Name: Inmunofluorescencia y FISH Combinado de ADN en 3D conservados núcleos en interfase para estudiar los cambios en la organización nuclear 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 55 s
Description: Aprende a combinar inmunofluorescencia y FISH de ADN para detectar modificaciones de histonas y secuencias genómicas simultáneamente en núcleos tridimensionales preservados. Este método permite visualizar la organización de la cromatina con microscopía confocal 3D.

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Nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio Skok, especialmente Susannah Hewitt, para los debates y comentarios. Este trabajo es apoyado por el Instituto Nacional de Salud subvenciones R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS es un erudito Leukemia &amp; Lymphoma Society. JC es un compañero Irvington Instituto de Investigación del Cáncer Institute. MM es apoyado por una Educación Nacional Science Foundation Graduate Beca Integral y Prácticas de Investigación (NSF IGERT 0.333.389).

1. Etiquetado de ADN Probe con fluoróforos: Nick Translation (~ 6 horas) <ol><li> Clean BAC ADN (preparado por maxi-prep) o plásmidos o productos de PCR, todos resuspendió en H 2 O, se puede utilizar para el etiquetado. Tenga en cuenta que para una señal de FISH robusto, sondas deberían abarcar al menos 10 kb. </li><li> Incubar ADN en RNasa A durante 30 min a 37 ° C (Todos los reactivos se enumeran en la Tabla 1). </li><li> Incubar la reacción de traducción nick durante 2 horas a 16 ° C (véanse los cuadros 2 y 3). Los métodos alternativos de etiquetado directo puede ser utilizado (Ejemplo: Etiqueta FISH, Invitrogen). </li><li> Inactivar la reacción durante una hora a -80 ° C o durante la noche a -20 ° C. </li><li> Determinar el tamaño de la sonda en un 2% de gel de agarosa. La prueba debe ser de entre 100 y 1.000 pares de bases, con la mayoría en aproximadamente 300-500 pb (Tenga en cuenta que la mancha de Cy5 sondas no es visible). Si el ADN no se digiere suficiente, más ADN Pol I yDNasa I se puede añadir a la reacción y se incubaron durante dos horas más a 16 ° C. </li><li> Purificar sondas en filtros 0,025 mm en dos vasos de precipitados litro llenos de H 2 0 durante dos horas en la oscuridad. </li><li> Añadir factores de bloqueo para las sondas de la siguiente manera: 10 g de ADN Cot-1, 10 g de ADN Hybloc y 100 g de esperma de salmón de 10 g de sondas de ADN. Sondas de ADN Tienda a -20 ° C. </li></ol> 2. Probe Precipitación / desnaturalización / hibridación Pre-(hr 3-4) <ol><li> Entre 0,3 mg y 1 g de sonda de ADN se utiliza por cubreobjetos. Las sondas se mezclan con 0,1 volumen de NaAc 3M (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol al 100%, incubar durante una hora a -80 ° C o durante la noche a -20 ° C y centrifugar a 13.000 rpm a 4 ° C durante 30 min. Tenga en cuenta que la cantidad de sonda de ADN puede ser ajustada dependiendo de la calidad del ADN y la región nuclear de la hibridación. Los métodos alternativos de etiquetado directo puede permitir el uso de cantidades reducidas desonda. Para la detección de múltiples señales de ADN de FISH en una diapositiva, las diferentes sondas pueden precipitarse juntos (excepto sondas que no deberían estar pre-recocido, como secuencias de repetición). Las sondas para varios experimentos realizados al mismo tiempo también se puede precipitar juntos. Pellets debe ser ligeramente coloreado de acuerdo con los fluoróforos utilizados (en caso de pequeñas cantidades de sondas se precipitan, el precipitado puede no ser visible). </li><li> Pellets secos y resuspender ellos en 15 l de tampón de hibridación (véase la Tabla 4) por cubreobjetos con agitación (usando un termomezclador Eppendorf) en la oscuridad a 37-45 ° C (aproximadamente 20 min). </li><li> Sondas desnaturalizan durante 5 minutos a 75-95 ° C. </li><li> Pre-recocido de sondas a 37 º C durante 30-60 min. Longitud de pre-recocido puede ser ajustada dependiendo de la complejidad y la calidad de las sondas. </li><li> Aplicar las sondas a los cubreobjetos para la hibridación durante la noche (véase la Sección 3). </li></ol> 3. 3Tridimensional del ADN FISH - Primer día (~ 3 h) <ol><li> Las células no adherentes se concentran en un pequeño volumen de PBS 1x (~ 2x10 5 células en 5-10 l de PBS 1x por cubreobjeto) y se dejó caer sobre el centro de un cubreobjetos recubierto con poli-L-lisina. Las células adherentes se cultivaron en cubreobjetos durante al menos 24 horas (confluencia ~ 70%) (cubreobjetos se pueden recubrir con gelatina 0,1%). Cuadrados 18x18 a 24-24 mm cubreobjetos se colocan en placas de 6 pocillos, y durante todo el protocolo, dos ml de cada solución se utiliza por pocillo (alternativamente redondas 1,5 mm cubreobjetos se pueden colocar en placas 12/24-well). </li><li> Fijar las células en 2% de paraformaldehído / PBS 1x, pH 7-7.4, durante 10 min a TA (4% PFA existencias puede alícuotas, se almacenó a -20 ° C). El paraformaldehído se pueden comprar en solución (16%), o 4% soluciones madre se puede preparar a partir de polvo / gránulos. Paraformaldehído en polvo se disuelve en 1x PBS a&gt; 60 ° C (pH puede aumentarse a 8.9 para facilitar la disolución), enfriado en hielo, ajustared a pH 7-7.4, se filtró, alícuotas de halcones y almacenados durante semanas a -20 ° C. </li><li> Después de tres enjuagues en PBS 1x, permeabilizar las células en hielo enfriado con 0,4% Triton-X-100/1 x PBS durante 5 min en hielo. Longitud de permeabilización puede ajustarse dependiendo de la célula de tipo NB:. Si FISH de ADN se combina con la inmunofluorescencia, la inmunotinción se debe realizar en esta etapa (véase la Sección 4). </li><li> Después de tres enjuagues en 1x PBS, las células se incuban con 0,1 g / l de RNasa A en 1x PBS durante una hora a 37 ° C. Los cubreobjetos se colocan células hacia abajo sobre una gota de 100 l de solución en parafilm o un portaobjetos en una cámara húmeda. Los cubreobjetos son entonces cuidadosamente con fórceps. Si alguno se encuentra resistencia, los cubreobjetos se inundó con 1x PBS con el fin de evitar daños en las células. </li><li> Después de tres enjuagues en PBS 1x, permeabilizar las células en hielo enfriado con 0,7% Triton-X-100 HCl / 0,1 M durante 10 min en hielo. </li><li> Después de tres lavados in 1x PBS, las células desnaturalizan en 1,9 M HCl durante 30 min a TA. Alternativamente, las células pueden ser desnaturalizados en formamida / SSC 2x 50% a 75-80 ° C durante al menos 30 min. Cuenta que la longitud de hibridación (y la temperatura) puede ser optimizada en función del tipo de célula. </li><li> Después de tres enjuagues en hielo frío 1x PBS, las células se hibridan con sondas durante la noche a 37 ° C en una cámara oscura y húmeda. Los cubreobjetos se colocan celda hacia abajo en una caída de 15 l de la sonda en un portaobjetos, y se sella con cemento de goma. </li></ol> 4. 3-dimensional Immuno-FISH - First Day (~ 6-7 h) <ol><li> Para combinar inmunofluorescencia / ADN FISH, inmuno-tinción debe realizarse después de la permeabilización en el 0,4% de Triton-X-100 (Paso 3,3). </li><li> Se incuban las células en solución de bloqueo durante 30 min a TA (2,5% albúmina de suero bovino (BSA), 10% de suero de cabra normal, 0,1% de Tween-20). La solución de bloqueo se filtra, se dividió en alícuotas en Eppendorfs 1,5 ml y se almacenó para meses a -20 ° C. </li><li> Se incuban las células con el anticuerpo primario contra la proteína o la modificación de las histonas de interés diluido en solución de bloqueo, durante una hora a temperatura ambiente en una cámara húmeda. Aquí se muestra el ejemplo de un anticuerpo contra fosforilados serina-139 de H2AX (γ-H2AX, Millipore, Ver Tabla 5 para más detalles). Los cubreobjetos se colocan células hacia abajo sobre una gota de 100 l de solución en parafilm o un portaobjetos en una cámara húmeda. Los cubreobjetos son entonces cuidadosamente con fórceps (inundado con 1x PBS si es necesario). Nota que la dilución y la duración de la incubación puede ser ajustado dependiendo de la calidad de los anticuerpos y de células tipos. </li><li> Lavar las células en 0,2% BSA / 0,1% Tween-20 / 1x PBS, tres veces 5 min a TA con agitación. </li><li> Se incuban las células con el apropiado fluoróforo conjugado con anticuerpo secundario diluido en solución de bloqueo durante una hora a RT en una cámara oscura y húmeda. Aquí se muestra un ejemplo de detección con unsecundario de cabra anti-ratón de anticuerpos (Alexa Fluor 488 o 555, Invitrogen; Ver Tabla 5 para más detalles). Hapteno conjugado con anticuerpos secundarios (biotina, digoxigenina, etc) también podría ser utilizado. En este caso, un paso adicional para la detección apropiado (estreptavidina, anti-dig, etc) se puede realizar ya sea antes o después de ADN-FISH hibridación durante la noche. </li><li> Enjuagar las células en 0,1% de Tween-20 / 1x PBS, tres veces 5 min a TA con agitación en la oscuridad. </li><li> Post-fix células en 2% de paraformaldehído / PBS 1x durante 10 min a TA en la oscuridad. </li><li> Continuar FISH ADN como anteriormente a partir de la incubación en RNasa A (Paso 3,4). </li></ol> 5. 3-dimensional de ADN FISH / Immuno-FISH - Segundo día (~ 2 h) <ol><li> Retire con cuidado el cemento de goma, cubreobjetos de inundación con 2x SSC, retire con cuidado con unas pinzas y colóquelos en los pocillos con solución de lavado. </li><li> Lavar las células en 2x SSC durante 30 minutos a 37 ° C en la oscuridad con agitación.</li><li> Lavar las células en 2x SSC durante 30 min a TA en la oscuridad con agitación. </li><li> Lavar las células en 1x SSC durante 30 min a TA en la oscuridad con agitación Tenga en cuenta que en caso de desnaturalización con formamida, lavados debe ser sustituido por el siguiente:. 3 lavados en lavados de 50% de formamida / SSC 2x y 3 en 2x SSC, 5 minutos cada uno, a 37 º C. </li><li> Montar las células en ProLong oro medio de montaje que contiene 1,5 mg / ml DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) para la contratinción de ADN total. Los cubreobjetos se colocan células hacia abajo sobre una gota de 10-15 l de medio de montaje en un portaobjetos y se sellaron con esmalte de uñas. Las diapositivas se mantuvo durante meses a -20 ° C. </li></ol> 6. Microscopia y Análisis de 3D <ol><li> Imágenes 3D pueden ser adquiridos con los sistemas de microscopios. En nuestros experimentos, las secciones ópticas separadas por 0,3 micras se recogen en un sistema Leica SP5 AOBS confocal (acústico-óptico divisor de haz). Tenga en cuenta que la separación entre Optical planos se pueden ajustar dependiendo del tipo de análisis. </li><li> Pilas de imágenes 3D se pueden analizar usando software diferente y herramientas. Usamos el software Image J para evaluar las mediciones de distancia entre loci de interés y analizar diferentes tipos de asociación de los lugares de interés con los sub-compartimientos nucleares o proteínas. </li><li> Todos los análisis estadísticos se realizaron para comparar dos (o más) diferentes condiciones biológicas con pairwise evaluación (s) de significación: Comparación entre diferentes tipos de células o fases, la comparación entre los diferentes loci de interés. En todas las pruebas estadísticas, los valores de p ≤ 5.00e-2 (a = 0,05) se considera que son significativos (1,00 E-2 ≤ P ≤ 5.00e-2 * significativo; 1,00 E-3 ≤ P ≤ 1,00 E-2 * * muy significativa, p &lt;1,00 E-3 *** altamente significativo). </li></ol> El análisis estadístico de las distribuciones de enteros de las distancias entre los dos alelos. Hemos primera construct acumulativos curvas de distribución de frecuencias en toda la gama de distancias medidas entre el alleles.To NAEP la significación de las diferencias en las distribuciones empíricas de inter-alélicas distancias que usamos la prueba no paramétrica de dos muestras de Kolmogorov-Smirnov (KS) prueba de 13,14. El análisis estadístico de una estrecha asociación (es decir, el emparejamiento) de dos alelos con una distancia óptima de corte. Identificar el rango de la mayoría de las diferencias robustas en las distancias entre dos alelos o loci, utilizamos una serie de 15 dos colas prueba exacta de Fisher s. Es decir, en cada distancia medida se prueba si una condición es significativamente más representadas en distancias más cortas entre las dos muestras. El mínimo en la distribución de los valores P indica la gama de distancias que deben ser considerados como un límite para cerrar asociación (es decir, emparejamiento) de los dos alelos. Posteriormente, la prueba de dos colas exacta de Fisher se utiliza to evaluar la importancia de emparejamiento de dos alelos en el identificada valor de corte 15. Correcciones de prueba múltiples se aplica a la cuenta para el número total de pruebas de Fisher realizó 16. El análisis estadístico de la asociación del locus de interés con sub-compartimentos nucleares o proteínas. La prueba de dos colas de Fisher-exacta se utiliza para analizar la significación de la asociación del locus de interés con diferentes compartimentos o proteínas 15.

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<li>Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+repositioning+of+genes+in+the+nucleus+of+lymphocytes+preparing+for+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division.</a> Molecular cell. 3, 207-217 (1999).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

Las técnicas detalladas anteriormente se han utilizado en nuestro laboratorio para analizar la regulación de V (D) J recombinación de la inmunoglobulina y loci TCRA / d en el desarrollo de los linfocitos 30,31. Estamos seguros de que esta técnica se puede adaptar para la detección de varias proteínas nucleares, compartimentos nucleares y los loci, en diferentes tipos de células. Las modificaciones del protocolo puede ser necesaria, y en este caso los pasos principales de enfocar son los sigu...

Epigenética establecimiento de mecanismos de disparo y la herencia de desarrollo y el tipo de células perfiles de transcripción específicos. Por un lado se trata de la modulación de la cromatina embalaje que define regiones genómicas activas o en silencio. En una escala mayor, la organización global de 3D del genoma nuclear y de la arquitectura también desempeñar un papel en el control de los patrones transcripcionales. Por lo tanto, la disección de estas características epigenomic es esencial para una comprensión completa de cómo se regulan los genes 6-11. FISH Combinado de ADN de inmunofluorescencia y 3D ofrecen una oportunidad única para complementar los análisis moleculares y bioquímicos mediante la evaluación de las interacciones específicas / asociaciones de secuencias de ADN y / o proteínas en el núcleo. Por otra parte, mientras que en todo el genoma técnicas de alto rendimiento, tales como cromatina immunoprecipitation (CHIP-seq) o conformación cromosoma captura junto con la secuenciación profunda (4C-seq, 5C, Hi-C) ofrecen dat mundialuna en 12 poblaciones celulares, inmunofluorescencia / ADN técnicas de FISH permitir el análisis a nivel de células individuales. Aquí se describe un protocolo para la detección simultánea de modificaciones de las histonas por secuencias de ADN de inmunofluorescencia y por FISH ADN seguido por microscopía y análisis 3D (3D inmuno-FISH). La ventaja de este protocolo es la visualización combinada de ADN y la preservación de las estructuras proteicas. Nuestra experiencia en este campo nos ha permitido mejorar y simplificar los protocolos existentes. Aunque hemos utilizado este protocolo para detectar ADN de doble cadena se rompe en los linfocitos sometidos a recombinación, este método se puede aplicar a otras proteínas y otros tipos de células.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> Pescador </td><td> # BP2470 </td><td></td></tr><tr><td> RNasa A </td><td> Sigma </td><td> # R4642 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td> Sigma </td><td> # DNTP100 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa dUTP </td><td> Invitrogen </td><td> # C11397 a C-11401 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3 o Cy5 dUTP </td><td> Pescador </td><td> º 45-001-xxx </td><td></td></tr><tr><td> DNasa I </td><td> Roche </td><td> # 04536282001 </td><td></td></tr><tr><td> ADN Pol I </td><td> Biolabs </td><td> # M0209 </td><td></td></tr><tr><td> 0,025 micras filtros </td><td> Millipore </td><td> # VSWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> Cot-1 DNA 1 mg / ml </td><td> Invitrogen </td><td> # 18440 </td><td></td></tr><tr><td> Hybloc ADN 1 mg / ml </td><td> Genética Aplicada </td><td> # MHB </td><td></td></tr><tr><td> De esperma de salmón </td><td> Sigma </td><td> # D1626 </td><td> polvo que se volvieron a suspender a 10 mg / ml en H 2 O </td></tr><tr><td> NaAc (acetato de sodio, pH 5,2, solución tampón) </td><td> Sigma </td><td> # S7899 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 400 (Mol Biol. grado) </td><td> Pescador </td><td> # 525 </td><td></td></tr><tr><td> Polivinilpirrolidona (Mol Biol. grado) </td><td> Pescador </td><td> # BP431 </td><td></td></tr><tr><td> Polvo de sulfato de dextrano </td><td> Sigma </td><td> # D8906 </td><td></td></tr><tr><td> SSPE (solución salina fosfato de sodio-EDTA) 20x solución </td&gt; <td> Pescador </td><td> # BP1328 </td><td></td></tr><tr><td> Formamida </td><td> Pescador </td><td> # BP227 </td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos </td><td> Pescador </td><td> # 12-548-B </td><td></td></tr><tr><td> Diapositivas </td><td> Pescador </td><td> # 12-550 </td><td></td></tr><tr><td> 6-y las placas </td><td> Pescador </td><td> # 0720080 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, 10x </td><td> Pescador </td><td> # MT-46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-lisina </td><td> Sigma </td><td> # P8920 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehído, gránulos, 95% </td><td> Sigma </td><td> # 441244 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X-100, Mol Biol. grado </td><td> Sigma </td><td> # T8787 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (albúmina de suero bovino) fracción V </td><td> Pescador </td><td> # BP 1600 </td><td></td></tr><tr><td> Suero normal de cabra </td><td> Vector Labs </td><td> # S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20, Mol Biol. grado </td><td> Sigma </td><td> # P9416 </td><td></td></tr><tr><td> SSC (citrato sódico salino) 20x solución </td><td> Pescador </td><td> # BP1325 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongar reactivo Antifade Oro </td><td> Invitrogen </td><td> # P36930 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol) </td><td> Sigma </td><td> # D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Mejor prueba de una capa de cemento de goma </td><td> Arte o tiendas de suministros de oficina </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla 1. Reactivos específicos y pequeños equipos. </td></tr></tbody></table>

inmunofluorescencia y fish combinado de adn en 3d conservados núcleos en interfase para estudiar los cambios en la organización nuclear 3d

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

La hibridación fluorescente in situ con sondas de ADN sobre el 3-dimensional núcleos conservan seguido por microscopía confocal 3D (3D FISH AND) representa la forma más directa para visualizar la localización de loci de genes, cromosomas sub-regiones o territorios enteros en celdas individuales. Este tipo de análisis permite conocer la arquitectura global del núcleo, así como el comportamiento de los loci genómicos y regiones específicas dentro del espacio nuclear. Inmunofluorescencia, por otro lado, permite la detección de proteínas nucleares (histonas modificadas, variantes de histonas y modificadores, maquinaria de transcripción y factores nucleares, sub-compartimientos, etc.) El principal reto en la combinación de ADN FISH inmunofluorescencia y 3D es, por un lado, para preservar el epítopo detectados por el anticuerpo, así como la arquitectura 3D del núcleo, y por otra parte, para permitir la penetración de la sonda de ADN para detectar loci de genes o cromosomas territorios 1-5. A continuación presentamos un protocolo que combina la visualización de las modificaciones de la cromatina con loci genómicos en los núcleos 3D conserva.

ADN y la inmuno-FISH se utilizan en el laboratorio Skok para estudiar los cambios en la organización nuclear asociados con el proceso de V (D) J recombinación de loci receptores de antígenos durante el desarrollo de linfocitos B y T. Las técnicas detalladas anteriormente nos permiten i) medir distancias entre los dos extremos de un locus (contracción) ii) medir distancias entre los alelos o loci (emparejamiento), iii) analizar el daño del ADN que ocurre dentro de loci, iv) evaluar la ubicación de los alelos y en relació...

Aquí se describe un protocolo para la detección simultánea de las modificaciones de histonas por secuencias de ADN de inmunofluorescencia y por FISH de ADN seguido por microscopía 3D y análisis (3D inmuno-ADN FISH).

Inmunofluorescencia y FISH Combinado de ADN en 3D conservados núcleos en interfase para estudiar los cambios en la organización nuclear 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

El objetivo general de este procedimiento es detectar las modificaciones de la cromatina y las secuencias de ADN simultáneamente mediante microscopía confocal 3D, primero se generan sondas de ADN específicas. Mientras tanto, las células experimentales están permanentes fijas e inmunoteñidas. Para los marcadores de histonas de interés.A continuación, las células se desnaturalizan y se produce una fluorescencia nocturna en su interior. La hibridación de peces se realiza utilizando una o más sondas de ADN. Finalmente, las células se lavan y se montan para fluorescencia 3D.El análisis microscópico de las imágenes resultantes revela la localización nuclear de los loci de interés y la asociación con modificaciones específicas de los cálculos. La principal ventaja de esta técnica es que combina la visualización de proteínas nucleares, incluidos los cálculos, con loci genómicos en núcleos preservados en 3D, y puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la organización nuclear epigenética de la cromatina o la regulación génica. Para este procedimiento, se pueden utilizar plásmidos de respaldo o productos de PCR para el etiquetado.Estos deben prepararse como se describe en el texto adjunto. Tenga en cuenta que para una señal de pez robusta, las sondas deben gastar al menos 10 pares de kilobases. Comience este procedimiento combinando un microgramo de ADN y 0,17 microgramos de ARN A en un tubo de microcentrífuga.Incubar durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, inactive brevemente los ARN A en hielo y agregue la cantidad adecuada de traducción de Nick. Mezclar la incubación durante dos horas a 16 grados centígrados en un baño de agua refrigerada o en un bloque frío para inactivar la reacción.Coloque los tubos a menos 80 grados centígrados durante una hora o a menos 20 grados centígrados durante la noche. A continuación, determine el tamaño de la sonda en un gel 2%agros. El frotis debe estar entre 101.000 pares de bases y la mayoría aproximadamente entre 300 y 500 pares de bases.Tenga en cuenta que la mancha de las sondas de ciencia ficción no es visible. Una vez determinado el tamaño, purificar las sondas por diálisis a 0,02. Filtros de cinco milímetros en vasos de precipitados de dos litros llenos de agua.Pipetee suavemente 200 microgramos de sonda en el centro de cada filtro flotante, luego incube durante dos horas en la oscuridad. Después de la incubación, use una pipeta para transferir suavemente la sonda de los filtros a un tubo de microcentrífuga nuevo. A continuación, agregue factores de bloqueo a las sondas de la siguiente manera.Un microgramo de CO 1D NA. Un microgramo de ADN de alto bloque y 10 microgramos de esperma de salmón para un microgramo de sonda de ADN y mezcla almacena las sondas de ADN a 20 grados centígrados negativos. El día del procedimiento con peces, las sondas se precipitan y se preparan para su uso. Tenga en cuenta que los pasos descritos en esta sección del vídeo deben realizarse en paralelo con los pasos de la siguiente sección.Para precipitar las sondas, sígalas y combínelas con 0,1 volúmenes de acetato de sodio molar a pH 5,2 y 2,5 volúmenes de etanol al 100% incubar durante una hora a 80 grados centígrados negativos. Después de la incubación, gire las sondas a 16.000 veces G a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Después del centrifugado, deseche el sobrenadante y seque al aire los gránulos en la oscuridad.Dependiendo de la cantidad y el color de las sondas, el pellet puede o no ser visible. Resus suspende el pellet en 15 microlitros de tampón de hibridación por condición de prueba y agita con un termomezclador einor en la oscuridad a 37 a 45 grados centígrados durante aproximadamente 20 minutos. A continuación, para desnaturalizar, las sondas las incuban durante cinco minutos a 75 a 95 grados centígrados.Luego, a las presondas, incubarlas a 37 grados centígrados durante 30 a 60 minutos en el termomezclador. Inmediatamente después de la incubación, las sondas se aplicarán a las células en cubreobjetos como se describe en la siguiente sección del video. Tenga en cuenta que para los siguientes pasos, los tiempos de incubación deben modificarse según sea necesario para los anticuerpos y las células utilizados.Los pasos descritos en esta sección del vídeo deben realizarse en paralelo con los pasos de la sección anterior, tal como se describe en el texto adjunto. Coloque las células no adherentes en la parte superior de los cubreobjetos recubiertos de polilisina en pocillos de placas de seis pocillos y déjelos adherir durante cinco minutos. A continuación, añada suavemente dos mililitros de aldehído paraforme al 2% en la incubación PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente después de la incubación.Enjuague cada pocillo con PB S3 veces, luego para permear las células, agregue dos mililitros de hielo frío, 0.4%Triton X 100 en PBS e incube durante cinco minutos en hielo. Después de aspirar la solución permeable, si el ADN de los peces se combinará con la inmunofluorescencia, proceda de la siguiente manera. Primero pipetear 100 microlitros de solución de bloqueo en el param en una cámara humidificada.Coloque la tapa con el lado de la celda deslizante hacia abajo sobre la solución de bloqueo e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, transfiera. La cobertura se desliza a 100 microlitros de gotas del anticuerpo primario diluido en una solución bloqueante.En este caso, el anticuerpo utilizado reconoce el sirio fosforilado 1 39 de H dos A x o gamma H dos A x. Incubar los portaobjetos en una cámara humidificada durante una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, use fórceps para quitar con cuidado los cubreobjetos.Si es difícil recoger los comprobantes, inuncújelos con PBS y vuelva a intentarlo. Transfiera cada portaobjetos a un pozo de seis. La placa de pocillos contiene dos mililitros de 0,2%BSA 0,1%tween 20 en PBS, lave los cubreobjetos en esta solución tres veces durante cinco minutos a temperatura ambiente con agitación, luego incube las células con el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado diluido en solución de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente en una cámara oscura y húmeda en param.Al igual que antes, después de la incubación, enjuague las células al 0,1% entre 20 en PB S3 veces durante cinco minutos a temperatura ambiente en la oscuridad para fijar las células, sumérjalas en dos mililitros de formaldehído al 2% en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Una vez que las células se hayan teñido o si no están teñidas, continúe enjuagando los cubreobjetos tres veces en PBS. A continuación, coloque la tapa con el lado de la celda hacia abajo sobre una gota de 100 microlitros de 0,1 miligramos por mililitro.Los ARN en param en una cámara humidificada y se incuban durante una hora a 37 grados centígrados. Después de la incubación, enjuague los cubreobjetos tres veces en PBS y luego deje las células en hielo al 0,7%Trix 100 en ácido clorhídrico 0,1 molar durante 10 minutos en hielo en la oscuridad. Después de tres enjuagues en PBS, desnaturalice las células en ácido clorhídrico 1.9 molar durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad y lave tres veces más en PBS helado junto a las células hibridadas con las sondas.Coloque la tapa con el lado de la celda hacia abajo sobre una gota de 15 microlitros de sonda preparada en la sección anterior de este video en un portaobjetos de microscopio, selle el portaobjetos con cemento de goma e incube durante la noche a 37 grados centígrados en una cámara húmeda oscura. Al día siguiente, use pinzas para quitar con cuidado el cemento de goma de los portaobjetos. A continuación, frote los cubreobjetos con dos Acts SSC y utilice fórceps para retirar con cuidado los cubreobjetos con las células.Luego colóquelos en pozos que contengan solución de lavado. A continuación, realice los siguientes lavados agitando en la oscuridad dos XSSC durante 30 minutos a 37 grados centígrados, dos XSSC durante 30 minutos a temperatura ambiente y un XSSC durante 30 minutos a temperatura ambiente para montar las correderas, coloque los deslizadores de la cubierta con el lado de la celda hacia abajo sobre una gota de 10 a 15 microlitros de medio de montaje de oro prolongado que contenga 1,5 miligramos por mililitro DPI sellado con esmalte de uñas. Las diapositivas se pueden almacenar durante meses a 20 grados centígrados negativos.Una vez que las diapositivas estén listas, se recogieron imágenes en 3D con secciones ópticas separadas por 0,3 micras y se analizaron como se describe en el documento adjunto para determinar si los cambios en la asociación de los dos alelos de los loci del receptor de antígenos están relacionados con la regulación del proceso de recombinación de VDJ durante el desarrollo de los linfocitos, se utilizaron células de tipo salvaje y mutantes deficientes en la proteína recombinasa para examinar un locus de interés utilizando un ADN Sonda de pez generada a partir de una espalda que abarca aproximadamente 200 pares de kilobases que abarcan la región genómica. Las distancias entre alelos se midieron entre el centro de masa de cada señal de retroceso en pilas de imágenes 3D, círculos discontinuos, formas de núcleos de contorno. Las barras de escala que se muestran son de una micra, luego se generaron curvas de distribución de frecuencia acumulativa para mostrar todo el rango de distancias entre los dos alelos medidos en las células de tipo salvaje y mutantes.A continuación, se utilizó la prueba no paramétrica de KS de dos muestras para evaluar la significancia de las diferencias entre las dos distribuciones. El rango de las diferencias más robustas en las distancias interalélicas se evaluó utilizando una serie de dos pruebas exactas de pescadores de cola indicadas por los puntos azules. Los valores de P más robustos indicados por los puntos más altos se encontraron para las distancias alrededor de una micra.Por lo tanto, el límite para la asociación cercana o el emparejamiento de los dos alelos se estableció en una micra. Las curvas de frecuencia acumulativa que se muestran aquí indican el rango de distancias para la asociación cercana de los dos alelos de cero a 1,5 micras en las dos condiciones biológicas diferentes. La importancia del apareamiento de los dos alelos se evaluó utilizando la prueba exacta de dos pescadores de cola para un corte de una micra.Este gráfico muestra que en la condición mutante, los dos alelos no se asocian con alta frecuencia como en el tipo salvaje. Por lo tanto, el trapo de proteína que falta está involucrado en el apareamiento inico. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo combinar la inmunofluorescencia y el ADN de los peces.Esta técnica allanó el camino para los investigadores al proporcionar información sobre los cambios globales en la arquitectura nuclear, el comportamiento de loci y regiones genómicas específicas dentro del espacio nuclear y la asociación de proteínas nucleares específicas dentro de estas regiones. Y ayuda a comprender los mecanismos subyacentes a las diferentes enfermedades que siguen este procedimiento. Otros métodos, como las técnicas de rendimiento de hielo en todo el genoma, como la cromatina, las inmunoprecipitaciones o la búsqueda de chips o la confirmación de la captura de cromosomas, junto con la secuenciación profunda como fore five C o IC, se pueden realizar para proporcionar datos globales sobre las poblaciones celulares.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Doble fluorescencia In situ La hibridación en las secciones del cerebro fresco

En este artículo se describe la selección de sondas adecuadas para una sola célula FISH, las técnicas de difusión de los núcleos de blastómeros, y la hibridación in situ y la puntuación de la señal, aplicadas al diagnóstico genético preimplantacional (DGP) en un entorno clínico.

FISH para el diagnóstico genético preimplantacional

En este video, describimos el método de inmunofluorescencia para visualizar la localización de las proteínas de reparación del ADN γH2AX y 53BP1 en los sitios de roturas de ADN de doble cadena en núcleos celulares irradiados.

Visualización basada en inmunofluorescencia de las interacciones de las proteínas de reparación del ADN

Se describe un protocolo robusto y versátil para el análisis de la arquitectura nuclear por FISH 3D DNA usando sondas fluorescentes marcados directamente.

Robusto PESCADO ADN 3D utilizando sondas marcadas directamente

El material aquí describe un método desarrollado para preservar la estructura tridimensional de la cromatina de las células germinales testiculares. Esto se ha denominado el método de diapositiva tridimensional (3D). Este método mejora la sensibilidad para la detección de estructuras subnucleares y es aplicable para la inmunofluorescencia, el ADN y la hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH).

Método de preparación de diapositivas para preservar la arquitectura tridimensional de la cromatina de las células germinales testiculares

Cuatro dimensiones (4D) de formación de imágenes se utiliza para estudiar el comportamiento y las interacciones entre los dos tipos de endosomas en los terminales nerviosos de vertebrados vivían. Movimiento de estas pequeñas estructuras se caracteriza en tres dimensiones, permitiendo la confirmación de eventos tales como la fusión endosoma y la exocitosis.

Visualización de la Dinámica en Endosoma Vivir terminaciones nerviosas con imágenes de fluorescencia en cuatro dimensiones

Desarrollo de cilios es vital para la correcta organogénesis. Este protocolo describe un método optimizado para la etiqueta y visualizar las células ciliadas del pez cebra.

Visualización de las células Multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo Monte fluorescente In Situ hibridación e inmunofluorescencia

Este protocolo demuestra la inmunofluorescencia secuencial y la inmunohistoquímica en criosecciones de embriones de pez cebra en etapa temprana que permiten análisis precisos de la colocación en poblaciones celulares específicas.

Inmunofluorescencia secuencial e inmunohistoquímica en embriones de pez cebra crioseccionados

3D multicolor DNA FISH representa una herramienta para visualizar múltiples loci genómicos dentro de núcleos conservados 3D, definiendo inequívocamente sus interacciones recíprocas y localización dentro del espacio nuclear a un solo nivel de célula. Aquí, se describe un protocolo paso a paso para un amplio espectro de células primarias humanas.

Herramienta 3D Multicolor DNA FISH para estudiar la arquitectura nuclear en células primarias humanas

Presentamos aquí un protocolo mejorado para la preparación de montaje completo y la inmunotensión de los testículos de Drosophila, adecuado para la microscopía confocal y también permitiendo el etiquetado reproducible y confiable. Ilustramos este protocolo por la representación y la cuantificación 3D de los experimentos del colocalization en los spermatocytes grandes S4-S5.

Inmunostaining De Todo El Monte Drosophila Testículos Para El Análisis Confocal 3D De Los Espermatocitos Grandes

Aprende a combinar inmunofluorescencia y FISH de ADN para detectar modificaciones de histonas y secuencias genómicas simultáneamente en núcleos tridimensionales preservados. Este método permite visualizar la organización de la cromatina con microscopía confocal 3D.

Inmunofluorescencia y FISH Combinado de ADN en 3D conservados núcleos en interfase para estudiar los cambios en la organización nuclear 3D (Video) | JoVE Journal

Inmunofluorescencia y FISH Combinado de ADN en 3D conservados núcleos en interfase para estudiar los cambios en la organización nuclear 3D

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