Name: Cryosectioning Comunidades levadura para examinar los patrones de fluorescencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprende a realizar criosección de comunidades de levadura para examinar patrones de fluorescencia interna mediante fijación con metanol y microscopía. Este método preserva la distribución espacial celular.

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Nos gustaría dar las gracias a Jonathan Cooper Lab en Fred Hutchinson Cancer Research Center para el permiso de usar su criostato. Este trabajo fue apoyado por el NIH y la Fundación WM Keck. BM es un compañero Gordon y Betty Moore de Investigación de la Fundación Ciencias de la Vida. Damos las gracias a Daniel Gottschling por compartir su protocolo de fijación con nosotros.

1. La fijación de Comunidades de levadura <ol><li> Grow comunidades de levadura en un filtro de membrana (por ejemplo, Millipore filtro de membrana MF; Figura 2A). Este protocolo corresponde a una comunidad típica de menos de 2x10 8 células sobre un filtro de membrana de 6 mm de diámetro. </li><li> Utilice un trozo de papel de filtro Whatman 541 para cubrir la parte inferior de un 1 cm de diámetro pozo (Figura 2B). Este papel Whatman se usa como portador para transferir la comunidad en las etapas posteriores. Añadir 1 ml de metanol 100% hasta el pozo, y dejar el bien en -20 ° C para la temperatura se equilibre. </li><li> Ponga N 2 líquido en una botella Dewar. Congelar comunidad en nitrógeno líquido por inmersión de la comunidad durante al menos 15 segundos en N 2 líquido utilizando una pinza (Figura 2 C). </li><li> Transferir comunidad congelado al pozo de -20 ° C metanol (Figura 2D). Asegúrese de que la comunidad se mantenga en posición horizontal cuando se sumerge en el metanol.Espere 20 min. El filtro de membrana MF comienza a desintegrarse en metanol. </li><li> Transferir comunidad usando el portador 541 de papel de filtro Whatman del metanol así a una placa de Petri frío mantenido a -20 ° C para la evaporación del metanol (2E Figura). Al transferir, mantener a la comunidad en la parte superior del soporte de filtro Whatman y arrastrar gotas más de metanol utilizando una pieza de papel grueso Whatman antes de poner en el frío plato de Petri. Esto asegurará que el tiempo de evaporación es coherente de muestra a muestra. </li><li> Espere 4-6 horas para la evaporación hasta que el portador de filtro Whatman parezca seca. Evaporación insuficiente deja metanol residual que interfiere con el corte. El secado excesivo causa grietas y deformaciones en las comunidades. </li><li> Tomar la muestra de -20 ° C congelador. Cortar papel de filtro Whatman 541 no cubiertos por la comunidad. </li><li> Hacer una cúbica rectangular papel de aluminio contenedor que es lo suficientemente grande de tal manera que la muestra tiene al menos 2 ~ mm de margencada lado (Figura 2F). Coloque la comunidad en la superficie inferior del envase de aluminio papel de aluminio; cubrir inmediatamente la muestra con octubre al 3 ~ 4 mm por encima de la altura de la comunidad. Si importante, la orientación de la muestra se puede ajustar en este paso con respecto a los lados del recipiente. Esperar 10 min. </li><li> Coloque la muestra OCT-integrado en una placa metálica en hielo seco para congelar. La tienda de las comunidades congelados a -20 ° C o -80 ° C congelador. </li></ol> 2. Seccionamiento Comunidades congelados para imágenes fluorescentes <ol><li> Ajustar la temperatura de la cámara de sección criogénica a -25 ° C y dejar las muestras en la cámara hasta que su temperatura alcanza la temperatura de la cámara. </li><li> Montar la muestra en un crio de montaje después de aplicar una gota de octubre en el monte. Corre octubre uniformemente en el lado de la muestra con papel de filtro Whatman expuesta (parte inferior del contenedor) de modo que el espesor de octubre es 2-3 mm. Vamos a congelar octubre dentro de la cámara antes de criostato síctioning. Garantizar un margen de octubre de 2-3 mm en todos los lados de la muestra ayuda a preservar la integridad de las secciones. </li><li> Los lados del bloque de muestras de octubre se puede utilizar para alinear la muestra. Si la muestra no está alineada con respecto a la cuchilla, la sección se iniciará desde una esquina o lado de la muestra. Ajustar el montaje para asegurar que la cuchilla corta un perfectamente vertical (u horizontal) la cara del bloque de muestras. </li><li> Las secciones típicas de las comunidades levaduras son ~ 14 micras de espesor. Después de cortar una sección, usar un portaobjetos de microscopio mantenido a temperatura ambiente para recoger la sección, se aproxima lentamente por la corredera a la sección de corte. La sección se fundirá y transferir al portaobjetos de microscopio. Hasta 18 secciones pueden ser transferidos a una diapositiva. </li><li> Guarde las diapositivas a las bajas temperaturas, preferiblemente -20 º C, antes de obtención de imágenes. Pérdida de la señal es mínima cuando se mantienen durante una semana a 4 ° C. Para señal de fluorescencia máxima, la imagen se hace preferiblemente inmediatamente después de la sección. </li></ol>

<ol><li>Tolker-Nielsen, T., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Organization+of+Microbial+Biofilm+Communities%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities.</a> Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).</li>
<li>Moller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+In+Situ+Gene+Expression+in+Mixed-Culture+Biofilms%3A+Evidence+of+Metabolic+Interactions+between+Community+Members%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)"> In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).</li>
<li>Lepp, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanogenic+Archaea+and+human+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Methanogenic Archaea and human periodontal disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).</li>
<li>Váchová, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony%3A+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).</li>
<li>Mináriková, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+Gene+Expression+in+Cells+within+Yeast+Colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies.</a> Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).</li>
<li>Shou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+cooperation+in+engineered+yeast+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synthetic cooperation in engineered yeast populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).</li>
<li>Momeni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+generates+a+unique+spatial+signature+in+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities.</a> , Submitted (2012).</li>
<li>Kiernan, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKiernan%2C+J+%22Histological+and+Histochemical+Methods%3A+Theory+and+Practice%22">Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice</a>. ed, , 4th, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 4(2008).</li>
<li>Piccirillo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rim101p%2FPacC+Pathway+and+Alkaline+pH+Regulate+Pattern+Formation+in+Yeast+Colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies.</a> Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El procedimiento presentado aquí ofrece una manera de inspeccionar la estructura interna de las comunidades de levadura. La etapa de fijación de metanol hace que la colonia de levadura rígido 8 y preserva la integridad de la colonia, sin embargo, también provoca la contracción 8 que deben tenerse en cuenta en la interpretación de los resultados. Normalmente vemos alrededor del 30% de contracción en la altura de las colonias de hongos, en comparación con las colonias directamente embebidos en OCT si...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> 100% de metanol </td><td> JT Baker </td><td> 9070-01 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek octubre Compuesto </td><td> Andwin Científico </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Whatman Grado N º 541 Papel de filtro cuantitativo </td><td> Whatman </td><td> 1541-047 </td><td></td></tr><tr><td> Millipore-MF filtro de membrana </td><td> Millipore </td><td> HAWP04700 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Leica </td><td> CM 1510 S </td><td></td></tr></tbody></table>

cryosectioning comunidades levadura para examinar los patrones de fluorescencia

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Los microbios suelen vivir en las comunidades. La organización espacial de las células dentro de una comunidad que se cree un impacto en la supervivencia y la función de la comunidad 1. Ópticos técnicas de seccionamiento, incluyendo microscopía confocal y dos fotones, han demostrado ser útiles para la observación de la organización espacial de las comunidades bacterianas y archaeal 2,3. Una combinación de imagen confocal y seccionamiento físico de colonias de levaduras ha revelado la organización interna de las células 4. Sin embargo, el seccionamiento óptico directo por microscopía confocal o dos fotones sólo ha sido capaz de llegar a las capas celulares de profundidad en algunas colonias de levaduras. Esta limitación es probable debido a la dispersión de luz intensa a partir de 4 células de levadura. Aquí, se presenta un método basado en la fijación y crioseccionamiento para obtener la distribución espacial de las células fluorescentes dentro de las comunidades de Saccharomyces cerevisiae. Usamos metanol como agente fijadorpara preservar la distribución espacial de las células. Comunidades fijos se infiltró con el compuesto OCT, congelado, y cryosectioned en un criostato. Imágenes de fluorescencia de las secciones revela que la organización interna de las células fluorescentes dentro de la comunidad. Ejemplos de comunidades de levadura que consisten en cepas que expresan proteínas fluorescentes rojas y verdes demostrar el potencial del método cryosectioning para revelar la distribución espacial de las células fluorescentes, así como el de la expresión de genes dentro de las colonias de levadura 2,3. Aunque nuestra atención se ha centrado en las comunidades de Saccharomyces cerevisiae, el mismo método que potencialmente se pueden aplicar a examinar otras comunidades microbianas.

Fluorescencia imágenes de secciones transversales verticales de las comunidades de levadura que contienen rojo y verde-etiquetados poblaciones competitivos 6 se muestran en la Figura 3. Estas comunidades constan de dos cepas prototróficas de levadura y su competencia por los recursos compartidos, incluyendo el espacio, conduce a patrones columnar 7, como se muestra en sus secciones transversales verticales. Resoluciones de hasta una sola célula se pueden resolver en las secciones t...

Se presenta un protocolo para la congelación y cryosectioning comunidades levadura para observar los patrones internos de las células fluorescentes. El método se basa en la fijación de metanol y OCT-incrustación de preservar la distribución espacial de las células sin inactivar proteínas fluorescentes dentro de una comunidad.

Cryosectioning Comunidades levadura para examinar los patrones de fluorescencia

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

El objetivo general del siguiente experimento es producir secciones transversales de comunidades de levadura para examinar la distribución espacial de diferentes poblaciones de células fluorescentes dentro de una comunidad. Esto se logra primero congelando la comunidad y luego fijándola con metanol para preservar la distribución espacial de las células en la comunidad. Como segundo paso, el metanol se evapora para permitir la penetración del compuesto OCT incrustante.A continuación, la comunidad incrustada se congela en preparación para la criosección. A continuación, una criomama secciones. La comunidad y las secciones transversales se pueden visualizar bajo un microscopio de fluorescencia Se obtienen resultados que muestran la distribución espacial de las poblaciones de células fluorescentes dentro de una comunidad.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el corte óptico, es que revela la distribución espacial de las poblaciones en el interior de estas comunidades. Para comenzar este procedimiento, cultive comunidades de levadura en un filtro de membrana. Este protocolo corresponde a una comunidad típica de menos de dos veces 10 por las ocho celdas de un filtro de membrana de seis milímetros de diámetro que se encuentra a continuación en un congelador de menos 20 grados centígrados.Para conservar un mayor grado de fluorescencia, utilice un trozo de papel de filtro watman 5 4 1 para cubrir la parte inferior de un centímetro de diámetro. Bueno, este papel de filtro se utiliza como portador para transferir la comunidad En etapas posteriores, agregue un mililitro de menos 20 grados Celsius, 100% de metanol al pozo y deje el pozo a menos 20 grados Celsius para que la temperatura se equilibre. Ahora, congele la comunidad de levaduras usando pinzas para sumergir el filtro de membrana con la comunidad en nitrógeno líquido durante al menos 15 segundos.A continuación, transfiera la comunidad congelada al pozo con menos 20 grados centígrados. El metanol en el congelador asegura que la comunidad se mantenga horizontal. Al sumergirlo en el metanol, espere 20 minutos, el filtro de membrana comenzará a desintegrarse en el metanol.Después de 20 minutos, transfiera la comunidad usando el papel de filtro Watman portador del pozo de metanol a una placa de Petri fría mantenida a menos 20 grados centígrados. Al transferir, mantenga a la comunidad en la parte superior del filtro Watman del operador. Retire las gotas adicionales de metanol con otro trozo de papel watman grueso antes de ponerlo en la placa de Petri fría.Esto asegurará que el tiempo de evaporación del metanol sea constante de una muestra a otra. Espere de cuatro a seis horas para que el metanol se evapore. Poner fin a la evaporación en el momento adecuado es crucial para el éxito de este procedimiento.Para evitar el secado excesivo de la muestra, compruebe periódicamente el estado de la comunidad de levaduras durante la evaporación, mientras se evapora el metanol. Haga un recipiente rectangular de papel de aluminio cúbico que sea lo suficientemente grande como para que la muestra tenga al menos dos milímetros de margen desde cada lado. Agregue una gota de OCT al fondo de este recipiente para asegurarse de que la muestra esté rodeada de OCT por todos los lados.Cuando se complete la evaporación, saque la muestra del congelador a menos 20 grados centígrados. Corta las partes del papel de filtro que no estén cubiertas por la comunidad de levadura. Es importante realizar este paso rápidamente.Para evitar el secado excesivo de la muestra. Coloque la comunidad en la superficie inferior del recipiente de papel de aluminio e inmediatamente cubra la muestra con OCT a tres o cuatro milímetros por encima de la altura de la comunidad. Espere 10 minutos.Finalmente, coloque la muestra incrustada de OCT en una placa metálica sobre hielo seco para congelar y almacene las comunidades congeladas a menos 20 grados Celsius o menos 80 grados Celsius. En preparación para seccionar comunidades congeladas, ajuste la temperatura de la cámara de sección criogénica a menos 25 grados Celsius. Deje las muestras en la cámara hasta que su temperatura alcance la temperatura de la cámara.A continuación, retire la lámina de la muestra y corte el exceso de OCT. Aplique una gota de OCT en una montura criogénica y monte la muestra en la montura criogénica. Extienda la OCT uniformemente en el costado de la muestra con papel de filtro watman expuesto de modo que el grosor de la OCT sea de dos a tres milímetros.Asegurar un margen OCT de dos a tres milímetros en todos los lados de la muestra ayuda a preservar la integridad de las secciones. Deje que la OCT se congele dentro de la cámara de criostato antes de seccionar. Utilice los lados del bloque de muestra OCT para alinear la muestra con respecto a la cuchilla.Si la muestra no está alineada con respecto a la hoja, el corte comenzará desde una esquina o un lado de la muestra. Ajuste el soporte para asegurarse de que la cuchilla corte una cara perfectamente vertical del bloque de muestra. Las secciones típicas de las comunidades de levadura tienen un grosor de unos 14 micrómetros.Después de cortar una sección, use un portaobjetos de microscopio mantenido a temperatura ambiente para recolectar la sección. Al mover lentamente el portaobjetos a la sección cortada, la sección se derretirá y se transferirá al microscopio. Se pueden transferir hasta 18 secciones a una guía.Guarde los portaobjetos a temperaturas frías, preferiblemente a menos 20 grados centígrados antes de tomar imágenes. La pérdida de señal es mínima cuando se mantiene durante una semana a cuatro grados centígrados para obtener la máxima señal fluorescente. Las imágenes deben realizarse inmediatamente después de la sección.Aquí se muestran imágenes representativas de fluorescencia de secciones transversales verticales de comunidades de levaduras cultivadas en condiciones idénticas. La comunidad está formada por dos cepas fototrópicas de visier marcadas con las proteínas fluorescentes. La cereza M se visualiza en rojo y Y-E-G-F-P se visualiza como una competencia verde por los recursos compartidos, incluido el espacio conduce a patrones columnares como se muestra en sus secciones transversales verticales.Las resoluciones de hasta una sola celda se pueden resolver en secciones transversales. Esta figura compara las secciones transversales obtenidas con la fijación de metanol que se muestra en el panel inferior y sin la fijación de metanol que se muestra en el panel superior. La señal fluorescente se conserva en las secciones de la comunidad sin fijarla, pero la integridad de la comunidad se ve comprometida.Como resultado, algunas celdas flotan alrededor del borde de la sección y el rendimiento general es menor en comparación con las comunidades fijas. La fijación con metanol mantiene unidas las células de la comunidad, pero provoca la contracción, como se observa en la disminución de la altura de la comunidad. Esta figura muestra secciones transversales representativas de campo claro y fluorescencia de una comunidad de levaduras que consta de dos cepas protópicas de visier teed con proteínas fluorescentes DS RED e YFP.Las células de la parte superior de la comunidad forman una corona que parece distinta de las células madre, caracterizada por una dispersión más fuerte en campo claro y una fluorescencia más brillante. Estos patrones son consistentes con los patrones reportados de diferenciación en las colonias de levadura. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar la criosección para examinar los patrones espaciales de fluorescencia dentro de las comunidades de levaduras.

cryosectioning-yeast-communities-for-examining-fluorescence-patterns

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