La electroporación del Rombencéfalo trazar trayectorias axonal y metas sinápticas en el embrión de pollo

El objetivo general de este procedimiento es etiquetar subconjuntos específicos de neuronas en el cerebro posterior del pollito y rastrear sus trayectorias axonales y objetivos. Esto se logra abriendo primero una pequeña ventana ovalada en el centro de un día embrionario.2.75. Los plásmidos de ADN del óvulo siguiente se inyectan en la luz encefálica posterior.

A continuación, el cerebro posterior se electropora unilateralmente para permitir la expresión de las construcciones en el grupo neuronal deseado y se incuban los huevos. Finalmente, se disecciona el tronco encefálico de todo el embrión para su preparación en montaje plano o corte de tejido. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran proyecciones axonales y dianas sinápticas en el dorso, la cerebrona y el cerebelo en diversas etapas de desarrollo mediante tinción inmunofluorescente y análisis de microscopía.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología del desarrollo, como la forma en que células neuronales específicas proyectan sus axones y forman conexiones sinápticas durante el desarrollo embrionario. Para prepararse para la electroporación, incube a 37 a 38 grados y medio centígrados durante 65 a 70 horas hasta que alcancen la etapa 16 a 17. Mientras los huevos se incuban, los capilares de vidrio de tracción conectan electrodos de oro doblados en forma de L con un soporte adaptador al narrador de pulsos.

Ajuste los parámetros de electroporación a 25 voltios, cinco números de pulso, longitud de pulso de 45 milisegundos e intervalos de 300 pulsos. Prepare una pipeta bucal, una jeringa de 10 mililitros, tiras de paraforma, un cepillo suave, tijeras de disección afiladas y 25 mililitros de PBS estéril. Prepare una mezcla adecuada de plásmidos de ADN y agregue un tinte verde rápido para visualizar el ADN inyectado.

Cuando los huevos hayan alcanzado la etapa de desarrollo adecuada, retírelos de la incubadora y manténgalos en posición horizontal. Use etanol al 70% para limpiar las cáscaras de huevo. Manipule un huevo a la vez para minimizar la exposición embrionaria.

Tiempo de airear con las puntas de las tijeras. Haz un agujero en el polo del huevo y con la jeringa, retira de tres a cuatro mililitros de albúmina. Con las tijeras de disección, abra una pequeña ventana ovalada en el polo horizontal superior de la cáscara de huevo.

Durante todo el proceso, gotea unas gotas de PBS sobre el embrión para evitar la sequedad. Con una pipeta bucal, cargue una pequeña cantidad de la mezcla de ADN en el capilar de vidrio. A continuación, coloque el embrión con su extremo posterior en vista indirecta.

Luego, sosteniendo el capilar a unos 45 grados, penetra en el cerebro posterior mimado. No extraiga ninguna membrana alrededor del embrión sin formar burbujas de aire. Exhala con cuidado para inyectar la solución de ADN en la luz encefálica posterior.

La solución se extenderá anteriormente inmediatamente después de la inyección de ADN. Coloque los electrodos paralelos en las posiciones precisas de AP y DV en el cerebro posterior. Sin tocar el corazón, empuje los electrodos ligeramente ventralmente y pulse el electro.

Los electrodos deben cubrirse con burbujas para indicar la conductividad eléctrica, retire con cuidado los electrodos y gotee unas gotas de PBS para enfriar el embrión y eliminar las burbujas. Use una tira de perfil para sellar correctamente la abertura del huevo para evitar que se seque durante la incubación con un cepillo suave y PBS, lave los electrodos, coloque el huevo en la incubadora durante el tiempo deseado. La supervivencia de los embriones es de aproximadamente el 90% dos o tres días después de la electroporación y se reduce hasta el 50% 12 días después de la electroporación.

Para hacer preparaciones de montaje plano del cerebro posterior, diseccione cuidadosamente el embrión, separándolo de las membranas circundantes y los vasos sanguíneos. Coloque el embrión en una pequeña placa de Petri recubierta de silicona que contenga PBS con el embrión mirando hacia la parte dorsal. Use alfileres de tungsteno para sujetarlo al plato.

Luego, usando un capilar de vidrio afilado. Haga una hendidura dorsal en la placa del techo del cerebro trasero con pinzas afiladas y micro tijeras. Sostenga la parte superior de la cabeza y tire del tejido cerebral posterior con mucho cuidado desde el rostral hasta el toddle.

Después de la separación del cerebro posterior, retire los tejidos ventrales restantes. Incubar el cerebro posterior en una solución de aldehído paraformado al 4% o PFA durante una o dos horas a temperatura ambiente. A continuación, lávelo con PBT para eliminar el PFA.

Después de seguir la preparación de inmunofluorescencia descrita en el protocolo de texto, coloque el cerebro posterior mirando dorsalmente sobre un portaobjetos de vidrio. Agregue medio de montaje fluorescente en el cerebro posterior y use capilares de vidrio o agujas de tungsteno para aplanar el cerebro posterior en el portaobjetos. Agregue una pequeña cantidad de grasa en cada esquina para evitar que el pañuelo se exprima con el cubreobjetos.

Coloque con cuidado un cubreobjetos en la parte superior del cerebro posterior, evitando las burbujas de aire para la adherencia. Agrega esmalte de uñas a los bordes del cubreobjetos. Las secciones criogénicas del tronco encefálico se pueden realizar en cualquier etapa del desarrollo incluso después de E 6.5.

Deberían ser el método preferido debido a la dificultad de visualizar los axones en el embrión montado en plano, que se vuelve muy grueso. Además, la demostración de la sinapsis requiere la sección del tejido y la visualización de gran aumento bajo un microscopio. Para preparar una muestra para la criosección, diseccione el embrión y extraiga todos los tejidos que rodean el cerebro.

Enjuague con PBS. A continuación, utilice unas microtijeras y unas pinzas afiladas para cortar el embrión en la región de la médula. Haga una incisión amplia entre el cerebelo y el mesencéfalo y extirpe todo el tronco encefálico.

El tejido debe contener la protuberancia del bulbo raquídeo y el cerebelo. En el siguiente ejemplo, un elemento potenciador que se expresa en el DA un subgrupo de interneuronas en el cerebro posterior de control se clonó aguas arriba de la recombinasa Cree y se coelectroporó con un plásmido reportero GFP citoplasmático dependiente de Cree. Una preparación de montaje plano en la etapa E 4.5 revela dos patrones de proyección axonal ascendente contralateral para mapear las proyecciones axonales de las interneuronas DA uno en etapas posteriores del desarrollo.

Se clonó un casete reportero de GFP incondicional pre-con dos brazos superpuestos, junto con el potenciador A TOH one creen y el vector de transposición. Con esta estrategia, el MG FP condicional precondicionado C electroporado se integra en los cromosomas del pollo y, en consecuencia, el casete de parada se elimina solo en las neuronas D uno, lo que permite una expresión prolongada de GFP. En DA una celda.

La forma mesilada de la GFP la ata a la membrana de tal manera que se localiza a lo largo de la membrana axonal en lugar de diluirse en el citoplasma. En troncos cerebrales recogidos en E 13.5 y analizados en secciones sagitales. Se encontró que los axones DA uno se acumulan en el cerebelo y se extienden hacia la capa granular externa o EGL, que está marcada por células ZI one positivas.

También se analizaron las dianas sinápticas de los axones D one en el cerebelo. Los embriones E 2.75 fueron electroporados con plásmido reportero de proteína vesícula sináptica dos, junto con un potenciador Cree H one y las transposiciones a cuestas. Este método permite la expresión del reportero GFP en el extremo axonal presináptico DA.

El cerebelo se seccionó en E 13.5 y se tiñó con el marcador presináptico general sináptico taman, así como con calbindina que etiqueta la capa del bikini. Una vista de gran aumento de la sección muestra SV dos vesículas sinápticas positivas para GFP en múltiples regiones cerebelosas, incluida la capa del bikini. Este resultado revela las conexiones sinápticas de las interneuronas DA en el cerebelo.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo electro operar el ADN en el Hein aviar en el día embrionario dos punto 75 para etiquetar específicamente un subconjunto de células neuronales. Este procedimiento permite seguir las proyecciones axonales y las conexiones sinápticas de las células neuronales marcadas en múltiples etapas de desarrollo.