meses de edad de los animales con rescate de melanocitos mayor que 4 mm 2 fueron seleccionados. Los animales fueron examinados semanalmente para melanomas. Curvas...

Una forma rápida de pantalla para los modificadores de melanoma utilizando un modelo de pez cebra tumor autóctona se presenta. Se aprovecha de la miniCoopR vector que permite la expresión de los genes candidatos de melanoma en los melanocitos. Un método para obtener gratis melanoma curvas de supervivencia, un ensayo de invasión, un protocolo para la tinción de anticuerpos de los melanocitos de escala y un ensayo de trasplante de melanoma se describen.

La detección de Modificadores melanoma utilizando un modelo de pez cebra Tumor autóctona

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

El objetivo general del siguiente experimento es detectar modificadores del melanoma mediante un modelo de tumor autógeno de pez cebra. Esto se consigue mediante la creación de animales transgénicos en los que los melanocitos expresan un gen de interés y los peces están predispuestos al melanoma. La siguiente aparición del melanoma se puntúa para evaluar si el gen de interés altera la iniciación del tumor.A continuación, se realizan ensayos de invasión tumoral y específicos de células para determinar cualquier impacto adicional del gen de interés en los melanomas y los melanocitos premalignos. Por último, se trasplantan células de melanoma para medir cómo el gen de interés afecta la frecuencia de las células iniciadoras de melanoma en tumores establecidos. Los resultados muestran cómo un gen candidato afecta a varias propiedades de los melanocitos y los melanomas, incluida la invasión de inicio y la capacidad de trasplante.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la transgénesis de la línea germinal, para el estudio de los genes candidatos al cáncer es que se ahorra tiempo, esfuerzo y gastos, y el rendimiento aumenta mediante el ensayo. Varios aspectos de la tumorgénesis en animales transgénicos de campanilla La demostración de este procedimiento será Sherania agar, una estudiante graduada en mi laboratorio Para generar construcciones para inyectar. Comience por crear clones de entrada intermedia de puerta de entrada por PCR, amplificando el marco de lectura abierto de longitud completa de los genes de interés y recombinándolos en P don R 2 21.A continuación, utilice la tecnología de puerta de enlace multisitio para recombinar el gen promotor de mifa específico de melanocitos de interés y la señal de poliadenilación en el vector mini Cooper para colocar los genes de interés bajo el control del promotor de mifa, inyecte 25 picogramos de cada clon, junto con 25 picogramos de TOL, dos transposiciones de ARNm en embriones de pez cebra transgénicos triples de una célula. Mifa BRAF FP 53. Los animales mutantes son deficientes en melanocitos y propensos a la transformación y formación de melanoma.Junto con el gen de interés. El vector mini Cooper contiene un mini gen MVA salvador. Por lo tanto, los animales inyectados con éxito desarrollarán melanocitos rescatados, que expresan el gen de interés.Incubar los embriones inyectados a 28,5 grados centígrados a las 24 horas después de la fecundación o HPF. Retire los embriones muertos a las 72 horas después de la fertilización utilizando un microscopio de disección bajo luz incidente sobre un fondo blanco. Seleccionar animales transgénicos con melanocitos rescatados.Cuando los animales alcancen los cuatro días después de la fertilización, transfiéralos a tanques de tres litros en el vivero de la instalación de pez cebra. A los dos meses de edad, seleccione los animales con al menos un área de rescate de melanocitos mayor de cuatro milímetros cuadrados. Examinar semanalmente a los animales seleccionados para detectar la presencia de tumores.Aislar animales portadores de tumores para su estudio. Dibuje las curvas de supervivencia libre de melanoma con la edad en semanas en el absa y el porcentaje de supervivencia libre de melanoma en la ordenada. Comparar animales con melanocitos que expresan un gen de interés para controlar animales que expresan EGFP y melanocitos.Utilice una prueba de rango logarítmico para determinar si las dos curvas son estadísticamente diferentes. Para realizar un ensayo de invasión tumoral. Comience seleccionando peces cebra aislados que desarrollen tumores dorsalmente en una región entre el límite posterior del cerebro posterior y el borde anterior de la aleta dorsal.Dos semanas después de la aparición del melanoma, use trica para sacrificar al pez después de fijarlo e incrustarlo en parafina. Realizar secciones transversales de cinco micrómetros a través de las lesiones. Uno. Cada 50 micrómetros atraviesan toda la lesión para poder identificar el punto de invasión más profundo.Use hematina y eoína para teñir las secciones. Evaluar la invasión tumoral midiendo si las células tumorales permanecen fuera del estrato colágeno, si son compactas, invaden la musculatura dorsal o si invaden más profundamente la columna vertebral. Determine la diferencia estadística entre los dos conjuntos de muestras para realizar la tinción inmunológica.Anestesiar al pez en 0,17 miligramos por mililitro de trica con luz incidente bajo un microscopio de disección. Use pinzas afiladas de punta fina para arrancar las escamas dorsales. Teniendo cuidado de no dañar el melanocito que contiene la mitad de la escamas.Coloque las escamas directamente de las pinzas en un mililitro de fijador e incube a temperatura ambiente mientras gira durante más o menos de dos horas. Transfiera los peces al agua de los peces y monitoree a los peces para confirmar la recuperación exitosa para blanquear los melanocitos pigmentados. Primero lave las básculas fijas en PBST dos veces durante cinco minutos a temperatura ambiente.A continuación, agregue un mililitro de solución de lejía recién hecha y cúbrala con parfum o cerraduras de tapa para evitar que el gas reviente los tubos. Continúa decolorando hasta que el pigmento desaparezca. A continuación, lávese en PBST cuatro veces cada cinco minutos a temperatura ambiente.Incubar durante al menos 30 minutos en solución de bloque, luego incubar con aproximadamente 400 microlitros de anticuerpo primario y solución de bloque durante la noche a temperatura ambiente al día siguiente, lavar las escamas tres veces durante 30 minutos en PBS a temperatura ambiente, incubar con anticuerpo secundario durante dos horas a toda la noche a temperatura ambiente. Después de pararse con dpi, aplique una gota de escudo vectorial a una diapositiva de vidrio y monte las escalas de modo que el lado cóncavo de las escamas quede hacia abajo contra la diapositiva. Coloque una cubierta de vidrio sobre las muestras.Use esmalte de uñas transparente para sellar los bordes y observe los portaobjetos bajo un microscopio fluorescente. Después de un receptor radiante, el pez Casper de dos a tres meses de edad con 25 grays de irradiación gamma un día antes del trasplante. Permita que los peces se recuperen en el agua de los peces.Use trica para eutanasiar un pez portador de tumores, corte el tumor y colóquelo en una placa de Petri con aproximadamente cinco mililitros de filtro esterilizado 0.9 XPBS con 5% de FBS, con una navaja, corte el tumor mientras está en solución trabajando a temperatura ambiente y con una pipeta P 1000 itere para producir células individuales. Sube el volumen a 25 mililitros. Filtre la solución a través de un filtro de malla de 40 micrómetros y centrifuga en una centrífuga de mesa a 453 RCF durante 10 minutos.Vuelva a suspender el pellet en 0.9%PBS 5%FBS a la concentración deseada. Con un hemocitómetro, calcule el número exacto de células y diluya la suspensión celular para que el volumen final de inyección sea de aproximadamente cinco microlitros. Por ejemplo, si se van a inyectar 50.000 células, la suspensión celular debe diluirse hasta una concentración final de 10.000 células por microlitro.Agite el tubo que contiene la suspensión celular cada pocos minutos para evitar la aglomeración de las celdas con etanol al 100% y XPBS 0.9. Lave una jeringa Hamilton de 7, 0, 1 y 10 microlitros con punta biselada de calibre 26 s dos o tres veces antes de cargar la jeringa con cinco microlitros de la suspensión de celdas. Después de anestesiar el pez receptor irradiado en trica, colóquelo de lado sobre una toallita húmeda Kim.Estabilice el pez con una mano e inserte la aguja con el bisel hacia arriba en un ángulo de 45 grados en el flanco del pez por encima de la cavidad peritoneal. Aproximadamente a mitad de camino entre el límite posterior del cerebro posterior y el borde anterior de la aleta dorsal. Presione suavemente el émbolo.Permita que los peces se recuperen en agua dulce y observe a los peces diariamente para detectar el injerto tumoral. Si se ha producido un injerto, también se puede observar un crecimiento continuo y el desarrollo de la enfermedad. Se inyectaron embriones de pez cebra BRAF FP 53 MIFA con el mini vector Cooper que contenía el conjunto de oncogenes de melanoma DB uno o EGFP, cada uno bajo el control del promotor de MFA, como se muestra aquí.Las curvas de incidencia tumoral de los adultos revelaron que el SET DB uno aceleró significativamente la aparición del melanoma en comparación con el control EGFP como se observa aquí, la tinción de hematina y EOSINA muestra que los melanomas que expresan SET DB uno fueron más invasivos localmente que los melanomas de control EGFP. Esta figura muestra escamas dorsales de pez cebra blanqueadas o sin blanquear que se tiñeron con un anticuerpo que reconoce el factor de transcripción mifa localizado en el núcleo para evaluar la capacidad de trasplante del tumor. Se aislaron células de melanoma de un pez BRAF FP 53 mifa inyectado con mini taza R-E-G-F-P 50.000 células se inyectaron subcutáneamente en un receptor de Casper mutante que había sido irradiado el día anterior con 25 grises, como se puede ver aquí a las dos semanas de edad.Las células pigmentadas derivadas de donantes se reconocieron fácilmente. Así, tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del cáncer estudiaran las consecuencias funcionales de los cambios genéticos asociados al melanoma mediante el uso del pez cebra. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo detectar los modificadores del melanoma mediante ensayos, las diferencias en la invasión de inicio del tumor, la expresión génica y la capacidad de trasplante utilizando un modelo de tumor automático de pez cebra.

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Este video describe un método para detectar los genes modificadores del melanoma utilizando un modelo de tumor de pez cebra transgénico. Cuando se inyecta un vector miniCoopR inductor de melanoma, el pez cebra desarrolla melanomas y, por lo tanto, se puede utilizar para estudiar los factores genéticos que afectan el desarrollo de tumores en el pez cebra.

Transgénesis basada en vectores miniCoopR: una técnica para detectar genes inductores de melanoma en un modelo de tumor de pez cebra

Este video describe el método de tinción de anticuerpos para detectar la expresión de factores de transcripción en melanocitos asociados a la escama dorsal de modelos de pez cebra. Esta técnica de inmunotinción ayuda a identificar específicamente el factor de transfección A inductor de melanocitos en el pez cebra transgénico.

Tinción de anticuerpos de melanocitos de escamas: una técnica para detectar factores de transcripción expresados en melanocitos asociados a escamas dorsales de modelos de pez cebra

Este video describe el método para el trasplante de células tumorales del modelo de pez cebra donante portador de melanoma a un receptor inmunodeprimido, el pez cebra Casper. Ayuda a visualizar el injerto tumoral y la proliferación en el pez receptor.

Ensayo de trasplante subcutáneo: un método para trasplantar células de melanoma de un donante a un modelo de pez cebra receptor

El objetivo de este estudio es demostrar cómo se puede utilizar la estrategia de transgénesis en mosaico en pez cebra para evaluar rápida y eficientemente las contribuciones relativas de múltiples oncogenes en la iniciación y progresión tumoral in vivo.

Mosaico de pez cebra transgénesis de Análisis Genómica Funcional de candidatos genes cooperativos en la patogénesis del tumor

El trasplante de células cancerosas es una herramienta importante para la identificación de mecanismos de cáncer y respuestas terapéuticas. Las técnicas actuales dependen de animales inmuno-incompetentes. En este artículo, describimos un método para trasplantar células tumorales de pez cebra en embriones inmune-competentes para el análisis a largo plazo del comportamiento de las células tumorales y las respuestas in vivo a los fármacos.

Transplante de Tumores cerebrales pediátricos de Zebrafish en huéspedes inmune-competentes para el estudio a largo plazo del comportamiento de la célula de tumor y de la respuesta de la droga

Los modelos de xenoinjerto de pez cebra permiten la detección de fármacos de alto rendimiento y la toma de imágenes fluorescentes de células cancerosas humanas en un microambiente in vivo. Desarrollamos un flujo de trabajo para la detección automatizada de fármacos a gran escala en muestras de leucemia derivadas del paciente en peces cebra utilizando una unidad de imágenes automatizada equipada con microscopio de fluorescencia.

Examen de drogas de xenoinjertos de tumores derivados del paciente primario en peces cebra

Aquí, proporcionamos un protocolo paso a paso, con consejos para generar xenoinjertos y directrices para el análisis del comportamiento tumoral, la inmunofluorescencia de montaje completo y la cuantificación de imágenes confocales.

Generación de Xenoinjertos Larvales de Pez Cebra y Análisis de Comportamiento Tumoral

Este artículo presenta el método de desarrollo, caracterización y seguimiento en tiempo real de la metástasis tumoral en el modelo de pez cebra del neuroblastoma, específicamente en la línea de pez cebra transgénico con sobreexpresión de MYCN y LMO1, que desarrolla metástasis espontáneamente.

Modelo de pez cebra de metástasis de neuroblastoma

Describimos un protocolo para el xenotrasplante en la yema de embriones transparentes de pez cebra que se optimiza mediante un método de estadificación simple y rápido. Los análisis posteriores a la inyección incluyen la supervivencia y la evaluación de la carga de enfermedad de las células xenotrasplantadas mediante citometría de flujo.

Un método sencillo, rápido y eficaz para el análisis de xenotrasplantes tumorales en embriones transparentes de pez cebra

Una visión global de las técnicas involucradas en la generación de un modelo de ratón de cáncer oral y el control cuantitativo de la invasión del tumor dentro de la lengua a través de multi-fotón microscopio de las células marcadas se presenta. Este sistema puede servir como una plataforma útil para la evaluación molecular y la eficacia de los medicamentos de compuestos anti-invasiva.

Multi-fotón imágenes de invasión de células tumorales en un modelo de ratón ortotópico de carcinoma oral de células escamosas

Aprenda a detectar modificadores de melanoma en oncología usando un modelo autóctono de tumor en pez cebra Danio rerio. Este método permite evaluar la iniciación y progresión tumoral de forma eficiente.

La detección de Modificadores melanoma utilizando un modelo de pez cebra Tumor autóctona

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