Cryosectioning Comunidades levadura para examinar los patrones de fluorescencia

El objetivo general del siguiente experimento es producir secciones transversales de comunidades de levadura para examinar la distribución espacial de diferentes poblaciones de células fluorescentes dentro de una comunidad. Esto se logra primero congelando la comunidad y luego fijándola con metanol para preservar la distribución espacial de las células en la comunidad. Como segundo paso, el metanol se evapora para permitir la penetración del compuesto OCT incrustante.

A continuación, la comunidad incrustada se congela en preparación para la criosección. A continuación, una criomama secciones. La comunidad y las secciones transversales se pueden visualizar bajo un microscopio de fluorescencia Se obtienen resultados que muestran la distribución espacial de las poblaciones de células fluorescentes dentro de una comunidad.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el corte óptico, es que revela la distribución espacial de las poblaciones en el interior de estas comunidades. Para comenzar este procedimiento, cultive comunidades de levadura en un filtro de membrana. Este protocolo corresponde a una comunidad típica de menos de dos veces 10 por las ocho celdas de un filtro de membrana de seis milímetros de diámetro que se encuentra a continuación en un congelador de menos 20 grados centígrados.

Para conservar un mayor grado de fluorescencia, utilice un trozo de papel de filtro watman 5 4 1 para cubrir la parte inferior de un centímetro de diámetro. Bueno, este papel de filtro se utiliza como portador para transferir la comunidad En etapas posteriores, agregue un mililitro de menos 20 grados Celsius, 100% de metanol al pozo y deje el pozo a menos 20 grados Celsius para que la temperatura se equilibre. Ahora, congele la comunidad de levaduras usando pinzas para sumergir el filtro de membrana con la comunidad en nitrógeno líquido durante al menos 15 segundos.

A continuación, transfiera la comunidad congelada al pozo con menos 20 grados centígrados. El metanol en el congelador asegura que la comunidad se mantenga horizontal. Al sumergirlo en el metanol, espere 20 minutos, el filtro de membrana comenzará a desintegrarse en el metanol.

Después de 20 minutos, transfiera la comunidad usando el papel de filtro Watman portador del pozo de metanol a una placa de Petri fría mantenida a menos 20 grados centígrados. Al transferir, mantenga a la comunidad en la parte superior del filtro Watman del operador. Retire las gotas adicionales de metanol con otro trozo de papel watman grueso antes de ponerlo en la placa de Petri fría.

Esto asegurará que el tiempo de evaporación del metanol sea constante de una muestra a otra. Espere de cuatro a seis horas para que el metanol se evapore. Poner fin a la evaporación en el momento adecuado es crucial para el éxito de este procedimiento.

Para evitar el secado excesivo de la muestra, compruebe periódicamente el estado de la comunidad de levaduras durante la evaporación, mientras se evapora el metanol. Haga un recipiente rectangular de papel de aluminio cúbico que sea lo suficientemente grande como para que la muestra tenga al menos dos milímetros de margen desde cada lado. Agregue una gota de OCT al fondo de este recipiente para asegurarse de que la muestra esté rodeada de OCT por todos los lados.

Cuando se complete la evaporación, saque la muestra del congelador a menos 20 grados centígrados. Corta las partes del papel de filtro que no estén cubiertas por la comunidad de levadura. Es importante realizar este paso rápidamente.

Para evitar el secado excesivo de la muestra. Coloque la comunidad en la superficie inferior del recipiente de papel de aluminio e inmediatamente cubra la muestra con OCT a tres o cuatro milímetros por encima de la altura de la comunidad. Espere 10 minutos.

Finalmente, coloque la muestra incrustada de OCT en una placa metálica sobre hielo seco para congelar y almacene las comunidades congeladas a menos 20 grados Celsius o menos 80 grados Celsius. En preparación para seccionar comunidades congeladas, ajuste la temperatura de la cámara de sección criogénica a menos 25 grados Celsius. Deje las muestras en la cámara hasta que su temperatura alcance la temperatura de la cámara.

A continuación, retire la lámina de la muestra y corte el exceso de OCT. Aplique una gota de OCT en una montura criogénica y monte la muestra en la montura criogénica. Extienda la OCT uniformemente en el costado de la muestra con papel de filtro watman expuesto de modo que el grosor de la OCT sea de dos a tres milímetros.

Asegurar un margen OCT de dos a tres milímetros en todos los lados de la muestra ayuda a preservar la integridad de las secciones. Deje que la OCT se congele dentro de la cámara de criostato antes de seccionar. Utilice los lados del bloque de muestra OCT para alinear la muestra con respecto a la cuchilla.

Si la muestra no está alineada con respecto a la hoja, el corte comenzará desde una esquina o un lado de la muestra. Ajuste el soporte para asegurarse de que la cuchilla corte una cara perfectamente vertical del bloque de muestra. Las secciones típicas de las comunidades de levadura tienen un grosor de unos 14 micrómetros.

Después de cortar una sección, use un portaobjetos de microscopio mantenido a temperatura ambiente para recolectar la sección. Al mover lentamente el portaobjetos a la sección cortada, la sección se derretirá y se transferirá al microscopio. Se pueden transferir hasta 18 secciones a una guía.

Guarde los portaobjetos a temperaturas frías, preferiblemente a menos 20 grados centígrados antes de tomar imágenes. La pérdida de señal es mínima cuando se mantiene durante una semana a cuatro grados centígrados para obtener la máxima señal fluorescente. Las imágenes deben realizarse inmediatamente después de la sección.

Aquí se muestran imágenes representativas de fluorescencia de secciones transversales verticales de comunidades de levaduras cultivadas en condiciones idénticas. La comunidad está formada por dos cepas fototrópicas de visier marcadas con las proteínas fluorescentes. La cereza M se visualiza en rojo y Y-E-G-F-P se visualiza como una competencia verde por los recursos compartidos, incluido el espacio conduce a patrones columnares como se muestra en sus secciones transversales verticales.

Las resoluciones de hasta una sola celda se pueden resolver en secciones transversales. Esta figura compara las secciones transversales obtenidas con la fijación de metanol que se muestra en el panel inferior y sin la fijación de metanol que se muestra en el panel superior. La señal fluorescente se conserva en las secciones de la comunidad sin fijarla, pero la integridad de la comunidad se ve comprometida.

Como resultado, algunas celdas flotan alrededor del borde de la sección y el rendimiento general es menor en comparación con las comunidades fijas. La fijación con metanol mantiene unidas las células de la comunidad, pero provoca la contracción, como se observa en la disminución de la altura de la comunidad. Esta figura muestra secciones transversales representativas de campo claro y fluorescencia de una comunidad de levaduras que consta de dos cepas protópicas de visier teed con proteínas fluorescentes DS RED e YFP.

Las células de la parte superior de la comunidad forman una corona que parece distinta de las células madre, caracterizada por una dispersión más fuerte en campo claro y una fluorescencia más brillante. Estos patrones son consistentes con los patrones reportados de diferenciación en las colonias de levadura. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar la criosección para examinar los patrones espaciales de fluorescencia dentro de las comunidades de levaduras.