Sola célula Medidas de Ruptura Vacuolar causadas por patógenos intracelulares

Este experimento monitorea la ruptura de VA provocada por patógenos intracelulares en células individuales. Primero cargue las celdas con tinte CCF 4:00 AM, que es escindido por las esterasas celulares. A continuación, prepare y aplique las neurobacterias FL al CCF, cuatro células cargadas incuban las células a 37 grados centígrados para la invasión bacteriana de las células huésped.

A continuación, determine la relación de intensidades emitidas en los canales de 450 nanómetros y 535 nanómetros. Los resultados muestran la presencia de patógenos en el citosol debido a su adaptabilidad a materiales de alto rendimiento. Esta técnica facilita la identificación de nuevos antibióticos al abordar un problema clave de la localización subcelular de las bacterias durante las interacciones entre patógenos del huésped.

Junto con mi colega Tran Vanu, estábamos interesados en desarrollar enfoques para observar patógenos intracelulares con alta resolución temporal. Esto condujo al establecimiento del ensayo de ruptura regular de cuatro betalactamasas CCF. Hoy, este enfoque será presentado experimentalmente por dos estudiantes graduados en el laboratorio, Nora MellU y Charlotte Keller. Inocular las cepas bacterianas de tipo salvaje y mutantes en ocho mililitros de TCSB que contienen 50 microgramos por mililitro de ampicilina, coloque los cultivos en un agitador a 37 grados centígrados, ahora siembra cinco veces 10 a la tercera células hela por pocillo.

En 100 microlitros de DMEM que contienen 10% de suero de ternero fetal, 1% de penicilina estreptomicina de cultivo, las células en una incubadora de dióxido de carbono al día siguiente subcultivan las bacterias en una dilución de 100 en TCSB suplementada con 50 microgramos por mililitro de ampicilina crecen en un agitador a 37 grados centígrados durante dos horas y media. Ahora, para cargar las celdas de hela, prepare CCF 4:00 AM con tinte en tampón em, lave las celdas una vez con PBS. Luego agregue 25 microlitros de CCF 4:00 AM cargando la mezcla por pocillo a temperatura ambiente en la oscuridad durante dos horas y 30 minutos para preparar las bacterias para la infección, pellet un mililitro de cultivo por centrifugación después de un lavado con 500 microlitros de PBS Resus, suspenda las bacterias en 500 microlitros de PBS suplementado con 10 microgramos por mililitro de poliol lisina y 40 microgramos por mililitro de betalactamasa.

Incubar durante 10 en una rueda giratoria a temperatura ambiente, luego lavar una vez con 500 microlitros de PBS y volver a suspender cada gránulo bacteriano en 500 microlitros de un milimolar de Probenecid en tampón EM, lavar las células una vez con 150 microlitros de un milimolar prob en tampón EM. A continuación, diluya 10 microlitros de bacterias en 100 microlitros de una solución de sonda milimolar y distribúyala a cada pocillo de células hela. Después de 15 minutos de incubación en la oscuridad a temperatura ambiente, transfiera la placa a 37 grados centígrados durante una hora.

Lavar una vez con 150 microlitros de una solución probit milimolar. A continuación, fije las muestras con 50 microlitros de aldehído paraforme al 4% en una solución Pro milimolar durante 10 minutos en la oscuridad Después de un lavado con solución de Probenecid, agregue 30 microlitros de colorante nuclear de 10 micromolares drac five para una segmentación celular óptima. Incubar las células durante 30 minutos, lavar una vez y añadir 100 microlitros de una solución milimolar para obtener imágenes utilizando un microscopio de epifluorescencia invertida.

Utilice una longitud de onda de excitación de 405 nanómetros. Detecte la emisión a través de filtros de 450 nanómetros y 535 nanómetros utilizando tiempos de exposición de cinco milisegundos para la luz transmitida. 1000 milisegundos para 535 nanómetros y 500 milisegundos para 450 nanómetros.

El uso de un dispositivo de calibración de enfoque acoplado a la microscopía automatizada permite la adquisición simultánea de docenas de posiciones diferentes en múltiples pocillos. Si utiliza un microscopio confocal, utilice tiempos de exposición de 240 milisegundos a 450 nanómetros, de 360 milisegundos a 535 nanómetros para el láser de 405 nanómetros y de 640 milisegundos para el láser de 640 nanómetros. Analice los datos mediante un algoritmo informático que permite la puntuación automatizada de la señal fluorescente para cada célula individual.

Por ejemplo, utilice software como metamorph y acapella para crear un script para medir la relación entre las señales de emisión de 450 nanómetros y 535 nanómetros. Para este ensayo, inicie un cultivo de HELOC con dos veces 10 a la quinta célula en un volumen final de dos mililitros. Prepare las bacterias para la infección y cargue las células hela con CCF 4:00 AM Coloque un microscopio convo con un objetivo de aire de plan N dentro de una cámara de calentamiento de 37 grados Celsius.

Configure el láser de 405 nanómetros y la emisión a través de filtros de 450 nanómetros y 535 nanómetros. Introduzca también tiempos de exposición de cinco milisegundos para la luz transmitida. 200 milisegundos para 535 nanómetros y 100 milisegundos para 450 nanómetros.

Establezca la adquisición de datos cada 90 segundos durante 60 minutos. Ahora lave las células una vez con dos mililitros de una solución de Probenecid milimolar. Agregue dos mililitros de un milímetro en el tampón em.

Luego monte el plato en la platina del microscopio y comience la adquisición después de seis minutos. Ponga la adquisición en espera. Agregue 250 microlitros de resuspensión de bacterias en la parte superior de las células y reinicie la adquisición para el análisis posterior a la adquisición.

Visualice películas utilizando Velocity metamorph o image J.Obtenga proporciones de intensidad de 450 a 535 nanómetros para cada celda individual. El enfoque de betalactamasas CCF 4:00 AM es un método robusto y sensible para rastrear la ruptura ular de patógenos intracelulares como el gel flexneri tras la infección de células HELOC. Con la cepa no invasiva BS 176 AFA una cepa durante una hora, la sonda de cuatro trastes CCF permanece intacta y emite una señal verde.

Por el contrario, la deformación virulenta M 90 TFA I cambia la señal hacia el azul consistente con la división de la sonda en el citosol para la determinación de la señal métrica de relación. Desarrollamos un script para el software metamorph y acapella para automatizar la detección de las células y las mediciones en los canales de 535 y 450 nanómetros. Los núcleos y citosoles de las células se segmentan utilizando el canal DR cinco.

Entonces, el algoritmo es capaz de detectar y cuantificar las poblaciones de células positivas de 450 nanómetros y 535 nanómetros. Las proporciones medias calculadas son bajas para la cepa mutante y altas para la cepa virulenta. Los experimentos se pueden realizar en diferentes tipos de células humanas, como las células epiteliales de Gila y las células similares a los macrófagos.

Ambos tipos de células responden a la virulenta cepa M 90 T AFA one cha cambiando la señal emitida de verde a azul durante la infección. Con la cepa no invasiva, la señal verde persiste en la cuantificación utilizando un script desarrollado en el software metamorph y una macro desarrollada en Excel presenta histogramas de ruptura ular en función de la distribución celular. El método se puede adaptar con éxito para comprender la infectividad de diferentes bacterias.

Por ejemplo, este conjunto de datos muestra mycobacterium Bovis. BCG reside en el fagosoma durante todo el curso del experimento, como lo muestra la señal verde persistente. Por el contrario, Mycobacterium tuberculosis provoca la ruptura de la membrana vaga omal en los macrófagos THP uno después de siete días de infección, como lo demuestra la aparición de una señal de 450 nanómetros después de siete días de infección utilizando el mismo algoritmo.

En cuanto al estudio de la ruptura valar por Ella, encontramos que las células infectadas con Mycobacterium tuberculosis muestran proporciones más altas de 450 a 535 nanómetros que Mycobacterium bovis BCG después de siete días de infección. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar la ruptura ular por patógenos con el ensayo CCL de cuatro betalactamasas Una vez dominado, este protocolo se puede realizar en cuatro horas, pero recuerde que debe agregar proce en cada tampón durante todo el protocolo. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la microscopía electrónica o el fraccionamiento de membranas, es que se puede realizar en tiempo real sin ningún tratamiento bioquímico.

Se pueden realizar análisis adicionales, como el marcaje de actina o el ensayo de protección con gentamicina, para evaluar la absorción y la proliferación de las bacterias en las células huésped.