Varias unidades Métodos de grabación para caracterizar la actividad neuronal en el Locust ( Schistocerca americana) Circuitos olfativas

El objetivo general de este procedimiento es registrar la actividad neuronal de múltiples unidades revocada por el olor de los tres primeros centros de procesamiento de señales de la vía olfativa del insecto. Esto se logra primero sujetando a una langosta en una cámara diseñada a medida y estabilizando una de sus antenas para registros electrofisiológicos. El segundo paso es fabricar un microelectrodo de vidrio e insertarlo en la base de un sol para monitorear las respuestas evocadas por el olor.

Junto a registrar la actividad neuronal del cerebro de langosta. Se sigue un procedimiento de disección de varios pasos para exponer el tejido neural, que procesa la entrada de las neuronas sensoriales olfativas. El paso final implica la colocación adecuada de las guías de electrodos múltiples para registrar la actividad neuronal del conjunto de la langosta y el lóbulo de la antena y el cuerpo del hongo.

En última instancia, los métodos de registro extracelular demostrados aquí se utilizan para caracterizar las respuestas evocadas por el olor en los tres primeros centros de procesamiento a lo largo de la vía olfativa de los insectos. Aunque este método se ha utilizado para caracterizar la respuesta neurológica provocada por el olor en un sistema olfativo de invertebrados relativamente simple, también se puede adaptar para examinar la actividad del conjunto en otros sistemas neuronales. La demostración visual de este método es fundamental porque algunos aspectos clave de este procedimiento, como la colocación de electrodos y algunos pasos de disección, son muy difíciles de aprender.

Además, los métodos son en su mayoría cualitativos y los diferentes laboratorios lo han perfeccionado de manera diferente a lo largo del tiempo. Para comenzar este procedimiento, seleccione una langosta adulta joven de ambos sexos con alas completamente desarrolladas, pero antes de la etapa de apareamiento de una colonia abarrotada. A continuación, sujeta a la langosta amputándole las patas.

Selle los sitios de amputación con adhesivo para tejidos. Luego, asegure la langosta a la cámara diseñada a medida con un pequeño trozo de cinta aislante alrededor de su tórax. Bajo un microscopio de disección, haga una ranura poco profunda en la plataforma de cera para colocar la antena.

Coloque la antena en la ranura y estabilícela con cera bati en los dos extremos de la antena. Después de eso, inserte un electrodo de tierra en el tórax. Use cera de batik para sellar el sitio de la incisión y para mantener el cable de tierra en su lugar.

A continuación, coloque la antena de langosta estabilizada bajo un microscopio estereoscópico sobre una mesa de aislamiento de vibraciones. Conecte las líneas de salida de las botellas de olor al tubo de entrega de olores. Coloque el tubo de entrega de olor a unos pocos centímetros de la antena, los vapores de olor entregados se eliminan mediante un embudo de vacío, colocado aproximadamente a 10 centímetros detrás de la antena de langosta.

A continuación, fabrique electrodos de vidrio utilizando un capilar de vidrio silícico con una micropipeta polar, llene el electrodo de vidrio con solución salina de langosta. A continuación, coloque el electrodo de vidrio en un soporte de micropipetas que está conectado a un micromanipulador motorizado. Asegúrese de que la base del syn de grabación sea claramente visible bajo el microscopio.

Inserte suavemente el electrodo en la base de un syn. Posteriormente, amplifique la señal 10.000 veces. Usando un amplificador de CA.

Filtre la señal entre 0,3 y 10,0 kilohercios y adquimítala a una velocidad de muestreo de 15 kilohercios. Utilizando un sistema de adquisición de datos, cuando el electrodo está colocado correctamente, se puede detectar la actividad neuronal espontánea. Las respuestas evocadas por estímulos se pueden monitorear mediante la entrega de un pulso de olor a través del tubo de entrega de olor.

Colocados cerca de la antena y rastreando el cambio en la actividad extracelular, siguieron los procedimientos de restricción descritos anteriormente. Coloque la langosta en una cámara diseñada a medida. Comienza el proceso de disección construyendo una copa de cera alrededor de la cabeza de la langosta.

Construye dos torres de cera a cada lado de la cabeza de langosta, llegando hasta la altura de las antenas. A continuación, inserte cada antena a través de un pequeño trozo de tubo de polietileno que esté bien ajustado en una junta de goma. A continuación, fije las juntas a las torres de cera de modo que el tubo de plástico pueda deslizarse libremente hacia o lejos de la base de las antenas y evitar que se mueva.

Luego, bajo el microscopio, comience a construir una copa de cera alrededor de la cabeza de la langosta para permitir la perfusión de solución salina durante y después del procedimiento de disección. La copa de cera debe comenzar justo por encima de las partes de la boca, abarcar ambas torres de cera y extenderse más allá de los ojos compuestos. Una vez que la copa de cera esté completamente construida, fije la base de las antenas al extremo inferior del tubo de plástico con resina epoxi.

Esto asegurará que las antenas se mantengan en su lugar incluso después de quitar la cutícula circundante. Mantenga la copa de cera llena de solución salina a partir de este punto. Ahora, elimine la región rectangular central entre los dos.

Una antena. Posteriormente, retire la cutícula en las regiones vecinas sin perturbar los ojos compuestos o la cutícula en la base de las antenas. Con pinzas finas, retire suavemente los sacos de aire y los cuerpos de grasa que rodean el cerebro.

El cerebro de la langosta ahora debería ser claramente visible. Las regiones cerebrales que procesan la información olfativa están situadas entre los dos. Una antena tira suavemente de la tripa y la corta con unas tijeras finas.

A continuación, retira las alas y haz una pequeña incisión en el abdomen, justo por encima del recto. Retire la tripa tirando de la tripa posterior con pinzas gruesas. Este paso asegura que el movimiento de las tripas no desestabilice la preparación.

Para evitar fugas de solución salina. Ate el abdomen justo antes del sitio de la incisión con hilos de sutura. A continuación, use una pequeña plataforma hecha de un lazo de alambre delgado recubierto con una fina capa de cera para elevar el cerebro y estabilizarlo para la electrofisiología.

La grabación del cerebro está protegida por una funda semitransparente, que debe retirarse antes de las grabaciones. Para debilitar la vaina, drene parcialmente la copa de cera y extienda con cuidado una pequeña cantidad de proteasa sobre la superficie del cerebro. Después de aproximadamente cinco a 10 segundos de la aplicación de la enzima, enjuague bien el cerebro con solución salina.

A continuación, pellizca muy suavemente y tira de la funda hacia arriba con unas pinzas superfinas para abrirla y exponer los sitios de grabación. En este procedimiento, coloque la preparación de langosta bajo un microscopio estereoscópico sobre una mesa de aislamiento de vibraciones. Mantener una tasa de perfusión salina constante de unos 40 mililitros por hora.

A lo largo del experimento, use un alambre de cloruro de plata sumergido en la taza de cera llena de solución salina como electrodo de tierra. Prepare la configuración de entrega de olores similar al experimento de registro de un solo sensor. Antes del experimento, galvanoplastia los electrodos con oro para lograr las impedancias en el rango de 200 a 300 kilos.

Utilice una sonda de silicio de 16 canales para las grabaciones de las neuronas principales. Bajo el microscopio. Coloque el electrodo cerca de la superficie del lóbulo de la antena e insértelo suavemente en el tejido con un manipulador manual de micrómetros en un sitio de registro ideal, las señales extracelulares serán captadas por múltiples canales de registro y tendrán una alta relación señal-ruido.

Para las grabaciones de células Kenyon, se utiliza un tero de alambre trenzado hecho a medida, galvanoplastia el tero siguiendo los procedimientos de galvanoplastia. A continuación, la sonda de silicona coloca el tero en la superficie del cuerpo del hongo. Dado que las células Samara de Kenia están restringidas a la capa superficial de esta región, tanto las neuronas principales como las células de Kenia pueden realizarse simultáneamente a partir de la misma preparación de langostas.

Después de identificar la ubicación de registro, espere al menos 15 minutos para permitir la estabilización de los electrodos. Luego adquiera la señal extracelular a 15 kilohercios. Filtrarlo entre 0,3 y seis kilohercios y amplificarlo con un amplificador de CA de 16 canales, tanto espontáneo como evocado por estímulos.

Se puede observar la actividad neuronal de múltiples unidades de las neuronas de proyección en el lóbulo de la antena. Trazas de voltaje extracelular en bruto que muestran las respuestas de una neurona receptora olfativa a dos olores diferentes. Aquí se muestran dos etanol octal y uno H.

Aquí se muestra una traza extracelular representativa de una grabación de lóbulos de antena de varias unidades. En esta traza de voltaje se pueden observar los potenciales de acción o picos de diferentes amplitudes que se originan en diferentes neuronas principales. Tenga en cuenta que se aplicó un pulso de olor de cuatro segundos durante el período de tiempo indicado por el cuadro gris.

Aquí se muestra un ejemplo de registro extracelular del cuerpo de un hongo. A diferencia de las neuronas receptoras olfativas y las neuronas principales, las células de Kenyon en el cuerpo del hongo de insecto tienen una actividad basal más baja y responden a los olores de manera escasa y selectiva. Para aislar las respuestas de una sola unidad de estos registros de varias unidades, realizamos un procedimiento de clasificación de picos utilizando software publicado de manera fuera de línea.

Aquí se muestran ejemplos de la clasificación de las neuronas principales y las células de Kenia: Después de ver este video. Debe tener una buena comprensión de cómo realizar registros extracelulares de unidades múltiples para caracterizar la actividad neuronal del conjunto en los tres primeros centros olfativos a lo largo de la vía olfativa del inserto.