Inmunofluorescencia y FISH Combinado de ADN en 3D conservados núcleos en interfase para estudiar los cambios en la organización nuclear 3D

El objetivo general de este procedimiento es detectar las modificaciones de la cromatina y las secuencias de ADN simultáneamente mediante microscopía confocal 3D, primero se generan sondas de ADN específicas. Mientras tanto, las células experimentales están permanentes fijas e inmunoteñidas. Para los marcadores de histonas de interés.

A continuación, las células se desnaturalizan y se produce una fluorescencia nocturna en su interior. La hibridación de peces se realiza utilizando una o más sondas de ADN. Finalmente, las células se lavan y se montan para fluorescencia 3D.

El análisis microscópico de las imágenes resultantes revela la localización nuclear de los loci de interés y la asociación con modificaciones específicas de los cálculos. La principal ventaja de esta técnica es que combina la visualización de proteínas nucleares, incluidos los cálculos, con loci genómicos en núcleos preservados en 3D, y puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la organización nuclear epigenética de la cromatina o la regulación génica. Para este procedimiento, se pueden utilizar plásmidos de respaldo o productos de PCR para el etiquetado.

Estos deben prepararse como se describe en el texto adjunto. Tenga en cuenta que para una señal de pez robusta, las sondas deben gastar al menos 10 pares de kilobases. Comience este procedimiento combinando un microgramo de ADN y 0,17 microgramos de ARN A en un tubo de microcentrífuga.

Incubar durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, inactive brevemente los ARN A en hielo y agregue la cantidad adecuada de traducción de Nick. Mezclar la incubación durante dos horas a 16 grados centígrados en un baño de agua refrigerada o en un bloque frío para inactivar la reacción.

Coloque los tubos a menos 80 grados centígrados durante una hora o a menos 20 grados centígrados durante la noche. A continuación, determine el tamaño de la sonda en un gel 2%agros. El frotis debe estar entre 101.000 pares de bases y la mayoría aproximadamente entre 300 y 500 pares de bases.

Tenga en cuenta que la mancha de las sondas de ciencia ficción no es visible. Una vez determinado el tamaño, purificar las sondas por diálisis a 0,02. Filtros de cinco milímetros en vasos de precipitados de dos litros llenos de agua.

Pipetee suavemente 200 microgramos de sonda en el centro de cada filtro flotante, luego incube durante dos horas en la oscuridad. Después de la incubación, use una pipeta para transferir suavemente la sonda de los filtros a un tubo de microcentrífuga nuevo. A continuación, agregue factores de bloqueo a las sondas de la siguiente manera.

Un microgramo de CO 1D NA. Un microgramo de ADN de alto bloque y 10 microgramos de esperma de salmón para un microgramo de sonda de ADN y mezcla almacena las sondas de ADN a 20 grados centígrados negativos. El día del procedimiento con peces, las sondas se precipitan y se preparan para su uso. Tenga en cuenta que los pasos descritos en esta sección del vídeo deben realizarse en paralelo con los pasos de la siguiente sección.

Para precipitar las sondas, sígalas y combínelas con 0,1 volúmenes de acetato de sodio molar a pH 5,2 y 2,5 volúmenes de etanol al 100% incubar durante una hora a 80 grados centígrados negativos. Después de la incubación, gire las sondas a 16.000 veces G a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Después del centrifugado, deseche el sobrenadante y seque al aire los gránulos en la oscuridad.

Dependiendo de la cantidad y el color de las sondas, el pellet puede o no ser visible. Resus suspende el pellet en 15 microlitros de tampón de hibridación por condición de prueba y agita con un termomezclador einor en la oscuridad a 37 a 45 grados centígrados durante aproximadamente 20 minutos. A continuación, para desnaturalizar, las sondas las incuban durante cinco minutos a 75 a 95 grados centígrados.

Luego, a las presondas, incubarlas a 37 grados centígrados durante 30 a 60 minutos en el termomezclador. Inmediatamente después de la incubación, las sondas se aplicarán a las células en cubreobjetos como se describe en la siguiente sección del video. Tenga en cuenta que para los siguientes pasos, los tiempos de incubación deben modificarse según sea necesario para los anticuerpos y las células utilizados.

Los pasos descritos en esta sección del vídeo deben realizarse en paralelo con los pasos de la sección anterior, tal como se describe en el texto adjunto. Coloque las células no adherentes en la parte superior de los cubreobjetos recubiertos de polilisina en pocillos de placas de seis pocillos y déjelos adherir durante cinco minutos. A continuación, añada suavemente dos mililitros de aldehído paraforme al 2% en la incubación PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente después de la incubación.

Enjuague cada pocillo con PB S3 veces, luego para permear las células, agregue dos mililitros de hielo frío, 0.4%Triton X 100 en PBS e incube durante cinco minutos en hielo. Después de aspirar la solución permeable, si el ADN de los peces se combinará con la inmunofluorescencia, proceda de la siguiente manera. Primero pipetear 100 microlitros de solución de bloqueo en el param en una cámara humidificada.

Coloque la tapa con el lado de la celda deslizante hacia abajo sobre la solución de bloqueo e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, transfiera. La cobertura se desliza a 100 microlitros de gotas del anticuerpo primario diluido en una solución bloqueante.

En este caso, el anticuerpo utilizado reconoce el sirio fosforilado 1 39 de H dos A x o gamma H dos A x. Incubar los portaobjetos en una cámara humidificada durante una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, use fórceps para quitar con cuidado los cubreobjetos.

Si es difícil recoger los comprobantes, inuncújelos con PBS y vuelva a intentarlo. Transfiera cada portaobjetos a un pozo de seis. La placa de pocillos contiene dos mililitros de 0,2%BSA 0,1%tween 20 en PBS, lave los cubreobjetos en esta solución tres veces durante cinco minutos a temperatura ambiente con agitación, luego incube las células con el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado diluido en solución de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente en una cámara oscura y húmeda en param.

Al igual que antes, después de la incubación, enjuague las células al 0,1% entre 20 en PB S3 veces durante cinco minutos a temperatura ambiente en la oscuridad para fijar las células, sumérjalas en dos mililitros de formaldehído al 2% en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Una vez que las células se hayan teñido o si no están teñidas, continúe enjuagando los cubreobjetos tres veces en PBS. A continuación, coloque la tapa con el lado de la celda hacia abajo sobre una gota de 100 microlitros de 0,1 miligramos por mililitro.

Los ARN en param en una cámara humidificada y se incuban durante una hora a 37 grados centígrados. Después de la incubación, enjuague los cubreobjetos tres veces en PBS y luego deje las células en hielo al 0,7%Trix 100 en ácido clorhídrico 0,1 molar durante 10 minutos en hielo en la oscuridad. Después de tres enjuagues en PBS, desnaturalice las células en ácido clorhídrico 1.9 molar durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad y lave tres veces más en PBS helado junto a las células hibridadas con las sondas.

Coloque la tapa con el lado de la celda hacia abajo sobre una gota de 15 microlitros de sonda preparada en la sección anterior de este video en un portaobjetos de microscopio, selle el portaobjetos con cemento de goma e incube durante la noche a 37 grados centígrados en una cámara húmeda oscura. Al día siguiente, use pinzas para quitar con cuidado el cemento de goma de los portaobjetos. A continuación, frote los cubreobjetos con dos Acts SSC y utilice fórceps para retirar con cuidado los cubreobjetos con las células.

Luego colóquelos en pozos que contengan solución de lavado. A continuación, realice los siguientes lavados agitando en la oscuridad dos XSSC durante 30 minutos a 37 grados centígrados, dos XSSC durante 30 minutos a temperatura ambiente y un XSSC durante 30 minutos a temperatura ambiente para montar las correderas, coloque los deslizadores de la cubierta con el lado de la celda hacia abajo sobre una gota de 10 a 15 microlitros de medio de montaje de oro prolongado que contenga 1,5 miligramos por mililitro DPI sellado con esmalte de uñas. Las diapositivas se pueden almacenar durante meses a 20 grados centígrados negativos.

Una vez que las diapositivas estén listas, se recogieron imágenes en 3D con secciones ópticas separadas por 0,3 micras y se analizaron como se describe en el documento adjunto para determinar si los cambios en la asociación de los dos alelos de los loci del receptor de antígenos están relacionados con la regulación del proceso de recombinación de VDJ durante el desarrollo de los linfocitos, se utilizaron células de tipo salvaje y mutantes deficientes en la proteína recombinasa para examinar un locus de interés utilizando un ADN Sonda de pez generada a partir de una espalda que abarca aproximadamente 200 pares de kilobases que abarcan la región genómica. Las distancias entre alelos se midieron entre el centro de masa de cada señal de retroceso en pilas de imágenes 3D, círculos discontinuos, formas de núcleos de contorno. Las barras de escala que se muestran son de una micra, luego se generaron curvas de distribución de frecuencia acumulativa para mostrar todo el rango de distancias entre los dos alelos medidos en las células de tipo salvaje y mutantes.

A continuación, se utilizó la prueba no paramétrica de KS de dos muestras para evaluar la significancia de las diferencias entre las dos distribuciones. El rango de las diferencias más robustas en las distancias interalélicas se evaluó utilizando una serie de dos pruebas exactas de pescadores de cola indicadas por los puntos azules. Los valores de P más robustos indicados por los puntos más altos se encontraron para las distancias alrededor de una micra.

Por lo tanto, el límite para la asociación cercana o el emparejamiento de los dos alelos se estableció en una micra. Las curvas de frecuencia acumulativa que se muestran aquí indican el rango de distancias para la asociación cercana de los dos alelos de cero a 1,5 micras en las dos condiciones biológicas diferentes. La importancia del apareamiento de los dos alelos se evaluó utilizando la prueba exacta de dos pescadores de cola para un corte de una micra.

Este gráfico muestra que en la condición mutante, los dos alelos no se asocian con alta frecuencia como en el tipo salvaje. Por lo tanto, el trapo de proteína que falta está involucrado en el apareamiento inico. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo combinar la inmunofluorescencia y el ADN de los peces.

Esta técnica allanó el camino para los investigadores al proporcionar información sobre los cambios globales en la arquitectura nuclear, el comportamiento de loci y regiones genómicas específicas dentro del espacio nuclear y la asociación de proteínas nucleares específicas dentro de estas regiones. Y ayuda a comprender los mecanismos subyacentes a las diferentes enfermedades que siguen este procedimiento. Otros métodos, como las técnicas de rendimiento de hielo en todo el genoma, como la cromatina, las inmunoprecipitaciones o la búsqueda de chips o la confirmación de la captura de cromosomas, junto con la secuenciación profunda como fore five C o IC, se pueden realizar para proporcionar datos globales sobre las poblaciones celulares.