Name: Aislamiento y análisis de Brain-secuestrados Los leucocitos de Plasmodium berghei ANKA de ratones infectados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Aprende a aislar leucocitos inflamatorios adherentes de vasos sanguíneos cerebrales en ratones infectados con Plasmodium berghei ANKA. Este método permite cuantificar y caracterizar estas células mediante citometría de flujo multicolor para estudiar la patogénesis de la malaria cerebral experimental.

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Los autores desean agradecer a la Srta. Liana Mackiewicz de asistencia técnica. Este trabajo ha sido posible gracias al apoyo del Gobierno del Estado victoriano infraestructura operativa y del Gobierno de Australia National Health and Medical Research Council IRIISS Proyecto de Donación y 1031212.

1. La infección de ratones con P. berghei ANKA- <ol><li> Descongelar una alícuota de criopreservado P. berghei ANKA GRI. </li><li> Reprime un cerebral malaria resistente a ratones BALB / c de ratón donante (8-12 semanas de edad) mediante la técnica de restricción de dos manos. Inyectar ratón con 100-200 l de pRBC utilizando una jeringa de 1 ml de insulina (28G aguja). Rutinariamente, 1-2 ratones donantes se inyectan. </li><li> En 4-5 días post-infección (pi) eliminar ratón donante de la jaula y lo coloca en una estación de trabajo o un paño desechable de trabajo. </li><li> Suavemente contener ratón por el extremo de la cola con unas tijeras pequeñas y cortar la punta de la cola (aproximadamente 1 mm). Alternativamente, una punción pequeña cola usando una aguja de 25 G se pudo realizar. </li><li> Colocar una gota de sangre de la vena de la cola del ratón cerca del final de un portaobjetos de microscopio esmerilado final. </li><li> Coloque una segunda diapositiva (spreader) en un ángulo de 45 ° y una copia en la gota de sangre. Una vez que la sangre se extiende a lo largo del borde, pulse la víspera esparcidor de diapositivasólo en todo el portaobjetos de un microscopio para hacer el frotis de sangre. Deje que la mancha se seque al aire. </li><li> Fijar los frotis de sangre en 100% de metanol durante 30 segundos y luego se tiñen con Giemsa portaobjetos recién preparada durante 10 min. </li><li> Enjuague frotis de sangre con agua corriente durante 1 minuto, se deja secar al aire y examinar portaobjetos bajo el microscopio (100x, aceite de inmersión). Enumerar pRBC a 1.000 eritrocitos y calcular parasitemia por ciento. Los ratones donantes debería alcanzar los niveles de parasitemia entre 2.5-5% antes de que puedan ser sangrados para la infección de animales experimentales. </li><li> Recoger sangre del ratón donante por sangrado retro-orbital utilizando un heparinizada micro-hematocrito tubo capilar. Todos los experimentos se llevan a cabo de conformidad con el Walter y Eliza Hall Institute requisitos comité de ética animal. Dependiendo de las necesidades locales Animal Comité de Ética otros procedimientos sangrado puede ser utilizado. Disolver la cantidad necesaria de sangre en medio RPMI a una concentración final de 1x10 6 pRBC/0.2 ml. Considere la posibilidad de queun hematocrito normal de ratón es ~ 6x10 9 eritrocitos / ml 1. </li><li> Infect experimental C57BL / 6 ratones (8-12 semanas de edad) mediante la inyección por vía intraperitoneal (ip) 1x10 6 pRBC/0.2 ml. </li><li> Para controlar los niveles de parasitemia de ratones infectados siga los pasos 1.3-1.8. La parasitemia debe determinarse cada 2-3 días a partir del día 2 o 3 pi </li><li> El inicio de la malaria severa en C57BL / 6 ratones pueden manifestarse como apariencia encorvada, fallo de piel y baja actividad. Algunos ratones puede recuperar en esta etapa, pero la progresión de la pérdida de reflejo autoadrizable indica enfermedad irreversible y los animales deben ser sacrificados. </li></ol> 2. La perfusión intracardiaca de ratones y de extracción del cerebro <ol><li> Montar un sistema de perfusión manual de gravedad asegurando un depósito de 500 ml a un soporte de columna fijado a la parte superior de un soporte de columna de 60 cm. Conectar un tubo de plástico en el extremo inferior del depósito y garantizar una abrazadera de la tubería para controlar el flujo de tampón. Conecte el tubo a una aguja de 23 G. Fill hasta el depósito con PBS (mantenido a 22 ° C), abrir la abrazadera y permitir tampón para correr a través del tubo para eliminar todas las burbujas de aire. </li><li> P. eutanasia berghei ANKA-ratón infectado por inhalación de CO 2. Confirmar la muerte por la ausencia de pedal, orbital y las respuestas respiratorias. </li><li> Pin ratón sacrificados por las patas traseras y delanteras dorsalmente en un tablero de espuma de poliestireno disección contenida en una bandeja de plástico. Dependiendo de ética locales Animal Comité requisitos anestesia puede administrarse antes de comenzar pefusion intracardial. </li><li> Limpie lado ventral con 70% de etanol. </li><li> Con unas tijeras grandes y pinzas para abrir la piel a lo largo de la línea media para exponer la cavidad torácica. Del pliegue cutáneo y el pin a los lados. </li><li> Mantenga el esternón con unas pinzas finas y cortar el diafragma y a lo largo de ambos lados del esternón cortar las costillas. Tenga cuidado de no dañar los vasos sanguíneos grandes. </li><li> Pin de la caja torácica por el esternón libremente al lado de la cabeza. </li><li> Mantenga ingenio ventrículosh finas pinzas y el atrio derecho incisión cuidadosamente con unas tijeras finas. </li><li> Inserte la aguja 23G conectada al sistema de perfusión por gravedad en el ventrículo izquierdo hacia la aorta ascendente mientras PBS está en marcha. Inserte sólo 0,5 cm de la punta de la aguja. </li><li> Perfundir ratón durante 5 minutos o hasta que el efluente es clara. </li><li> Liberar ratón y lo pondré sobre su abdomen. Limpiar la cabeza con 70% de etanol. </li><li> Con unas tijeras grandes, haga un corte justo por encima del área de la médula espinal cervical. </li><li> El uso de tijeras finas para hacer una mediana caudal-rostral corte a partir de la base del cráneo y la cáscara de la piel para exponer el cráneo. </li><li> Sosteniendo la cabeza, colocar las hojas de una tijera pequeñas en cada cavidad orbital y realizar un corte entre las órbitas. </li><li> Haga un corte longitudinal a lo largo de la sutura sagital y retire con cuidado el cráneo en cada hemisferio del cerebro hacia el exterior. </li><li> Usando una espátula, levante suavemente el cerebro y lo coloca en un tubo de centrífuga de 10 ml que contenía medio RPMI. </li></ol>3. Aislamiento de Brain-secuestrados leucocitos (BSL) <ol><li> Trabajando en una cabina de seguridad, lugar recién cosechado cerebro en la parte superior de un filtro de acero inoxidable de células (40-60 tamaño de malla) en una placa de Petri que contenía 3-5 ml de medio de cultivo RPMI tejido. </li><li> Cortar el tejido cerebral en trozos pequeños. </li><li> Empuje pequeñas piezas de tejido cerebral a través del colador celular usando un émbolo de cristal. </li><li> Transferir homogeneizado de cerebro a un tubo de 10 ml y centrifugar a 250 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Disolver sedimento en 3 ml de medio RPMI, que contiene 0,05% de colagenasa D y 2U/ml DNAsa I. </li><li> Girar mezcla durante 30 min a temperatura ambiente. Eliminar los restos celulares por empujar la mezcla a través de un filtro de células de nylon 70 micras y / o mediante la incubación en hielo durante 5 min. </li><li> Lay homogeneizado de cerebro en un cojín 7 ml de Percoll al 30% y se centrifuga a 400 xg (sin frenos) durante 20 min a temperatura ambiente. </li><li> Resuspender el sedimento en 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos e incubar en hielo durante 5 min alisar pRBC adherente, que no puede ser eliminado desde el cerebro por perfusión intracardial. </li><li> Añadir 9 ml de medio RPMI, lavar las células y centrifugar a 250 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender el pellet que contiene BSL en 50-100 l de medio RPMI y las células de transferencia a un tubo Eppendorf. </li><li> Diluir una alícuota de 5-10 l de la muestra de células 1:2 en azul tripán para la identificación de células viables. </li><li> Contar las células viables bajo el microscopio utilizando un hemocitómetro. A partir del día 6 en adelante, cuando pi P. berghei ANKA de ratones infectados muestran signos neurológicos, 20.000-100.000 BSLs se puede recuperar. </li></ol> 4. Inmunofenotipificación de BSL por citometría de flujo multicolor <ol><li> Centrifugar las células a 250 xg durante 10 min a 4 ° C, aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 50 l de tampón de tinción (PBS, 1% de suero de ternera fetal (FCS), 2 mM de EDTA). </li><li> Añadir el 1 l de anticuerpo purificado anti-CD16/32 (Fcblock). </li><li> Se incuban las células durante 10 min en hielo. </li><li> Lavar las células con 1 ml de tampón de tinción. Centrifugar las células a 250 xg durante 10 min a 4 ° C y aspirar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en 50 l de tampón de tinción que contiene predeterminados diluciones óptimas requeridas de anticuerpos fluorescentes, es decir, anti-CD4, anti-CD8, anti-TCR y anti-NK1.1. </li><li> Incubar durante 1 hora en hielo. </li><li> Lavar las células con 1 ml de tampón de tinción. Centrifugar las células a 250 xg durante 10 min a 4 ° C y aspirar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en 100 l de PBS. </li><li> Transferir las células a un tubo de flujo plástico citometría. </li><li> El uso de un citómetro de flujo, obtener al menos 5,000-10,000 eventos. Adecuados controles de células no teñidas y muestras fluorocromo compensación deben ser incluidas como sea necesario. </li><li> Analizar los resultados utilizando el software apropiado citometría de flujo. </li></ol>

<ol><li>Brian de Souza, J., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+malaria%3A+the+contribution+of+studies+in+animal+models+to+our+understanding+of+immunopathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis.</a> Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).</li>
<li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nature. 5, 722-735 (2005).</li>
<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+basis+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li>
<li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 50(2012).</li>
<li>LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Brain-infiltrating+Leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes.</a> J. Vis. Exp. (52), e2747(2011).</li>
<li>Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus%3A+immunity+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">West Nile virus: immunity and pathogenesis.</a> Viruses. 3, 811-828 (2011).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+pathogenic+role+of+brain-sequestered+alphabeta+CD8%2B+T+cells+in+experimental+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).</li>
<li>Campanella, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+CXCR3+and+its+ligands+CXCL9+and+CXCL10+are+required+for+the+development+of+murine+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).</li>
<li>Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+stimulate+recruitment+of+CXCR3%2B+T+cells+to+the+brain+during+Plasmodium+berghei-mediated+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).</li>
<li>Amante, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+natural+regulatory+T+cells+in+the+pathogenesis+of+experimental+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria.</a> The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).</li>
<li>Nie, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP-10-mediated+T+cell+homing+promotes+cerebral+inflammation+over+splenic+immunity+to+malaria+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection.</a> PLoS pathogens. 5, e1000369(2009).</li>
<li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+malaria+parasite+sequestration%3A+CD36+is+the+major+receptor%2C+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).</li>
<li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8%2B+T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunololgy%22%5BJournal%5D)">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li>
<li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8%2B+T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens%2C+largely+regulated+by+CD8alpha%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El aislamiento y el análisis de BSL es un método que permite la caracterización y cuantificación de células inflamatorias que migran hacia el cerebro en respuesta a la lesión tisular o la infección en modelos experimentales de ratón. La introducción de un paso de perfusión intracardiaca para la retirada del compartimento de la sangre antes de la extracción de órganos y posterior aislamiento de las células es útil para prevenir la contaminación de células inflamatorias con no inflamatorias leucocitos circulantes. Esto pu...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Soluciones y tampones </td></tr><tr><td> Giemsa azur-eosina-azul de metileno solución </td><td> Merck Millipore </td><td> 1.09204.0500 </td><td> Dilución 1:10 en agua destilada </td></tr><tr><td> Medio RPMI </td><td></td><td></td><td> Ratón tonicidad </td></tr><tr><td> Ratón tonicidad PBS </td><td></td><td></td><td> 20 mM de fosfato de sodio, 0,149 de NaCl, pH 7,3 </td></tr><tr><td> 0,4% de azul de tripano </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T-8154 </td><td> Dilución 1:2 </td></tr><tr><td> La colagenasa D </td><td> Worthington Biochemical </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DeoxyribonuClease (DNasa) I </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D4263-5VL </td><td> De páncreas bovino </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> 30% solución en PBS </td></tr><tr><td> Ultrapura Tris </td><td> Invitrogen </td><td> 15505-020 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de amonio (NH 4 Cl) </td><td> AnalaR </td><td> 10017 </td><td></td></tr><tr><td> Red Cell Lysis Buffer </td><td></td><td></td><td> 17 mM Tris, 14nm NH 4 Cl, pH 7,2 </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Gibco </td><td> 1009 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA sal disódica </td><td> Merck </td><td> 10093.5V </td><td> 0,1 M, pH 7,2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Anticuerpos y conjugados </td></tr><tr><td> Anti-ratón CD16/CD32 (Fc Block), clon 2.4G2 </td><td> BD Pharmingen </td> &lt;td&gt; 553142 </td><td> 1 l en 50 l tampón de tinción (0.5mg/50 ml) </td></tr><tr><td> FITC-anti-ratón, clon CD4 H129.19 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553651 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-ratón NK1.1, clon PK136 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553165 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5-anti-ratón CD8, clon 53-6-7 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551162 </td><td></td></tr><tr><td> APC-anti-ratón TCR-β, clon H57-597 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553174 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-ratón de CXCR3, clon 220803 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> FAB1685P </td><td></td></tr><tr><td> Biotinilado anti-ratón de CCR5, clon C34-3448 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559922 </td><td></td></tr><tr><td> Estreptavidina-PerCP-Cy5.5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551419 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipos y materiales </td></tr><tr><td> SuperFrost portaobjetos de microscopio </td><td> Lomb Menzel-Gläser </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pinzas de disección, tijeras </td><td> REDA Instrumente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 ml de PBS reservorio </td><td> Nalgene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Caucho tubería </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Aguja 23G </td><td> BD PrecisionGlide </td><td> 302008 </td><td></td></tr><tr><td> Disociación celular kit que contiene metal tamiz </td><td> Sigma Aldrich </td><td> CD-1 </td><td></td></tr><tr><td> 70 micras filtro de células de nylon </td><td> BD Falcon </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocitómetro </td><td> Neubauer GmbH </td><td> 717810 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de citometría de flujo </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento y análisis de brain-secuestrados los leucocitos de<em&gt; plasmodium berghei</em&gt; anka de ratones infectados

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Se describe un método para el aislamiento y caracterización de células adherentes inflamatorias de los vasos sanguíneos cerebrales de P. berghei ANKA-ratones infectados. La infección de las cepas susceptibles de ratón con esta cepa del parásito en los resultados de la inducción de la malaria cerebral experimental, un síndrome neurológico que recapitula algunos aspectos importantes de Plasmodium falciparum mediada por paludismo grave en 1,2 seres humanos. Formas maduras de la malaria en etapa de sangre expresar proteínas parasitarias en la superficie de los eritrocitos infectados, lo que les permite unirse a las células endoteliales vasculares. Este proceso induce obstrucciones en el flujo sanguíneo, lo que resulta en hemorragias hipoxia y 3 y también estimula el reclutamiento de los leucocitos inflamatorios en el sitio de secuestro del parásito. A diferencia de otras infecciones, es decir, virus neutrotopic 4-6, ambas parasitados malaria-glóbulos rojos (pRBC) así como Inflamm asociadoAtory leucocitos permanecen secuestrados dentro de los vasos sanguíneos en lugar de infiltrar el parénquima cerebral. Así, para evitar la contaminación de los leucocitos secuestrados con no inflamatorias circulantes, células de perfusión intracardiaca extenso de los ratones infectados antes de la extracción de órganos y procesamiento de tejidos es necesario en este procedimiento para retirar el compartimento de la sangre. Después de la perfusión, los cerebros se cosechan y disecado en trozos pequeños. La estructura del tejido es más interrumpido por tratamiento enzimático con colagenasa D y DNAsa I. El homogeneizado cerebral resultante se centrifugó en un gradiente de Percoll que permite la separación de secuestrados cerebro-leucocitos (BSL) de la mielina y los residuos de otro tejido. Las células aisladas se lavan a continuación, se contaron usando un hemocitómetro y se tiñeron con anticuerpos fluorescentes para su posterior análisis por citometría de flujo. Este procedimiento permite la caracterización fenotípica completa de la migración de los leucocitos inflamatorios en el cerebro en rerespuesta a varios estímulos, incluyendo accidente cerebrovascular, así como infecciones víricas o parasitarias. El método también proporciona una herramienta útil para la evaluación de nuevos tratamientos anti-inflamatorios en modelos animales preclínicos.

Los resultados en la figura. 2 muestran porcentajes y números absolutos de las diferentes poblaciones BSL recuperados de los cerebros de los ratones control perfundidos o unperfused infectadas por la malaria e ingenuo. Aislado BSL fueron teñidas con PE-anti-NK1.1 y anticuerpos APC-anti-TCR-β como se indica en el texto del Protocolo. De acuerdo con resultados anteriores 7-9, αβTCR + células T comprende una elevada proporción de la piscina BSL en cerebros de perfundidos infectadas por la malaria rato...

Un método para el aislamiento de los leucocitos inflamatorios adherentes de los vasos sanguíneos cerebrales de los<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA de ratones infectados se describe. El método permite la cuantificación así como la caracterización fenotípica de los leucocitos aislados después de la tinción con anticuerpos fluorescentes y el posterior análisis por citometría de flujo.

Aislamiento y análisis de Brain-secuestrados Los leucocitos de<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA de ratones infectados

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar los leucocitos inflamatorios adherentes de los vasos sanguíneos cerebrales de ratones infectados con Plasmodium Burge Eye Anca para inducir malaria cerebral experimental. Los ratones se infectan con blastodium berge eye anca glóbulos rojos parasitados por inyección. Después de que los ratones comienzan a mostrar signos de enfermedad, las células circulantes de los ratones infectados con malaria se eliminan por perfusión intraoral.A continuación, se extraen los cerebros y el tejido se digiere con enzimas para permitir el aislamiento de los leucocitos inflamatorios. A continuación, se realiza una citometría de flujo multicolor para el inmunofenotipo. El análisis de los leucocitos secuestrados en el cerebro de los datos resultantes revela el porcentaje y el número absoluto de leucocitos que migran al cerebro de los ratones infectados con malaria.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la patogénesis de la malaria, como qué tipo de células inflamatorias migran al sitio de secuestro del parásito en el cerebro de los animales infectados en diferentes condiciones experimentales. La demostración visual de este método es fundamental. Los pasos de perfusión son difíciles de aprender, ya que requieren rapidez y cuidado para no dañar ningún vaso sanguíneo significativo. Leanna Mcic, una técnica en animales, la Sra. Victoria, Rick, estudiante de doctorado, y la Dra. Lisa Aez, postdoc de mi laboratorio, demostrarán algunas partes de este procedimiento.Comience este protocolo infectando a los ratones con p berge eye anca desfrost, una alícuota criopreservada de glóbulos rojos parasitados o pbcs de P berge eye anca permitiendo que alcance la temperatura ambiente. Retire a un ratón donante de ocho a 12 semanas de edad de su jaula y colóquelo en una estación de trabajo. Agarra el pescuezo entre el dedo índice y el pulgar.Dé la vuelta al ratón e inyecte de 100 a 200 microlitros de plasmodium berge eye en la cavidad peritoneal. Rutinariamente, se inyectan pbcs a dos ratones donantes. Después de inyectar, coloque a los ratones en su jaula cuatro o cinco días después de la infección.Retire un ratón donante de su jaula y colóquelo en una estación de trabajo. Coloque una gota de sangre de la vena de la cola del ratón cerca del extremo de un portaobjetos de microscopio extremo esmerilado. Coloque un segundo portaobjetos en un ángulo de 45 grados y vuelva a colocarlo en la gota de sangre.Una vez que la sangre se esparza a lo largo del borde, empuje el portaobjetos del esparcidor de manera uniforme a través del portaobjetos del microscopio para hacer que la sangre se manche. Deje que el frotis se seque al aire para fijar los frotis de sangre. Sumerja los portaobjetos en metanol al 100% durante 30 segundos.A continuación, tiñe los portaobjetos en GIM ZA recién preparado durante 10 minutos después de teñir con gim za, enjuague el portaobjetos con agua corriente durante 30 segundos. Deje que el portaobjetos se seque al aire, luego examínelo bajo el microscopio con la lente de inmersión en aceite de 100 x. Enumere el PRBC dentro de mil eritrocitos y calcule el porcentaje si el ratón donante ha alcanzado los niveles requeridos de 2.5 a 5%Parsit Recolectar sangre del ratón donante por punción cardíaca bajo anestesia o sangrado retroorbitario utilizando un tubo capilar de microhematocrito heparinizado.Disolver la sangre en medio RPMI a una concentración final de uno por 10 a los seis PRBC por 0,2 mililitros por ratón. Considere que un hematocrito normal de ratón es aproximadamente seis veces 10 por el noveno glóbulos rojos por mililitro. De hecho, el C 57 experimental de ocho a 12 semanas de edad mató a seis ratones inyectando una vez 10 al sexto PRBC en 0,2 mililitros intraperitoneales como antes.Para controlar los niveles de Para de ratones infectados, prepare un frotis de sangre como antes. La PARA debe determinarse cada dos o tres días a partir del segundo o tercer día después de la infección a partir del día cinco. Después de la infección en adelante.Los ratones son monitoreados diariamente para detectar signos de malaria grave una vez que los niveles de Para son superiores al 5% y los ratones muestran síntomas neurológicos alrededor del sexto día después de la infección. Los ratones infectados se sacrifican por inhalación de CO2 e inmediatamente se perfunden con PBS, como se describe en el documento adjunto. El aspecto más difícil de este procedimiento es la perfusión intracardíaca.Aquí se describen una serie de consejos para la solución de problemas: Con el ratón anclado en una tabla de disección de espuma de poliestireno. Dentro de una bandeja de disección. Limpie el lado ventral con etanol al 70%, luego use tijeras grandes y pinzas para abrir la piel a lo largo de la línea media para exponer la cavidad torácica, pliegue y sujete la piel con alfileres a los lados.Sujete el esternón con pinzas finas y corte el diafragma y a lo largo de ambos lados del esternón, cortando las costillas. Tenga cuidado de no dañar los vasos sanguíneos grandes. Sujeta la caja torácica por el esternón sin apretar junto a la cabeza.Sujete los ventrículos con pinzas finas y haga una incisión cuidadosa en la aurícula derecha con unas tijeras finas. Inserte la aguja de calibre 23 conectada al sistema de perfusión por gravedad en el ventrículo izquierdo hacia la aorta ascendente. Mientras PBS está funcionando, inserte solo 0,5 centímetros de la punta de la aguja para perfundir el mouse durante cinco minutos o hasta que el efluente esté limpio.Después de la perfusión interna, diseccione el cerebro y colóquelo en un tubo de centrífuga de 10 mililitros que contenga RPMI. Medio. Coloque el cerebro recién cosechado encima de un colador de celdas de acero inoxidable del tamaño de una malla de 40 a 60 en una placa de Petri que contenga de tres a cinco mililitros de medio de cultivo de tejidos RPMI. Corta el tejido cerebral en pedazos pequeños.Luego, con un émbolo de cristal, empuje pequeños trozos de tejido cerebral a través del filtro de células. Transfiera el homogeneizado cerebral a un tubo de 10 mililitros y centrifugue a 250 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después del centrifugado, deseche el sobrenadante y disuelva el pellet en tres mililitros de RPMI.Medio que contiene colagenasa D y ADN de cisne. Gire la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente. Elimine cualquier residuo de células empujando la mezcla a través de un colador de células de nailon de 70 micras.Luego incube en hielo durante cinco minutos después de la incubación en un tubo de 10 mililitros. Superponga cuidadosamente el homogeneizado del cerebro en una centrífuga de cojín de siete mililitros al 30% por llamada a 400 veces G durante 20 minutos a temperatura ambiente con el descanso. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de lisis de glóbulos rojos, tamponar e incubar en hielo durante cinco minutos.Para lisar las pbcs adherentes, que no se eliminan del cerebro por perfusión intraoral. Agregue nueve mililitros de celdas de lavado de medio RPMI y centrifugue a 250 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Resus suspende los leucocitos secuestrados en el cerebro o BSL que contienen pellets en 50 a 100 microlitros de medio RPMI y transfiere las células a un tubo de microcentrífuga, cuente las células viables bajo el microscopio utilizando un hemocitómetro y exclusión de azul de trian.Seis días después de la infección, se pueden recuperar de 20.000 a 100.000 BSL una vez que se han obtenido los recuentos de células viables. Las células se preparan para el análisis por citometría de flujo. Los detalles de este procedimiento se dan en el documento adjunto, pero se resumen aquí primero.Todas las células aisladas de cada cerebro se centrifugan en un tubo de microfuga de 1,5 mililitros y se resuspenden en un tampón de tinción con anticuerpos bloqueantes anti CD 16 y CD 32. Después de una incubación de 10 minutos en hielo, las células se lavan con tampón de tinción, se centrifugan nuevamente y se resuspenden en un tampón de tinción que contiene anticuerpos fluorescentes anti CD cuatro, anti CD ocho, anti TCR y anti NK 1.1. Las células se incuban en hielo durante una hora lavadas con tinción, tampón y centrífuga.Después del giro, las células se resuspenden en PBS y se adquieren al menos de 5.000 a 10.000 eventos en un citómetro de flujo. Los datos resultantes se analizan utilizando un software de citometría de flujo adecuado. Las poblaciones de BSL se recuperaron de cerebros de ratones de control perfundidos o perfundidos por la ONU, infectados con malaria y sin previo control, y se tiñeron con anticuerpos PE, anti NK 1.1 y un PC anti TCR beta.Estos diagramas de puntos muestran porcentajes de células NK, linfocitos T, células NK 1.1 positivas para TCR y células dobles negativas. NK 1.1 TCR negativo negativo en ratones de control perfundidos o no fusionados, infectados con malaria y sin alcohol, lo que concuerda con los hallazgos previos. Las células T alfa beta TCR positivas constituyeron una alta proporción de la reserva de BSL en los cerebros de ratones infectados con malaria perfundida en el sexto día después de la infección.Esta población parece estar significativamente infrarrepresentada en los cerebros de los animales no perfundidos. La aparente reducción de las frecuencias de células T en cerebros no perfundidos se asoció con un porcentaje y un número total considerablemente mayor de células dobles negativas en estos animales. No solo se detectó un alto porcentaje y número de células dobles negativas en cerebros no perfundidos en ratones infectados con malaria, sino también en controles naïf, lo que sugiere que estas células son leucocitos no inflamatorios presentes en los vasos sanguíneos del cerebro que se recuperan junto con las células inflamatorias si no se realiza la perfusión intracardíaca.Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar una amplia profusión intra cardio de ratones infectados antes de la extracción de órganos para evitar la contaminación de los leucocitos secuestrados con células circulantes no inflamatorias. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y analizar leucocitos secuestrados en el cerebro de ratones infectados con plasmodium virga mediante geometría fluida.

isolation-analysis-brain-sequestered-leukocytes-from-plasmodium

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Microscopia intravital para seguir los acontecimientos hemodinámicos e inflamatorios temporal y espacial en la microcirculación pial.

Microscopia intravital de la microcirculación del cerebro del ratón con una ventana craneal cerrado

Un método rápido para obtener la infiltración de leucocitos en el cerebro murino se describe. Este método utiliza un gradiente de Percoll continua y discontinua gradiente de Ficoll para seleccionar y purificar la capa de leucocitos enriquecido. Leucocitos aislados se puede caracterizar por las mediciones de citometría de flujo.

El aislamiento de la infiltración de leucocitos cerebro-

Este video muestra la generación de un modelo experimental de ratón de malaria cerebral. Los esporozoítos aislados de mosquitos hembra infectados con Plasmodium berghei se inyectan en las venas de la cola de un ratón restringido, lo que provoca la ruptura de la barrera hematoencefálica y la inflamación del cerebro, causando malaria cerebral. Este modelo de ratón infectado ofrece una valiosa herramienta para estudiar in vivo la patología microvascular asociada a la malaria cerebral.

Generación de un modelo murino de malaria cerebral experimental utilizando esporozoítos derivados de mosquitos huéspedes

Este video muestra un ensayo para inmunizar un modelo de ratón con esporozoítos vivos atenuados. Los esporozoítos de Plasmodium atenuados por radiación se inyectan en la cara dorsal de la oreja del ratón. Después de las inyecciones en múltiples ubicaciones en ambos oídos, se permite que el ratón se recupere.

Inmunización intradérmica con esporozoítos vivos atenuados en un modelo de ratón

Describimos aquí un protocolo para aislar células mieloides de la piel del ratón y drenar el ganglio linfático después de la inyección intradérmica de esporozoítos de Plasmodium. La citometría de flujo de las células recolectadas proporciona un ensayo confiable para caracterizar la respuesta inflamatoria de la piel y los ganglios linfáticos de drenaje al parásito.

El aislamiento de las células mieloides de ratón de la piel y el drenaje de ganglios linfáticos Siguiendo intradérmica La inmunización con viva atenuada<em&gt; Plasmodium</emLos esporozoitos&gt;

Describimos un modelo de ratón de malaria cerebral experimental y mostramos cómo se puede rastrear la patología inflamatoria y microvascular in vivo utilizando imágenes de resonancia magnética.

Seguimiento In Vivo del Desarrollo del Edema y Patología Microvascular en un Modelo de Malaria Cerebral Experimental usando Imágenes de Resonancia Magnética

Debido a las sorprendentes similitudes del ciclo de vida y la biología de los parásitos del paludismo de roedores con los parásitos del paludismo humano, los modelos de malaria de roedores se han vuelto indispensables para la investigación del paludismo. En este documento, estandarizamos algunas de las técnicas más importantes utilizadas en el análisis fenotípico de especies de malaria de roedores de tipo salvaje y transgénico.

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El objetivo general de este protocolo es instruir cómo extraer, mantener y disociar las células de astrocitos murinoy y microglia del sistema nervioso central, seguida de una infección con parásitos protozoos.

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La malaria se transmite a través de la inoculación de la etapa de esporozoíto de Plasmodium por mosquitos infectados. El Plasmodium transgénico nos ha permitido comprender mejor la biología de la malaria y ha contribuido directamente a los esfuerzos de desarrollo de vacunas contra la malaria. En este trabajo se describe una metodología simplificada para generar esporozoítos transgénicos de Plasmodium berghei .

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Hasta la fecha, los protocolos para el aislamiento simultáneo de todos los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central del mismo ratón son una demanda insatisfecha. El protocolo muestra un procedimiento aplicable en ratones con encefalomielitis autoinmune naïve y experimental para investigar redes celulares complejas durante la neuroinflamación y, al mismo tiempo, reducir el número de ratones requerido.

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El desarrollo sexual del Plasmodium ocurre en el intestino medio del mosquito. Dirigirse a las etapas sexuales del parásito es una estrategia prometedora para bloquear la transmisión. Desarrollamos Ookluc, un P. berghei transgénico que expresa nanoluciferasa después de la formación del cigoto, lo que permite el cribado de alto rendimiento de compuestos que bloquean la transmisión. En este artículo se detallan los métodos de cribado con Ookluc.

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Aprende a aislar leucocitos inflamatorios adherentes de vasos sanguíneos cerebrales en ratones infectados con Plasmodium berghei ANKA. Este método permite cuantificar y caracterizar estas células mediante citometría de flujo multicolor para estudiar la patogénesis de la malaria cerebral experimental.

Aislamiento y análisis de Brain-secuestrados Los leucocitos de

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