Name: La electroporación del Rombencéfalo trazar trayectorias axonal y metas sinápticas en el embrión de pollo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Aprende a marcar neuronas específicas en el rombencéfalo de embrión de pollo mediante electroporación para trazar trayectorias axonales y conexiones sinápticas. Este método permite estudiar el desarrollo de redes neuronales en neurobiología del desarrollo.

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<p class="jove_content"&gt; Agradecemos al Dr. Yuval Gottlieb-Dror para la ilustración de la electroporación. Este trabajo fue apoyado por becas a DSD de El Instituto Nacional de Psicobiología en Israel y en el programa de cooperación Niedersachsen-Israel Investigación y de subvenciones a AK de la Fundación Ciencias de Israel, el Ministerio de Salud de Israel, y el Centro del Patrimonio Excelencia-Legacy asociación Ciencias Biomédicas.</p&gt;

1. La electroporación Rombencéfalo 1.1 Manejo de Huevos <ol><li> Coloque los huevos horizontalmente en un incubador humidificado (37-38.5 ° C). Los embriones son electroporación después de 65-70 horas de incubación, cuando alcanzan 16-17 (HH) etapa (25-30 somitas). </li><li> Eliminar los huevos de la incubadora, sino que permanecen en la posición horizontal. </li></ol> 1.2 Preparativos <ol><li> Tire de capilares de vidrio (0,5 mm de diámetro). </li><li> Conectar dobladas en forma de L de oro Genetrodes electrodos (3 mm de diámetro) con un soporte del adaptador para el generador de impulsos. Electroporación parámetros incluyen 25 voltios, 5 números de impulsos, 45 ms de longitud de pulso, los intervalos de 300 ms de pulso. </li><li> Preparar una pipeta de boca, 10 ml de aguja de la jeringa, tiras de parafilm, un cepillo suave, unas tijeras de disección afilados y 25 ml de solución de PBS estéril. Esta cantidad es por lo general suficiente para manejar una bandeja de huevos (18 huevos). </li><li> Preparar una mezcla adecuada de los plásmidos de ADN (5 g / l cada uno) yañadir alrededor de 0,025% de colorante verde rápido para visualizar la inyección de ADN. Por lo general, un volumen de 4 l es suficiente para la inyección de una bandeja. </li></ol> 1.3 de ventanas, de inyección y electroporación <ol><li> Limpie las cáscaras de huevo con etanol al 70%. </li><li> Manejar un huevo a la vez para minimizar el tiempo de exposición al aire embrionaria. </li><li> Hacer un agujero en el polo de huevo con los extremos tijeras y retire 3-4 ml de albúmina con la jeringa. No extraiga la mayor cantidad de albúmina, ya que reduce la viabilidad. </li><li> Abra una ventana oval pequeño (2,5 x 2 cm de grosor) en el centro superior de la cáscara de huevo con las tijeras de disección. </li><li> Por goteo unas gotas de PBS en la parte superior del embrión para evitar la sequedad durante todo el proceso. </li><li> Cargar una pequeña cantidad de la mezcla de ADN en el capilar de vidrio usando una pipeta de boca. </li><li> Coloque el embrión con su extremo posterior hacia usted. No se requiere la inyección de tinta en esta etapa el embrión es claramente visible. Evitar el aumento de inyección de tintasupervivencia embrionaria. Penetrar en el cerebro posterior caudal mediante la celebración de los capilares en el ~ 45 °. No retire cualquier membrana de todo el embrión. Inyectar solución de ADN con cuidado en el lumen cerebro posterior y exhalar sin que se formen burbujas de aire. Solución de ADN se extiende hacia delante. </li><li> Inmediatamente después de la inyección de ADN, coloque los electrodos paralelos a la AP precisa y DV posición rombencéfalo tu objetivo es orientar la campaña. Empuje los electrodos ligeramente ventralmente sin tocar el corazón, ya que puede reducir la viabilidad. Pulso del electroporador. Los electrodos deben estar cubiertos con burbujas para indicar la conductividad eléctrica (Figura 1A). </li><li> Retire con cuidado los electrodos y gotear unas gotas de PBS para enfriar el embrión y para eliminar las burbujas. Selle el orificio correctamente con una tira de parafina para evitar que se sequen durante la incubación de los huevos. Lave los electrodos en PBS con un cepillo suave. </li><li> Coloque huevo en la incubadora durante el período de tiempo deseado. La supervivencia de los embriones es de aproximadamente 90% después de 2-3 díaselectroporación, y reduce hasta el 50% 12 días después de la electroporación. </li></ol> 2. Análisis de embriones 2.1 La elaboración del plano de montaje e inmunofluorescencia <ol><li> Preparaciones plana de montaje de la parte posterior del cerebro se pueden realizar hasta E6.5 para visualizar fácilmente los axones bajo un microscopio o un estereomicroscopio. </li><li> Diseccionar el embrión cuidadosamente por lo separa de membranas que rodean y los vasos sanguíneos. Coloque el embrión en una pequeña silicona - placa de Petri recubierto que contiene PBS. Conecte el embrión al plato con alfileres de tungsteno enfrenta dorsal. Realice una hendidura dorsal en el cerebro posterior en el techo placa con fuerte capilares de vidrio. </li><li> Con ayuda de pinzas cortantes y micro-tijeras sujetar la parte superior de la cabeza y tirar del tejido de cerebro posterior muy cuidadosamente de rostral a caudal. Después de la separación de la parte posterior del cerebro eliminar los tejidos ventrales restantes para alcanzar una preparación limpia. </li><li> Incubar el cerebro posterior con 4% De solución de paraformaldehído (PFA) para 1-2 hr a temperatura ambiente (RT). Lavar el cerebro posterior con PBT (PBS/0.1% de Triton X-100) para eliminar PFA. </li><li> Por inmunofluorescencia en hindbrains-montados plana añadir 500 l de solución de bloqueo (5% de suero de cabra en PBT y se incuba durante 2 horas a RT Incubar con 1 pt de anticuerpo ON a 4 ° C. Lavar con PBT (15 min x 3). Incubar con 2 ª anticuerpo durante 2 horas a TA. Lavar con PBT (15 min x 3). </li><li> Coloque el cerebro posterior frente dorsalmente en un portaobjetos de vidrio. Añadir medio de montaje fluorescentes en la parte posterior del cerebro. Usa capilares de vidrio o agujas de tungsteno para aplanar la parte posterior del cerebro en la diapositiva. </li><li> Añadir pequeña cantidad de grasa en cada esquina para evitar exprimir del tejido por la hoja de la cubierta. Con cuidado, coloque una hoja de cubierta en la parte superior de la parte posterior del cerebro y evitar burbujas de aire. Para añadir la adhesión esmalte de uñas para cubrir los bordes del vidrio. </li></ol> 2.2 Cryo-secciones e inmunofluorescencia <ol><li> Cryo-secciones del tronco cerebral can llevarse a cabo en cualquier etapa de visualizar las trayectorias axonales. Sin embargo, después de E6.5 este debe ser el método preferido debido a la dificultad para visualizar los axones en el embrión de montaje plana, que se convierte en demasiado grueso. Por otra parte, la demostración de las sinapsis requiere la sección del tejido y una vista de gran aumento bajo un microscopio. </li><li> Disección del embrión y eliminar todos los tejidos circundantes. Lavar con PBS. Cortar el embrión en la parte caudal de la médula mediante micro-tijeras y pinzas cortantes. Hacer una amplia incisión entre el cerebelo y el cerebro medio y retirar todo el tronco cerebral. El tejido debe contener el bulbo raquídeo, la protuberancia y el cerebelo. </li><li> Fijar el tronco cerebral en PFA al 4% durante toda la noche (ON) a 4 ° C, enjuague con PBS (3 x 10 min), y se incuba con 30% de sacarosa para ON a 4 ° C hasta que se hunde. </li><li> Insertar el cerebro posterior en un molde con la crio-compuesto OCT (temperatura óptima de corte), y colocarlo a -20 ° C hasta su congelación, tal como se describe en otro lugar 11. </li><li&gt; Coloque el bloque de octubre en el criostato en el eje transversal deseada. Ancho de sección es de 12 micras. </li><li> Secar los portaobjetos. Añadir 100 l de solución de bloqueo en cada portaobjetos durante 2 h a TA. Añadir 100 l de anticuerpos (diluido en la solución de bloqueo a la concentración deseada). El período de incubación de 1 ª y 2 ª anticuerpos está encendido a 4 ° C o 2 horas a temperatura ambiente, respectivamente. Para cada tiempo de incubación, añadir con cuidado tira de parafina en la parte superior de la corredera para evitar la sequedad. Lavar con PBS (10 min x 3) entre los anticuerpos. Si es necesario, añadir 1:1000 DAPI (4&#39;-6-diamidino-2-fenilindol), diluido en PBS durante 20 min a TA. Lavar con PBS. </li><li> Coloque el portaobjetos con medio de montaje fluorescentes. Deje que se seque durante 1 hora antes de su análisis. </li></ol>

<ol><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+precerebellar+nuclei+in+the+rat%3A+II.+The+intramural+olivary+migratory+stream+and+the+neurogenetic+organization+of+the+inferior+olive%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive.</a> J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).</li>
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<li>Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+hodological+and+cytoarchitectonic+organization+in+the+vestibular+complex+of+the+11-day+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo.</a> J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).</li>
<li>Marin, F., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+fate+of+rhombomeres+in+quail%2Fchick+chimeras%3A+a+segmental+analysis+of+hindbrain+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei.</a> Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; No hay conflictos de interés declarado.</p

En electroporación in ovo es una herramienta viable, fiable y eficaz para examinar especificación de las células y la guía axonal durante el desarrollo del sistema nervioso polluelo 20. En este protocolo se describe un modo de electroporación en el cerebro posterior chica en E2.75 utilizando elementos potenciadores que permiten el etiquetado condicional de interneuronas específicos. Esta estrategia se combina con el sistema de transposición mediada por PiggyBac para insertar genes extraños e...

El cerebro posterior representa un concentrador relé clave del sistema nervioso mediante la comunicación entre los sistemas nerviosos central y periférico por medio de ascendente y descendente redes neuronales. Regula las funciones básicas como la respiración, la conciencia, el oído y la coordinación motora 1-3. Durante el desarrollo embrionario temprano, la parte posterior del cerebro de vertebrados se subdivide transitoriamente a lo largo de su eje antero-posterior (AP) en rhombomeres repetitivas, en las que se forman distintos tipos de células neuronales y generan múltiples centros de los núcleos del tronco cerebral 4. El cerebro posterior también se divide a lo largo de su eje dorsal-ventral (DV) en una placa basal y alar, en la que los progenitores neuronales discretas se especifican y se diferencian en lugares distintos DV 3,5,6. Como a principios del AP y DV-específicos patrones neuronales se rige el establecimiento de circuitería tronco cerebral funcional es en gran parte desconocida. Para adquirir conocimientos sobre este fundamentalcuestión, se requieren herramientas para etiquetar subconjuntos específicos de neuronas en el cerebro posterior y principios para trazar su trayectoria axonal y la conectividad en las etapas más avanzadas. Hemos utilizado previamente elementos específicos potenciador, y un sistema de expresión condicional Cre / loxP basada para el seguimiento de la trayectoria axonal de interneuronas espinales dorsales en el embrión de pollo temprano 7-9. En el manuscrito actual se ha centrado en el cerebro posterior y mejorado el paradigma experimental para etiquetar finales interneuronas rombencéfalo embrionarias, axones y sus objetivos sinápticas, mediante una estrategia de electroporación modificado y el PiggyBac - Adaptación de ADN mediada. Nuestra nueva estrategia permite que el etiquetado de los subtipos neuronales distintas en un lado del cerebro posterior y el seguimiento de sus proyecciones axonales y sitios sinápticos en las diversas etapas embrionarias, desde 2 hasta 12 días después de la electroporación. En base a este método, se calificó el dorsal más subgrupo de interneuronas del cerebro posterior (dA1/Atoh1 + </sa&gt; las células) y reveló dos patrones de proyección axonal ascendentes contralaterales, cada uno deriva de una ubicación AP diferente y se alarga en un funiculus distinta. DA1 axones se encontraron para formar sinapsis en los núcleos auditivos, cerebro medio y en múltiples capas del cerebelo 10 proyecto. La combinación de polluelo de la electroporación, el rastreo genético de las neuronas y el análisis de los sitios de proyección en una fase mucho más avanzadas de desarrollo proporciona una plataforma única para estudiar la formación de redes neuronales en el cerebro y para dilucidar los mecanismos moleculares que gobiernan la formación de circuito.

<table><tbody><tr><td>Electrodos Genetrodes de oro en forma de L de 3 mm</td><td>BTX, Harvard Apparatus</td><td>45-0162</td><td></td></tr><tr><td>generador de impulsos, ECM 830</td><td>BTX, Harvard Apparatus</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>OCT (Temperatura óptima de corte)</td><td>Compound Tissue-Tek Sakura</td><td>4583 O.C.T. Esmalte</td> de uñas compuesto <td></td></tr><tr><td></td><td>de cualquier proveedor comercial</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la electroporación del rombencéfalo trazar trayectorias axonal y metas sinápticas en el embrión de pollo

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

La electroporación del tubo neural de embriones de pollo tiene muchas ventajas tales como ser rápida y eficiente para la expresión de genes extraños en células neuronales. En este manuscrito se proporciona un método que demuestra cómo única para electroporar ADN en el cerebro posterior aviar en E2.75 con el fin de etiquetar específicamente un subconjunto de células progenitoras neuronales, y cómo seguir sus proyecciones axonales y metas sinápticas en una fase mucho más avanzada de desarrollo, hasta E14.5. Hemos utilizado herramientas genéticas nuevas que incluyen elementos específicos potenciadoras, Cre / Lox - plásmidos basados ​​y el sistema de transposición de ADN PiggyBac mediada para dirigir la expresión de GFP en un subtipo de células del cerebro posterior (dorsal más subgrupo de interneuronas, DA1). Trayectorias y objetivos de DA1 axonal axones se siguen en las etapas embrionarias tempranas y tardías en varias regiones del tronco cerebral. Esta estrategia contribuye con técnicas avanzadas para atacar a las células de interés en la parte posterior del cerebro embrionario y de tracing formación circuito en múltiples etapas de desarrollo.

Este protocolo fue utilizado recientemente para descubrir los patrones axonal y sitios de proyección de DA1 subgrupo de interneuronas en el cerebro posterior chica 10. Para etiquetar específicamente estos axones, se confirmó un elemento potenciador (Atoh1), que anteriormente ha sido caracterizado como específico para las neuronas espinales ED1 8,12,13, que se expresa en las células del cerebro posterior 10 DA1. El elemento fue clonado aguas arriba de la recombinasa Cre y co-electroporaci...

¿Cómo las redes neuronales se establecen en el cerebro embrionario es una cuestión fundamental en la neurobiología del desarrollo. Aquí hemos combinado una técnica de electroporación con herramientas genéticas novedosas, tales como Cre / Lox-plásmidos y el sistema de transposición de ADN PiggyBac mediada por el cerebro posterior aviar para etiquetar interneuronas dorsal y seguimiento de sus proyecciones axonales y metas sinápticas en las diversas etapas de desarrollo.

La electroporación del Rombencéfalo trazar trayectorias axonal y metas sinápticas en el embrión de pollo

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

El objetivo general de este procedimiento es etiquetar subconjuntos específicos de neuronas en el cerebro posterior del pollito y rastrear sus trayectorias axonales y objetivos. Esto se logra abriendo primero una pequeña ventana ovalada en el centro de un día embrionario.2.75. Los plásmidos de ADN del óvulo siguiente se inyectan en la luz encefálica posterior.A continuación, el cerebro posterior se electropora unilateralmente para permitir la expresión de las construcciones en el grupo neuronal deseado y se incuban los huevos. Finalmente, se disecciona el tronco encefálico de todo el embrión para su preparación en montaje plano o corte de tejido. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran proyecciones axonales y dianas sinápticas en el dorso, la cerebrona y el cerebelo en diversas etapas de desarrollo mediante tinción inmunofluorescente y análisis de microscopía.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología del desarrollo, como la forma en que células neuronales específicas proyectan sus axones y forman conexiones sinápticas durante el desarrollo embrionario. Para prepararse para la electroporación, incube a 37 a 38 grados

electroporation-hindbrain-to-trace-axonal-trajectories-synaptic

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Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

De pollo en la electroporación in ovo es una técnica que permite la manipulación genética del embrión aviar. Las aplicaciones más comunes de esta técnica incluyen el análisis funcional de los genes y la posible potenciador de los elementos. Este video muestra la electroporación del tubo neural en embriones de pollo HH 10. Técnica de inyección y la adecuada manipulación de los huevos se discuten.

En Electroporations Ovo de embriones de pollo HH Etapa 10

Este video muestra la forma de visualizar las vías axonales de grupos genéticamente definidos de neuronas en la médula espinal de embriones de pollo que...

Descifrar Caminos axonal de los grupos definidos genéticamente las neuronas en el tubo neural del polluelo Utilizando In ovo La electroporación

En el útero de la electroporación permite la entrega rápida de genes en un espacio-temporal y controlado de manera en el desarrollo del sistema nervioso central (SNC). Aquí se describe una muy adaptable en el protocolo de electroporación in utero que puede ser utilizado para entregar las construcciones de expresión en múltiples dominios del SNC embrionario, incluyendo el telencéfalo, diencéfalo y la retina.

Entrega génica eficaz en los territorios del SNC múltiples utilizando In Utero La electroporación

Un método de transferencia de genes en el cerebro del ratón en desarrollo se describe mediante el uso de un método único quirúrgica y la forma especial de los electrodos. Esta técnica única permite la transfección de ADN de plásmido temporal y espacialmente, lo que ayudará a muchos neurocientíficos en el estudio de desarrollo del cerebro.

Del ratón en el útero de electroporación: Transefection controlada Gene espacio-temporal

Para evaluar la función y la regulación de los genes durante el desarrollo de las neuronas del cerebro medio dopaminérgico, se describe un método que consiste...

En electroporación in ovo en el mesencéfalo polluelo para estudiar la función génica en el desarrollo neuronal dopaminérgica

Un método por el cual la expresión de genes en el tubo neural puede ser regulada hacia abajo en un tipo de células específicas, de manera detectable se describe. Demostramos...

En electroporación in ovo de base miARN plásmidos en el tubo neural en desarrollo y evaluación de fenotipos por inyección de Dil en los preparativos libro abierto

Las neuronas auditivas del tronco encefálico de aves y mamíferos están especializadas en la codificación neural rápida, un proceso fundamental para las funciones auditivas normales. Estas neuronas surgen de precursores distintos de embriones hindbrain. Presentamos técnicas que utilizan electroporación para expresar genes en el cerebro posterior de embriones de pollo para estudiar la función génica durante el desarrollo auditivo.

En Ovo electroporación en el tronco encefálico auditivo del pollo

Describimos los métodos de etiquetado fluorescente tangencial migrar las células por electroporación y para Time-lapse de imágenes del movimiento celular marcada en una cultura de plano-montaje para visualizar migración celular comportamiento en El tectum óptico de chick en desarrollo .

Visualización de la migración celular tangencial en el Tectum óptico de Chick en desarrollo

La electroporación doble en el útero permite apuntar a las poblaciones celulares que están separadas espacial y temporalmente. Esta técnica es útil para visualizar las interacciones entre las poblaciones celulares que utilizan proteínas fluorescentes en condiciones normales, pero también después de experimentos funcionales para perturbar los genes de interés.

Doble en electroporación de utero para apuntar a poblaciones celulares separadas temporal y espacialmente

El pollito es un organismo modelo rentable, accesible y ampliamente disponible para una variedad de estudios. Aquí, se detalla una serie de protocolos para comprender los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo y la regeneración del oído interno aviar.

Métodos In Ovo y Ex Ovo para estudiar el desarrollo del oído interno aviar

Aprende a marcar neuronas específicas en el rombencéfalo de embrión de pollo mediante electroporación para trazar trayectorias axonales y conexiones sinápticas. Este método permite estudiar el desarrollo de redes neuronales en neurobiología del desarrollo.

La electroporación del Rombencéfalo trazar trayectorias axonal y metas sinápticas en el embrión de pollo

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