In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales

Los cambios moleculares dependientes experimentados en las neuronas son esenciales para la capacidad del cerebro para adaptarse en respuesta a los desafíos de comportamiento. Aquí se describe un método de imagen in vivo de dos fotones que permite el seguimiento de dichos cambios moleculares en neuronas corticales individuales a través de reporteros codificados genéticamente. Uno de los genes dependientes experimentados bien establecidos es la proteína asociada al citoesqueleto regulada por actividad, o arco.

La transcripción de ARC es rápida y altamente inducida por la intensificación de la actividad neuronal. Para permitir el examen de la expresión de ARC en neuronas vivas mediante dos fotomicroscopías, utilizamos una línea de ratón knockin en la que se coloca un reportero GFP bajo el control del promotor de arco endógeno. Este protocolo describe las preparaciones quirúrgicas y los procedimientos de imagen para el seguimiento de los patrones de expresión de GFP de arco dependiente experimentados en conjuntos neuronales en el animal vivo. En primer lugar, describiremos la preparación animal necesaria para esta técnica.

Un animal con arco GFP se someterá a una cirugía de ventana craneal y se recuperará de la cirugía durante aproximadamente dos semanas. A continuación, se comprueba la calidad de la ventana craneal y, si se pueden obtener imágenes de las neuronas a través de ella, se coloca al animal en un entorno qua hasta el comienzo de los experimentos de comportamiento y dos experimentos de imágenes de fotones. A continuación, se obtienen imágenes repetidas de estos animales mediante dos fotomicroscopías.

Después de completar los paradigmas de comportamiento deseados en el transcurso de varios días, limpie todas las herramientas en un esterilizador de perlas calientes. Antes de la cirugía aséptica, limpie el sitio de la cirugía con etanol al 70% y coloque paños limpios. Anestesiar al animal con solución de Everton al 1,2% administrada a 0,02 mililitros por gramo intraperitoneal.

Verifique el nivel de anestesia con pinzamientos en la cola o los dedos de los pies para garantizar una sedación completa. Cubrir los ojos del animal con ungüento oftálmico estéril e inyectar dexametasona 0,2 miligramos por kilogramo y carprofeno cinco miligramos por kilogramo por vía subcutánea. Afeitar el pelo sobre el cráneo entre las orejas y esterilizar la piel con un exfoliante Betadine y tres hisopos alternos de etanol al 70% monta al animal en una etapa de cirugía estereotáxica con barras en los oídos con una almohadilla térmica de circulación de agua debajo del animal a 37 grados.

Revise regularmente los niveles de anestesia del animal y complemente la dosis anestésica original según sea necesario. Inyecte 200 microlitros de Marcaína al 0,5% debajo de la piel del cuero cabelludo para adormecer el área, incidir la piel y eliminar el colgajo de piel sobre el cráneo. Retire el periostio y seque el área con hisopos de algodón limpios.

Use un taladro dental de alta velocidad con una fresa de 0,5 milímetros para delinear suavemente un círculo de tres a cinco milímetros de diámetro sobre la región del cerebro de interés, según sus necesidades. Humedece periódicamente el sitio de perforación con solución salina estéril al 0,9% y elimina el polvo óseo con hisopos de algodón limpios. Si el hueso sangra, use espuma de gel previamente empapada con solución salina estéril para secar el sangrado y espere a que se detenga.

Cuando se alcance la última capa ósea, levante y retire la isla ósea con pinzas de punta fina. Es posible que encuentres uniones durales en el estante inferior del hueso. Si la ventana tiene cruces de sutura ósea, estas deben retirarse con cuidado.

A medida que se levanta el colgajo óseo, enrolle suavemente la espuma húmeda y en gel sobre la duramadre expuesta para limpiar su superficie y espere a que se detenga el sangrado dural. Si su región de interés se encuentra debajo de un lugar con una duramadre particularmente gruesa, puede ser necesario eliminar la duramadre por encima de ella. Si este es el caso, separe suavemente la duramadre de la PIA que se encuentra por debajo con pinzas muy finas.

Haga una pequeña incisión en la duramadre levantada con otro par de pinzas finas. A continuación, agarre los bordes cortados y divida suavemente la duramadre. La duramadre es delgada pero fuerte, así que tenga cuidado de no cortar el cerebro con los bordes intactos de la duramadre.

A medida que trabaje de regreso y lejos de su región de interés, enjuague el área generosamente con LCR A estéril o solución salina estéril. Si el cráneo circundante se curva significativamente alrededor de la duramadre o pia expuesta, use adhesivo de celda rápida para rellenar los espacios que no entrarían en contacto cercano con el encubrimiento de la ventana en las regiones que no se tomarán imágenes. A continuación, coloque una cubierta de vidrio estéril que se desliza suavemente sobre la duramadre o pia.

Utilice el gel acrílico Sano para cubrir el adhesivo elastómero y los bordes del vidrio. Cubreobjetos. Cubre todo el cráneo expuesto con gel de cianoacrilato Sano o una mezcla de pegamento loco y cemento dental.

Incruste una barra de fijación de cabeza de metal hecha a medida en el extremo opuesto del cráneo. Regrese el animal a una cámara de recuperación tibia después de una inyección intraperitoneal de ketoprofeno cinco miligramos por kilogramo para el manejo del dolor. Continuar con el analgésico durante dos días postoperatorios.

Después de dos semanas de recuperación postoperatoria, anestesiar al animal con flúor ISO. 5% para inducción, 1,5% para mantenimiento. Móntelo en una platina de microscopio hecha a medida con un marco de fijación de la cabeza y verifique la claridad óptica de la ventana craneal.

Bajo iluminación con luz azul, la claridad de los vasos sanguíneos de la superficie del cerebro es altamente indicativa de la calidad de la ventana craneal. Si sus bordes están bien definidos, es probable que la ventana sea utilizable. Antes de comenzar un protocolo de comportamiento, el animal debe mantenerse en un entorno de jaula doméstica constante para minimizar la variación diaria.

En el arco basal, los niveles de expresión de GFP inician paradigmas de entrenamiento conductual o estimulación ambiental dependiendo de la región cerebral de interés. Por ejemplo, los animales pueden ser expuestos a diferentes entornos visuales durante días consecutivos para obtener imágenes de poblaciones distintivas de neuronas en el arco de la corteza visual, la fluorescencia GFP en las neuronas generalmente alcanza su nivel máximo dos horas después de la estimulación. La línea de tiempo experimental puede optimizarse para facilitar la detección de la expresión de ARC GFP en las neuronas en sus niveles máximos de fluorescencia.

Después de completar una sesión de entrenamiento conductual o estimulación ambiental, anestesiar al animal con flúor ISO 5% para inducción, 1.5% para mantenimiento. Monte el animal en la platina de microscopio hecha a medida con marco de fijación de la cabeza. Bajo el microscopio de dos fotones, la posición de la cabeza del animal se fija al marco de fijación de la cabeza que se conecta directamente a la etapa mediante la barra de metal implantada en el cráneo.

El flúor ISO y el oxígeno se suministran continuamente al ratón a través de un cono nasal. La temperatura corporal se mantiene mediante una almohadilla térmica. Asegúrese de que los detectores del microscopio estén protegidos de la luz ambiental.

Al realizar dos escaneos láser de fotones en una habitación oscura, use una lente de inmersión en agua de apertura numérica de 20 x o 25 x 1.05 para obtener imágenes. Primero, bajo iluminación de epifluorescencia, adquiera una imagen de los patrones de los vasos sanguíneos superficiales sobre la región del cerebro de interés con una cámara CCD. Para la alineación de imágenes futuras, inicie el escaneo láser de dos fotones para adquirir una pila de imágenes 3D.

La longitud de onda de excitación del láser de dos fotones se establece en 920 nanómetros y la potencia se establece en aproximadamente 50. La fluorescencia emitida por milivatios se detecta simultáneamente en un arco de canal verde y rojo. La fluorescencia GFP solo aparece en el canal verde, mientras que la autofluorescencia tisular aparece en ambos canales.

Las pilas de imágenes típicas tienen dimensiones de aproximadamente 320 por 300, 20 por 100 micrómetros, una resolución horizontal de 0,5 micrómetros por píxel y una resolución vertical de tres micrómetros por píxel. Después de adquirir la pila de imágenes, devuelva el animal a su jaula de origen. No moleste al animal hasta la próxima sesión de comportamiento e imagen.

Repita el comportamiento y el procedimiento de imágenes a lo largo de los días según lo desee. Utilice la imagen de los vasos sanguíneos de la superficie del cerebro adquirida previamente para orientarse de nuevo a la misma ubicación de la imagen. El punto fuerte de esta técnica es que permite examinar los cambios en la expresión génica del arco en el mismo conjunto de neuronas durante varios días.

En el animal vivo. Los métodos histoquímicos estándar pueden lograr la resolución de una sola célula, pero no pueden rastrear los cambios en la expresión génica en las mismas neuronas durante varios días. Otras técnicas de imagen, como la resonancia magnética o los métodos de imagen nuclear, carecen de la resolución necesaria para obtener imágenes de neuronas individuales.

Como tal, ningún otro método existente para medir los cambios en la expresión génica puede igualar tanto la resolución espacial como la cobertura temporal del método de imagen descrito aquí. Un paso crítico en este procedimiento es la cirugía de la ventana craneal. Debe realizarse con especial cuidado para evitar traumatismos en el cerebro o dejar sangre debajo del cubreobjetos de vidrio.

La duramadre se puede quitar si es necesario. Tenga en cuenta que la profundidad máxima de la imagen en el cerebro mediante este procedimiento dependerá de la claridad de la ventana craneal, la configuración del microscopio y el brillo de los reporteros fluorescentes. Este protocolo de imagen in vivo es un método eficiente y versátil para obtener información sobre la dinámica molecular relacionada con la neuroplasticidad en neuronas individuales en respuesta a diversas experiencias de comportamiento, y es probable que sea generalmente aplicable a ratones transgénicos portadores de indicadores fluorescentes para otros genes regulados experimentados.