Name: In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Aprende a rastrear cambios moleculares dependientes de la experiencia en neuronas corticales individuales mediante imágenes de dos fotones in vivo. Este método utiliza ratones knockin con reportadores GFP para estudiar la neuroplasticidad en tiempo real.

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Los autores desean agradecer a L. Belluscio para equipo de cirugía rodaje, D. Kwon para la filmación de asistencia, K. Liu para edición de vídeo asistencia y MacLeod K. para toda la música de fondo. KW reconoce el generoso apoyo de la División de Programas de Investigación NIMH intramuros y los Genes, cognición y el Programa de Psicosis. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramural del NIMH (VC, YY, SMKW) y la División de NIAAA Programa Intramural investigación clínica y biológica (VC, RMC, DML).

Los procedimientos experimentales se describen a continuación fueron aprobados por el Instituto Nacional de la Atención Mental de Salud Animal y el empleo y estaban de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. 1. Pre-operatorio Preparación <ol><li> Limpie todas las herramientas en un esterilizador caliente cordón antes de la cirugía aséptica, limpie el sitio de la cirugía con un 70% de etanol, y poner paños limpios gota. Use guantes estériles. Se anestesia el animal recién preparada con 1,2% de solución de avertina, dado a 0,02 ml / g, intraperitonealmente. Alternativamente, anestesiar con gas isoflurano a través de un cono nasal, 5% para la inducción, 1,5% para el mantenimiento, con un circuito eliminador pasiva. Compruebe el nivel de anestesia con pizcas de cola o del pie para asegurarse de sedación total. </li><li> Cubrir los ojos del animal con ungüento oftálmico estéril, y se inyecta dexametasona recién preparada (0,2 mg / kg) y carprofeno (5 mg / kg) subcutaneously para prevenir la hinchazón y la inflamación cerebral 11. Afeitar el pelo sobre el cráneo entre las orejas, y esterilizar la piel con matorrales betadine y tres hisopos alternos de 70% de etanol. </li><li> Montar el animal en una etapa de la cirugía estereotáxica con earbars, con una almohadilla de calentamiento de agua de circulación a continuación el conjunto de los animales a 37 ° C. Compruebe regularmente los niveles de anestesia del animal, así como complementar el original dosis de anestesia según sea necesario. </li><li> Inyectar 200 l de bupivacaína al 0,5% debajo de la piel del cuero cabelludo para adormecer el área. Incisión de la piel y eliminar el colgajo de piel sobre el cráneo. Retire el periostio y seque el área con hisopos de algodón limpios. </li></ol> 2. Cirugía crónica ventana craneal <ol><li> Use un taladro dental de alta velocidad con una fresa de 0,5 mm para delinear suavemente un círculo 3-5 mm de diámetro en la región cerebral de interés. Periódicamente humedecer el sitio de perforación con polvo estéril al 0,9% de solución salina y hueso clara distancia con hisopos de algodón limpios. Si los sangrados de hueso, utilizar gelfoam remojados previamente con solución salina estéril para secar la hemorragia y esperar a que se detenga. </li><li> Cuando la capa de hueso se llega al último, levante y retire la isla hueso con unas pinzas de punta fina. Dura adjuntos a la plataforma inferior del hueso se pueden encontrar si la ventana cruza una sutura ósea. Éstos se deben retirar suavemente el colgajo óseo se levanta. </li><li> Rollo de espuma de gel humedecido suavemente sobre la duramadre expuesta a limpiar su superficie y esperar a que el sangrado dural dejar paso crítico:. No continúe hasta que la hemorragia se ha detenido dural. La sangre que queda atrapada en el interior de la ventana craneal usualmente lleva a una ventana opaca. </li><li> Si la región de interés está bajo un lugar donde la duramadre es particularmente gruesa, la eliminación de la duramadre por encima puede ser necesario. Si este es el caso, separar suavemente la dura desde la pia abajo con pinzas muy finas, realizar una pequeña incisión en la duramadre levantado con otro par de pinzas finas, a continuación, sujete los bordes de corte y suavementedividir la duramadre. La duramadre es delgada pero fuerte, así que ten cuidado de no cortar el cerebro con los bordes intactos de la duramadre. </li><li> Enjuague el área con ACSF estéril o solución salina estéril. </li><li> Coloque un cubreobjetos de vidrio estéril (3-5 mm) a lo largo de la duramadre o pia paso crítico:. Si las curvas del cráneo que rodean de manera significativa, el uso Kwiksil adhesivo 12 para llenar los espacios donde la dura o pia no hacen contacto con el cubreobjetos en regiones que no se va a examinar. </li><li> El uso de gel de cianoacrilato para cubrir el adhesivo elastómero y los bordes del cubreobjetos de vidrio. Cubrir el cráneo expuesto con toda gel de cianoacrilato, o una mezcla de cemento y krazyglue dental paso crítico:. No permita que el gel de cianoacrilato para tocar la superficie del cerebro. </li><li> Insertar una medida cabeza de metal barra de sujeción en el extremo opuesto del cráneo. </li><li> Volver al animal a una cámara de recuperación caliente, después de una inyección intraperitoneal de ketoprofeno, 5 mg / kg, for el manejo del dolor. Continuar con el analgésico durante dos días más después de la operación. </li><li> Después de dos semanas de recuperación post-operatoria, anestesiar al animal con isoflurano (5% para la inducción, 1,5% para mantenimiento), montarlo en una platina del microscopio a medida con un marco de fijación de cabeza, y marque la ventana craneal para la claridad óptica bajo iluminación con luz azul. Superficie hematoencefálica claridad recipiente es altamente indicativo de la calidad de ventana craneal. Si los bordes de los vasos sanguíneos están claramente definidos, la ventana es probable que sea utilizable. El dos semanas después de la operación el tiempo de recuperación se recomienda para permitir tiempo suficiente para que el animal pueda recuperarse de la cirugía. Ventanas craneales típicamente limpiar y mejorar durante este tiempo, y siendo ópticamente transparente para semanas adicionales a mes hasta rebrote de cráneo o engrosamiento de la duramadre degrada la calidad de ventana. </li></ol> 3. Protocolo del comportamiento y de escaneo láser de dos fotones microscopía <ol><li> Los animales con clara cventanas ranial estará expuesto a un estímulo ambiental o sometidos a una sesión de entrenamiento del comportamiento, y luego fotografiada después en el momento de máxima Arc-GFP expresión. Antes de iniciar un protocolo de comportamiento, el animal deberá ser mantenido en un entorno doméstico jaula consistente para minimizar día a día variación en los niveles basales de expresión de GFP-Arc. </li><li> Comenzar el entrenamiento conductual o paradigmas ambientales de estimulación, en función de la región cerebral de interés. Por ejemplo, los animales pueden ser expuestos a diferentes ambientes visuales en días consecutivos, y fotografiado cada día después de la estimulación visual para identificar específicos de estímulo-respuesta en la corteza visual 10. </li><li> Arc-GFP fluorescencia en las neuronas normalmente alcanza su nivel máximo dos horas después de la estimulación. La línea de tiempo experimental puede ser optimizado para facilitar la detección de la expresión Arc-GFP en las neuronas en sus niveles pico de fluorescencia. </li><li> Después de una sesión de entrenamiento conductual o environmental estimulación se completa, anestesiar al animal con isoflurano (5% para la inducción, 1,5% para el mantenimiento) y montar el animal en la platina del microscopio a medida con bastidor de la cabeza de fijación bajo el microscopio de dos fotones. </li><li> La posición de la cabeza del animal se fija al bastidor de la cabeza de fijación que se conecta directamente a la etapa, con la barra de metal implantado en el cráneo. El isoflurano y oxígeno se suministran continuamente al ratón a través de un cono nasal. La temperatura corporal se mantiene utilizando una almohadilla térmica. </li><li> Asegúrese de que los detectores de microscopio están protegidos de la luz ambiente mediante la realización de dos fotones de láser de barrido en una habitación oscura. Utilice un objetivo de inmersión en agua 20x o 25x (1,05 apertura numérica) para formación de imágenes. En primer lugar, en virtud de epi-fluorescencia iluminación, adquirir una imagen de los patrones de los vasos sanguíneos superficiales más de la región del cerebro de interés con una cámara CCD para la alineación de la imagen en el futuro. </li><li> Iniciar la de dos fotones de exploración por láser para adquirir una pila de imágenes en 3-D. Una Olympus FV1000MPE multi-fotón microscopio se utiliza en nuestra configuración. La excitación de longitud de onda del láser de dos fotones se ha fijado en 920 nm, y la potencia del láser emitido desde el objetivo se fija a aproximadamente 50 mW. Fluorescencia emitida se detecta simultáneamente en los canales verde y rojo (espejo dicroico a 570 nm, filtros de barrera a 495-540 nm y 570-625 nm), utilizando un externo de dos canales sistema de detección photomutiplier colocado cerca de la muestra. Arc-GFP fluorescencia sólo aparece en el canal verde, mientras que el tejido auto-fluorescencia aparece tanto en los canales 13, 14. </li><li> Pilas típicas imágenes tienen dimensiones de aproximadamente 320x320x100 m (largo x ancho x profundidad), una resolución horizontal de 0,5 m / pixel, y una resolución vertical de 3 m / pixel. </li><li> Después de adquirir la pila de imágenes, devolver el animal a su jaula. No moleste a los animales hasta la próxima sesión de imágenes y de comportamiento. Repita el comportamiento y el procedimiento de imagen a través de días como desired. Utilice la superficie previamente adquirido hematoencefálica imagen buque para orientar a la ubicación de imágenes iguales. </li></ol>

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<li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).</li>
<li>Stosiek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método de obtención de imágenes in vivo descrito aquí permite el examen repetido de los cambios de expresión génica en Arco los mismos conjuntos de neuronas durante varios días en el animal vivo. Es un método eficiente y versátil para obtener información acerca de la plasticidad neuronal relacionada-dinámica molecular en neuronas individuales en respuesta a diversas experiencias de comportamiento. Estándar métodos histoquímicos tales como la hibridación in situ y la inmunotinción se puede lograr de ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del Equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> FV1000 multi-fotón microscopio de barrido láser </td><td> Olimpo </td><td> FV1000MPE </td><td> Proyección de imagen </td></tr><tr><td> Disección microscopio </td><td> Omano </td><td> 555V107 </td><td> Cirugía </td></tr><tr><td> Stereotaxis etapa de la cirugía para los ratones </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 726335 </td><td> Cirugía </td></tr><tr><td> 20X o 25X objetivo de inmersión en agua </td><td> Olimpo </td><td> XLPL25XWMP </td><td> Proyección de imagen </td></tr><tr><td> Microscopio etapa con marco de fijación de cabeza </td><td> Una medida que se </td><td> N / A </td><td> Proyección de imagen </td></tr><tr><td> Pinzas finas </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11251-20 </td><td> Cirugía </td></tr><tr><td> Dental taladro fresa </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 19007-05 </td><td> Cirugía </td></tr><tr><td> CCD cámara </td><td> QImaging </td><td> QICAM 12-bit </td><td> Proyección de imagen </td></tr></tbody></table>

in vivo de dos fotones de imágenes de dependientes experience-los cambios moleculares en las neuronas corticales

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

La capacidad del cerebro para cambiar en respuesta a la experiencia es esencial para la función cerebral sano, y anormalidades en este proceso de contribuir a una variedad de trastornos del cerebro 1,2. Para comprender mejor los mecanismos por los que los circuitos cerebrales reaccionan a la experiencia de un animal requiere la capacidad de monitorizar los cambios moleculares que dependen de la experiencia en un determinado conjunto de neuronas, durante un período de tiempo prolongado, en el animal vivo. Si bien la experiencia y de la actividad neural asociada se sabe para accionar los cambios de expresión génica en neuronas 1,2, la mayoría de los métodos para detectar tales cambios no permiten la observación repetida de las mismas neuronas más de varios días o no tienen suficiente resolución para observar las neuronas individuales 3 , 4. Aquí se describe un método que combina en dos fotones microscopía in vivo con un reportero codificado genéticamente fluorescente para rastrear dependientes experiencia-cambios de expresión génica en las neuronas corticales individuales sobre la<html> curso de la experiencia día a día. Uno de los bien establecidos que dependen de la experiencia de los genes es la actividad regulada citoesqueleto proteínas asociadas (Arc) 5,6. La transcripción de Arco es rápida y altamente inducida por la intensificación de la actividad neuronal 3, y su producto de proteína regula la endocitosis de los receptores de glutamato y largo plazo plasticidad sináptica 7. La expresión de Arco ha sido ampliamente utilizado como un marcador molecular para asignar circuitos neuronales implicados en comportamientos específicos 3. En la mayoría de estos estudios, la expresión Arc se detectó mediante hibridación in situ o inmunohistoquímica en secciones de cerebro fijos. Aunque estos métodos reveló que la expresión de Arco fue localizado en un subconjunto de neuronas excitadoras después de experiencia de comportamiento, cómo los patrones celulares de expresión Arc podría cambiar con episodios múltiples de experiencias repetidas o distintivo más días no fue investigado. ntent &quot;&gt; In vivo de dos fotones microscopía ofrece una poderosa manera de examinar la experiencia-dependientes cambios celulares en el cerebro de los vivos 8,9. Para habilitar el examen de expresión Arco en neuronas vivas por microscopía de dos fotones, hemos generado previamente un golpe- en línea de ratón en el que un reportero GFP se pone bajo el control del promotor endógeno del arco 10. Este protocolo describe las preparaciones quirúrgicas y procedimientos de formación de imágenes para el seguimiento dependientes experiencia-GFP Arc-patrones de expresión en conjuntos neuronales en el animal vivo. En este método , crónicas ventanas craneales se implantaron primero en ratones GFP Arc-en las regiones corticales de interés. Estos animales fueron entonces repetidamente fotografiada por dos fotones microscopía después de paradigmas de comportamiento deseadas en el transcurso de varios días. Este método puede ser aplicable en general a animales portadores otros reporteros fluorescentes de experiencia-dependientes cambios moleculares 4.

<html> Este protocolo describe un método para rastrear dependientes experiencia-cambios moleculares en las neuronas corticales individuales en los animales vivos. Una ventana craneal crónica se crea por primera vez en una región cortical de interés en un ratón que lleva un indicador fluorescente de la expresión génica. Microscopía de dos fotones se puede acoplar con varios paradigmas de comportamiento para observar su comportamiento inducidos cambios moleculares en las neuronas individuales y rastrear tales cambios en lo...

La experiencia-dependientes cambios moleculares en las neuronas son esenciales para la capacidad del cerebro para adaptarse en respuesta a problemas de comportamiento. Un<em&gt; In vivo</em&gt; De dos fotones método de formación de imágenes se describe aquí que permite el seguimiento de dichos cambios moleculares en las neuronas corticales individuales a través de la prensa codificados genéticamente.

In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Los cambios moleculares dependientes experimentados en las neuronas son esenciales para la capacidad del cerebro para adaptarse en respuesta a los desafíos de comportamiento. Aquí se describe un método de imagen in vivo de dos fotones que permite el seguimiento de dichos cambios moleculares en neuronas corticales individuales a través de reporteros codificados genéticamente. Uno de los genes dependientes experimentados bien establecidos es la proteína asociada al citoesqueleto regulada por actividad, o arco.La transcripción de ARC es rápida y altamente inducida por la intensificación de la actividad neuronal. Para permitir el examen de la expresión de ARC en neuronas vivas mediante dos fotomicroscopías, utilizamos una línea de ratón knockin en la que se coloca un reportero GFP bajo el control del promotor de arco endógeno. Este protocolo describe las preparaciones quirúrgicas y los procedimientos de imagen para el seguimiento de los patrones de expresión de GFP de arco dependiente experimentados en conjuntos neuronales en el animal vivo. En primer lugar, describiremos la preparación animal necesaria para esta técnica.Un animal con arco GFP se someterá a una cirugía de ventana crane

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Para comprender la dinámica de la red de microcircuitos de la neocorteza, que es esencial para grabar simultáneamente la actividad de un gran número de neuronas. En vivo de dos fotones de imágenes de calcio es el único método que permite grabar la actividad de una densa población neuronal con una sola célula de resolución.

En Vivo 2-Photon imágenes de calcio en la capa 2 / 3 de los ratones

Un protocolo de mínima invasión para estabilizar la columna espinal de ratón y realizar...

Imágenes in vivo de la médula espinal de ratón Utilizando microscopía de dos fotones

Source: Mizuno, H., et al. In Vivo Imágenes de dos fotones de neuronas corticales en ratones neonatos. J. Vis. Exp. (2018)Este video muestra el uso de microscopía de dos fotones para obtener imágenes de las neuronas en el cerebro de un cachorro de ratón transgénico anestesiado. El láser de dos fotones permite obtener imágenes más profundas con alta resolución espacial y una dispersión de luz mínima, lo que permite la captura detallada de la morfología neuronal, incluidas las proyecciones...

Microscopía de dos fotones para obtener imágenes de la morfología neuronal en una cría de ratón

Fuente: Kamei, R., et. al., Imágenes crónicas de dos fotones in vivo de la microglía en el hipocampo del ratón. J. Vis. Exp. (2022)El video demuestra la configuración y el proceso de obtención de imágenes para la microscopía de dos fotones in vivo de la dinámica microglial en el hipocampo CA1 (Cornu ammonis 1) y la circunvolución dentada, lo que garantiza una alineación óptica óptima y una evaluación de la integridad estructural.

Imágenes in vivo de dos fotones de la dinámica microglial en el hipocampo del ratón

Se describe un método para el etiquetado de las neuronas con colorantes fluorescentes en funcional predeterminada micro-dominios del neocórtex. En primer lugar, la imagen de la señal óptica intrínseca se utiliza para obtener un mapa funcional. Luego de dos fotones microscopía se utiliza para etiquetar y neuronas imagen dentro de un dominio de micro del mapa.

Etiquetado dirigida de neuronas en una versión concreta de Micro-funcional de dominio de la neocorteza por combinar la señal intrínseca e Imagen de dos fotones

Las imágenes de lapso de tiempo en el animal vivo proporcionan información valiosa sobre la reorganización estructural en el cerebro intacto. Aquí, presentamos una preparación de cráneo adelgazado que permite la obtención de imágenes transcraneales de estructuras sinápticas marcadas con fluorescencia en la corteza del ratón vivo mediante microscopía de dos fotones.

De dos fotones<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación

Este video muestra el procedimiento de craneotomía que permite obtener imágenes crónicas de neuronas en la corteza retroesplenial de ratón utilizando microscopía in vivo de dos fotones en la línea transgénica Thy1-GFP. Este enfoque se combina con la inyección de virus adenoasociados que expresan mCherry en el hipocampo dorsal. Estas técnicas permiten el seguimiento a largo plazo de la plasticidad estructural dependiente de la experiencia en RSC.

Simultánea de dos fotones<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial

Presentamos un en vivo imagen de protocolo de la corteza cerebral de ratones neonatales de la proyección de imagen de dos fotones. Este método es adecuado para el análisis de la dinámica del desarrollo de las neuronas corticales, los mecanismos moleculares que controlan la dinámica neuronal y los cambios en la dinámica neuronal en modelos de la enfermedad.

En Vivo Proyección de imagen de dos fotones de neuronas corticales en ratones neonatales

Este método describe una preparación crónica que permite el acceso óptico al hipocampo de ratones vivos. Esta preparación se puede utilizar para realizar imágenes ópticas longitudinales de plasticidad estructural neuronal y plasticidad celular evocada por la actividad durante un período de varias semanas.

Imágenes longitudinales de dos fotones del hipocampo dorsal CA1 en ratones vivos

Este artículo describe un método para la observación crónica in vivo de la microglía en reposo en el hipocampo de ratón CA1 utilizando cirugía controlada con precisión y microscopía de dos fotones.

In vivo Imágenes crónicas de dos fotones de microglia en el hipocampo del ratón

Aprende a rastrear cambios moleculares dependientes de la experiencia en neuronas corticales individuales mediante imágenes de dos fotones in vivo. Este método utiliza ratones knockin con reportadores GFP para estudiar la neuroplasticidad en tiempo real.

In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales

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