Name: Identificación de los La Bella Durmiente Transposón inserciones en tumores sólidos utilizando vinculador mediada por PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Aprende a identificar oncogenes y genes supresores de tumores mediante la detección de inserciones del transposón Sleeping Beauty en tumores sólidos de ratón usando PCR mediada por ligador.

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Los autores desean agradecer a Moriarity Branden, Largaespada David, y Keng Vicente de la Universidad de Minnesota, y Dupuy Adán en la Universidad de Iowa por su ayuda en el desarrollo del protocolo descrito anteriormente.

1. Crianza y Envejecimiento de Animales Transgénicos <ol><li> Seleccione las cepas de ratones transgénicos apropiados para su experimento. Un experimento típico se utilizan tres líneas transgénicas; una transposasa condicional del ratón, un ratón que alberga un concatémero de transposones, y un ratón que expresan la recombinasa Cre en las células que se cree que las células de origen para el cáncer deseada. Si el cáncer que está siendo modelado tiene una mutación conocida en un gran porcentaje de los pacientes puede ser deseable incluir esta mutación en el inicio. Ejemplos de estos &quot;predisponentes&quot; mutaciones incluyen Kras activados, TP53 dominantes negativos o un alelo Pten floxed. Mediante la adición de una mutación que predispone el modelo puede representar mejor el cáncer humano (véase 1.3). Transposasa Varios Bella Durmiente transposón y ratones están disponibles en el Instituto Nacional del Cáncer Ratón Repository ( <a href="http://mouse.ncifcrf.gov/" target="_blank">http://mouse.ncifcrf.gov/</a> ). </li><li> Ratones raza transposasa condicionales con ratones portadores de los transposones de obtener eventualmente ratones homocigotos para ambos alelos si es posible. Raza descendencia homocigota para ratones que expresan la recombinasa Cre para generar sus triples ratones transgénicos experimentales (Figura 2). Nota: La obtención de ratones homocigotos no siempre es posible o ideal. Por ejemplo, p53 negativos ratones homocigotos dominantes son mucho más difíciles de criar que los ratones heterocigotos. Además, es útil para asegurarse de que las camadas seguir la genética mendeliana para confirmar que el método de obtención tiene éxito. </li><li> Si se utiliza un fondo predispuesto, ratones primera raza con la transposasa a ratones con el alelo de predisposición. Simultáneamente, los ratones de raza expresar Cre recombinasa a ratones portadores de los transposones. Crear ratones homocigotos para cada alelo, si es posible. Por último, criar la descendencia homocigota de los planes de mejoramiento dos anteriores para generar anim cuádruple transgénico experimentalals. </li><li> Además de los animales de experimentación, generar cohortes de control de ratones. El grupo de control normalmente consta de camada de la cría experimental que sólo heredan dos de los tres alelos (Figura 2). En el caso de un fondo predispuesto, ratones, incluyendo tres de los cuatro alelos también será necesario. </li><li> Monitorear los ratones experimentales y de control al día durante el desarrollo del tumor y / o moribundity. Sigue a tu animal de Atención Institucional y el empleo Comisión (IACUC) requisitos para la cría de animales. Además, es típico para determinar una edad en la que se va a sacrificar a un animal si no se ha convertido aún moribundo. Dieciocho meses es una edad típica en la que los ratones son sacrificados. </li></ol> 2. La necropsia de animales transgénicos <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Sure-Seal Inducción de Cámara </td><td> Brain Tree Científico </td><td> EZ-177 </td></tr><tr><td> Criovial </td><td> BioExpress </td><td> C-3355-2 </td></tr><tr><td> 10% formalina tamponada </td><td> Sigma Aldrich </td><td> HT501128-4L </td></tr></tbody></table> Reactivos Tabla 1. Necesario. <ol><li> Cuando el ratón está moribundo o se ha llegado al final de la vida útil determinada, practicar la eutanasia en animales utilizando un CO 2 cámara siguiendo las directrices de su IACUC. Generalmente, colocar al animal en una cámara de gas limpio, abrir el tanque de gas y ajustar el regulador a leer no más de 5 libras por pulgada cuadrada. Llene lentamente para minimizar la irritación nasal y ocular y la aversión al CO 2. Asegúrese de que el corazón del animal ya no late y no responde cuando se toca los ojos. </li><li> Vaporizador exterior de ratón sacrificado con 70% de etanol. </li><li> Coloque el ratón sobre una tabla necropsia y asegurar con pasadores de disección. Con unas tijeras und pinzas para abrir ratón y extraer los órganos. La determinación de los órganos que deben recogerse proyecto es dependiente. Sin embargo, se recomienda siempre para recoger el bazo y el hígado como estos órganos a menudo dar importante información sobre por qué el ratón estaba moribundo. También recoger el esternón para el análisis del potencial de médula ósea. Además, siempre es beneficioso para recoger cualquier órgano o tejido que parece anormal. </li><li> Tejidos y tumores que están recogidos deben ser dividida en cuatro secciones. Una sección se fija en 10% formalina tamponada durante 18 h seguido por 70% de etanol. Esta sección se puede utilizar para la tinción H &amp; E y / o IHC. Las tres secciones restantes, que son generalmente de 50 a 100 mg de tamaño, son congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Éstos se pueden utilizar para el ADN, el ARN y el aislamiento de proteínas. </li><li> Tirar los pañuelos de la canal y el resto según las directrices de IACUC. </li></ol> 3. Aislamiento de ADN genómico de tumores <table border="1"><tbody><tr><td> &lt;Nombre&gt; fuerte del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Proteína solución de precipitación </td><td> Qiagen </td><td> 158910 </td></tr><tr><td> Tampón de lisis celular </td><td> Qiagen </td><td> 158906 </td></tr><tr><td> Proteinasa K </td><td> Qiagen </td><td> 158920 </td></tr><tr><td> RNasa A </td><td> Qiagen </td><td> 158924 </td></tr><tr><td> Tampón TE </td><td> Promega </td><td> V6232 </td></tr></tbody></table> Reactivos Tabla 2. Necesario. <ol><li> Finamente picada congelada la muestra de tumor (50 a 100 mg) utilizando una cuchilla de afeitar limpia. </li><li> Place picado tejido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añadir 1 ml de tampón de lisis celular que contiene 5 l de proteinasa K solución (20 mg / ml). </li><li> Vortex a fondo. </li><li> Incubar en un 55 ° C agitador regulado a 250 rpm durante al menos 4 horas, preferentemente durante la noche. </li><li> Añadir 1 l de RNasa A una solución (10 mg / ml) y se invierte el tubo 25 veces. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Enfriar a temperatura ambiente colocando en hielo durante 3 min. </li><li> Añadir 333 l solución de precipitación de proteínas y agitar vigorosamente. </li><li> Centrifugar a 14.000 rpm 10 min. Las proteínas deben pellet. Si pellet es muy pequeña, de nuevo vórtice, incubar en hielo durante 5 min, y luego volver a centrifugar. </li><li> Vierta el ADN que contiene sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio 15 ml. </li><li> Añadir un volumen igual de isopropanol 100% y mezclar invirtiendo suavemente 50 veces. </li><li> Centrifugar a 3.500 rpm durante 3 min. </li><li> Desechar el sobrenadante. </li><li> Añadir 1 ml de etanol al 70% y se invierte tubo varias veces para lavar el sedimento. </li><li> Transferir el sedimento lavado junto con el etanol a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Centrifugar a 14.000 rpm durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Se retira etanol y se invierte el tubo se seque al aire (aproximadamente de 5 a 30 min). </li><li> Resuspender el ADN pellet en 50 a 500 l de TE dependiendo del tamaño del precipitado de ADN. </li><li> Opcional incubación a 37 ° C para resuspender el ADN. </li><li> Almacenar a 4 ° C, o -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo. </li></ol> 4. Enlazador mediada-PCR genómico utilizando ADN de los tumores <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> BFAI </td><td> New England Biolabs </td><td> R0568S </td></tr><tr><td> NlaIII </td><td> New England Biolabs </td><td> R0125S </td></tr><tr><td> MinElute placas de 96 pocillos </td><td> Qiagen </td><td> 28051 </td></tr><tr><td> QIAvac 96 Vacuum manifold </td><td> Qiagen </td><td> 19504 </td></tr><tr><td> Múltiples microplaca Genie, 120V </td><td> Scientific Industries, Inc. </td><td> SI-4000 </td></tr><tr><td> ADN ligasa de T4 con tampón de ligación 5x </td><td> Invitrogen </td><html><td> 15224-041 </td></tr><tr><td> BamHI </td><td> New England Biolabs </td><td> R0136S </td></tr><tr><td> 25 mM de dNTPs </td><td> BioExpress </td><td> C-5014-200 </td></tr><tr><td> Platinum Taq </td><td> Invitrogen </td><td> 10966-034 </td></tr><tr><td> FastStart Taq ADN polimerasa </td><td> Roche </td><td> 12032929001 </td></tr><tr><td> Agarosa </td><td> Promega </td><td> V3121 </td></tr><tr><td> Tampón TAE </td><td> Promega </td><td> V4271 </td></tr><tr><td> Tampón TE </td><td> Promega </td><td> V6232 </td></tr><tr><td> El bromuro de etidio </td><td> Promega </td><td> H5041 </td></tr></tbody></table> Reactivos Tabla 3. Necesario. Secuencias de engarce BFAI enlazador + 5 &#39;GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC 3&#39; BFAI enlazador-5 &#39;Phos-TAGTCCCTTAAGCGGAG 3&#39;NH2 &quot;&gt; Enlazador NlaIII + 5&#39;GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGACCATG 3 &#39; NlaIII enlazador-5 &#39;-Phos GTCCCTTAAGCGGAGCC 3&#39; Primer secuencias Primaria PCR directo lado derecho (NlaIII): Spl IRDR R1 1 GCTTGTGGAAGGCTACTCGAAATGTTTGACCC Primaria PCR adelante del lado izquierdo (BFAI): Spl IRDR L1 1 CTGGAATTTTCCAAGCTGTTTAAAGGCACAGTCAAC Primaria inversa PCR para el lado de la derecha y la izquierda: Spl Link1 1 GTAATACGACTCACTATAGGGC Secundario lado derecho de PCR directo: Ejemplo de un código de barras secundario Illumina cebador 5 &#39;AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaGgtgtatgtaaacttccgacttcaa (la de la N representan el código de barras 12 pb, la secuencia en mayúsculas se requieren para la plataforma Illumina, y la secuencia en minúsculas se unirá al transposón.) Secundaria PCR adelante del lado izquierdo: Ejemplo de un código de barras de segunda Illuminadary 5&#39;AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaAgtgtatgtaaacttccgacttcaa cebador (la de la N representan el código de barras 12 pb, la secuencia en mayúsculas se requieren para la plataforma Illumina, y la secuencia en minúsculas se unirá al transposón.) Secundaria inversa PCR para el lado derecho e izquierdo: conector cebador anidado inversa 5 &#39;CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTAGGGCTCCGCTTAAGGGAC <ol><li> Recocer el + y - enlazadores para ambos enlazadores bfai y enlazadores NlaII mediante la mezcla de 50 l de enlazador + (100 mM) con 50 l de enlazador-(100 M) y añadir 2 l de NaCl (5 M) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Lugar en 95 ° C del bloque de calor durante 5 min. Apagar bloque de calentamiento y dejar enfriar lentamente a temperatura ambiente (esto tarda una hora o más). Después de enfriar, los enlazadores recocidas puede ser almacenado en un congelador a -20 ° C hasta que se necesite. </li><li> Preparar dos alícuotas de la ADN del tumor, cada parte alícuota que contenía 1 mg de ADN. Una alícuota será digerido ingenioha enzima de restricción que corte cerca de la &quot;derecha&quot; fin del transposón. La segunda alícuota se digiere con una enzima de restricción que corta cerca de la &quot;izquierda&quot; fin del transposón. Esto se hace para maximizar las posibilidades de amplificar cada sitio de inserción del transposón. </li><li> Digerir el ADN del tumor en una alícuota con el &quot;derecho&quot; NlaII enzima lado, y digerir el ADN del tumor en la parte alícuota que utilice el lado &quot;izquierdo&quot; enzima BFAI: mezcle 1 l de enzima, 5 l Buffer 10x NEB # 4, ADN ( 1 g) y ddH 2 O hasta un volumen total de 50 l. Digerir el ADN durante la noche a 37 ° C en baño de agua o incubadora. </li><li> Calentar inactivar enzimas (BFAI = 80 ° C durante 20 min, NlaIII = 65 ° C durante 20 min). </li><li> Limpiar las muestras digeridas por la colocación de muestras en MinElute placa de 96 pocillos, en lugar placa de colector de vacío y el vacío durante aproximadamente 15 min hasta que los pozos aspecto seco. </li><li> Retire la placa del distribuidor de vacío e inferior blot de placa de 96 pocillos con una toalla de papel para eliminar todo liquid </li><li> Añadir 30 l ddH 2 O a cada pocillo y agitar en un conjunto agitador orbital a temperatura alta durante 2 min, o pipetear arriba y abajo de 20 a 40 veces. </li><li> Traslado volumen total en los pozos (30 l) de MinElute placa de 96 pocillos en placas de 96 pocillos limpios. </li><li> Realizar reacciones de ligación enlazador con el ADN digerido de la etapa 4,8 y enlazadores de paso 4,1. Mezclar 10 l de ADN digerido, 4 l tampón de ligación 5x, 5,5 enlazadores mu l recocido (950 g / l), 0,5 l ligasa de T4 (5 U / l). </li><li> Incubar durante 4 horas a toda la noche a 16 ° C. </li><li> Calentar inactivar la ligasa de ADN de T4 a 65 ° C durante 10 min. </li><li> Limpie la ligadura con MinElute placas de 96 pocillos y un colector de vacío como se describe en los pasos 4,5 hasta 4,6. </li><li> Resuspender en 30 l H 2 O y traslado a un lugar limpio placa de 96 pocillos. </li><li> Realizar una segunda digestión del ADN con el fin de destruir restos concatémero transposones. Esto se consigue cortando el DNA una segunda vez usando una enzima que corta el plásmido vector ADN que se utilizó para crear los ratones transgénicos que contienen el transposón concatémero. </li><li> Digerir el ADN utilizando BamHI (lado izquierdo y derecho): Mezcla de 25 l de enlazador-ligated ADN de paso 4,13, 5 l tampón NEB 10x # 3, 0,5 l BamHI (20 U / l), 0,5 l de BSA (10 mg / ml ) y 19 l ddH 2 O. </li><li> Recopilación de 3-6 horas o durante la noche a 37 ° C. </li><li> Realizar primaria PCR utilizando un cebador específico para el transposón y un cebador específico para el enlazador. Estos pueden variar dependiendo de lo que transposón y el enlazador está utilizando. Los cebadores enumerados en la tabla por encima de cebador de trabajo para el T2/Onc y transposones T2/Onc2. </li><li> PCR primaria: 5 l tampón 10x, 2,0 l de MgCl2 (50 mM), 4 dNTPs mu l (2,5 nM), 1 l Cebador 1 (20 mM), 1 l Cebador 2 (20 mM), 0,25 l Platinum Taq (5 U / l), 3 l de ADN digerido con enlazadores (cantidad puede variar), hasta 50 l ddH 2 O. </li><li> Programa de PCR: 94 ° C durante 5 min, 30 ciclos de 94 ° C por 30 seg, 60 y dpor ejemplo, C por 30 seg, 72 ° C durante 90 sec. Extensión final a 72 ° C durante 5 min. </li><li> Limpiar producto de PCR usando MinElute placas de 96 pocillos y un colector de vacío como se describió anteriormente. </li><li> Resuspender en 30 l H 2 O y traslado a un lugar limpio placa de 96 pocillos. </li><li> Hacer una dilución 1:75 de la 1 ° PCR mediante la dilución de 2 l de ADN de la etapa 148 en 4,21 l ddH O 2 </li><li> Realizar PCR secundaria utilizando versiones de los cebadores anidados que también tienen la secuencia requerida para la máquina Illumina GAIIx así como un código de barras de base 12 par que es única para cada muestra de tumor de procesado (véase la tabla anterior cebador para ejemplos de estos cebadores). </li><li> PCR secundaria: 10 l Tampón 10x con MgCl2, 8 mu l dNTPs (2,5 mM), 1 l Illumina código de barras cebador secundario (20 mM), 1 Nest Illumina 1 l cebador secundario (20 mM), 0,25 l de Taq FastStart (5 U / l ), 2 l de ADN primarios 1:75 PCR diluido, hasta 100 l ddH 2 O. </li><li> Programa de PCR: 94 °; C durante 2 min, 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 53 ° C durante 45 segundos, 72 ° C durante 90 segundos. Extensión final a 72 ° C durante 5 min. </li><li> Ejecutar 45 l de esta reacción de PCR en un gel de agarosa al 1% que contiene bromuro de etidio (0,5 mg / ml). Debe haber una &quot;mancha&quot; de los productos de PCR que representan a los amplicones de inserciones de transposones muchos diferentes en el tumor (Figura 3). </li><li> Limpiar restante 50 l de producto de PCR utilizando MinElute placas de 96 pocillos y un colector de vacío como se describió anteriormente. Lavar una vez utilizando 50 l ddH 2 O en los pocillos y aspirar de nuevo. </li><li> Resuspender en 30 l de TE y transferir a una placa de 96 pocillos limpia. </li><li> Determinar la concentración de ADN en cada muestra. Combinar cantidades iguales de ADN en un solo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Esta será la biblioteca que se secuenciaron en un solo carril de una máquina Illumina HiSeq 2000. Es posible secuencia de varios cientos de tumores en un solo carril de una ejecución de Illumina. </li><li> Presentarel único tubo que contiene cantidades iguales de ADN de todos los tumores para la secuenciación. Esto se puede hacer por su institución o comercialmente. </li></ol> 5. Análisis de inserciones de transposones <ol><li> Software para el análisis de transposón inserción de datos está disponible para su descarga gratuita a través de SourceForge ( <a href="http://sourceforge.net/projects/tapdancebio/" target="_blank">http://sourceforge.net/projects/tapdancebio/</a> ). El programa, llamado Tapdance, requiere que el archivo de secuencia de la plataforma Illumina y un código de barras a un archivo de texto plano biblioteca. </li></ol>

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<li>Wood, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genomic+Landscapes+of+Human+Breast+and+Colorectal+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers.</a> Science. 318, 1108-1113 (2007).</li>
<li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvák, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Reconstruction+of+Sleeping+Beauty%2C+a+Tc1-like+Transposon+from+Fish%2C+and+Its+Transposition+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells.</a> Cell. 91, 501-510 (1997).</li>
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<li>Starr, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-based+genetic+screen+in+mice+identifies+genes+altered+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer.</a> Science. 323, 1747-1750 (2009).</li>
<li>Keng, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+transposon-based+insertional+mutagenesis+screen+for+genes+associated+with+mouse+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conditional transposon-based insertional mutagenesis screen for genes associated with mouse hepatocellular carcinoma.</a> Nature. 27, 264-274 (2009).</li>
<li>Dupuy, A. J., Akagi, K., Largaespada, D. A., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+mutagenesis+using+a+highly+mobile+somatic+Sleeping+Beauty+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian mutagenesis using a highly mobile somatic Sleeping Beauty transposon system.</a> Nature. 436, 221-226 (2005).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Una pantalla hacia delante genética utilizando la Bella Durmiente transposón sistema proporciona un método para la identificación de las mutaciones que causan cáncer. Mediante la selección del promotor apropiado para controlar la recombinasa Cre en adición a cualquier mutaciones que predisponen, la pantalla SB identificará conocidos y nuevos genes candidatos cáncer. El éxito de una pantalla SB depende en gran medida de los ratones seleccionados para la creación de la pantal...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Sure-Seal inducción Cámara </td><td> Brain Tree Científico </td><td> EZ-177 </td><td></td></tr><tr><td> Criovial </td><td> BioExpress </td><td> C-3355-2 </td><td></td></tr><tr><td> 10% formalina tamponada </td><td> Sigma Aldrich </td><td> HT501128-4L </td><td></td></tr><tr><td> Proteína solución de precipitación </td><td> Qiagen </td><td> 158910 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón de lisis celular </td><td> Qiagen </td><td> 158906 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinasa K </td><td> Qiagen </td><td> 158920 </td><td></td></tr><tr><td> RNasa A </td><td> Qiagen </td><td> 158924 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón TE </td> &lt;td&gt; Promega </td><td> V6232 </td><td></td></tr><tr><td> BFAI </td><td> New England Biolabs </td><td> R0568S </td><td></td></tr><tr><td> NlaIII </td><td> New England Biolabs </td><td> R0125S </td><td></td></tr><tr><td> MinElute placas de 96 pocillos </td><td> Qiagen </td><td> 28051 </td><td></td></tr><tr><td> QIAvac 96 Vacuum manifold </td><td> Qiagen </td><td> 19504 </td><td></td></tr><tr><td> Múltiples microplaca Genie, 120V </td><td> Scientific Industries, Inc. </td><td> SI-4000 </td><td></td></tr><tr><td> ADN ligasa de T4 con tampón de ligación 5x </td><td> Invitrogen </td><td> 15224-041 </td><td></td></tr><tr><td> BamHI </td><td> New England Biolabs </td><td> R0136S </td><td></td></tr><tr><td> DNTPs 25 mM </td><td> BioExpress </td><td> C-5014-200 </td><td></td></tr><tr><td> Platinum Taq </td><td> Invitrogen </td><td&gt; 10966-034 </td><td></td></tr><tr><td> FastStart Taq ADN polimerasa </td><td> Roche </td><td> 12032929001 </td><td></td></tr><tr><td> Agarosa </td><td> Promega </td><td> V3121 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón TAE </td><td> Promega </td><td> V4271 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón TE </td><td> Promega </td><td> V6232 </td><td></td></tr><tr><td> El bromuro de etidio </td><td> Promega </td><td> H5041 </td><td></td></tr></tbody></table>

identificación de los<em&gt; la bella durmiente</em&gt; transposón inserciones en tumores sólidos utilizando vinculador mediada por pcr

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Los análisis genómicos, proteómicos, transcriptómica y epigenómico de tumores humanos indican que hay miles de anomalías dentro de cada genoma del cáncer en comparación con el tejido normal correspondiente. Sobre la base de estos análisis es evidente que hay muchos conductores no descubiertos genéticas del cáncer 1. Lamentablemente, estos conductores están ocultos dentro de un número mucho mayor de anomalías de pasajeros en el genoma que no contribuyen directamente a la formación de tumores. Otro aspecto del genoma del cáncer es que hay una considerable heterogeneidad genética dentro de similares tipos de tumores. Cada tumor pueden albergar diferentes mutaciones que proporcionan una ventaja selectiva para la formación de tumor 2. Realización de una pantalla hacia delante imparcial genética en ratones proporciona las herramientas para generar tumores y analizar su composición genética, mientras que la reducción del fondo de mutaciones de pasajeros. La Bella Durmiente (SB) transposón sistema es uno de esos métodos 3. El sistema utiliza SB móvil vectores (transposones) que se pueden insertar en el genoma de la enzima transposasa. Las mutaciones se limitan a un tipo específico de célula mediante el uso de un alelo condicional transposasa que se activa por la recombinasa Cre. Muchas líneas de ratón que expresan existen recombinasa Cre en tejidos específicos. Al cruzar una de estas líneas con el alelo transposasa condicional (por ejemplo, Lox-stop-Lox-SB11), el sistema SB se activa sólo en las células que expresan la recombinasa Cre. La recombinasa Cre extirpará una casete de tope que bloquea la expresión del alelo de la transposasa, activando de este modo mutagénesis de transposones en el tipo de célula designada. Una pantalla SB es iniciada por la cría de tres cepas de ratones transgénicos para que los ratones experimentales llevar un alelo condicional transposasa, un concatémero de transposones, y un alelo específico de tejido de recombinasa Cre. Estos ratones se dejaron envejecer hasta que se forman los tumores y se convierten moribundo. Los ratones son luegoADN genómico practicó la necropsia y se aísla de los tumores. A continuación, el ADN genómico se somete a enlazador mediada-PCR (LM-PCR) que resulta en la amplificación de loci genómicos que contienen un transposón SB. LM-PCR realizada en un solo tumor se traducirá en cientos de amplicones diferentes que representan a los cientos de loci genómicos que contienen inserciones de transposones en un solo tumor 4. Las inserciones de transposones en todos los tumores son analizados y los sitios comunes de inserción (IIC) se identifican usando un método estadístico adecuado 5. Los genes dentro de la CEI es muy probable que sea oncogenes o genes supresores de tumores, y se consideran los genes candidatos cáncer. Las ventajas de utilizar el sistema de SB para identificar genes candidatos cáncer son: 1) el transposón puede ser fácilmente localizado en el genoma, ya que su secuencia es conocida, 2) transposición se puede dirigir a casi cualquier tipo de célula y 3) el transposón es capaz de introduciendo al mismo tiempo de ganancia y pérdida de función de las mutaciones 6. El following protocolo describe cómo diseñar y ejecutar una pantalla hacia delante genético utilizando el sistema de transposón SB para identificar genes candidatos cáncer (Figura 1).

Después de que el método de obtención se ha establecido, los criadores deben producir una camada cada 19-21 días. Tamaño de la camada puede variar entre 5 y 12 crías, dependiendo de la edad de los criadores y el fondo genético. Además, asegúrese de que el genotipo de la camada siguiente genética mendeliana como una manera de confirmar que el método de obtención es a la vez correcta y exitosa. Para el experimento para tener éxito, la incidencia de tumores en los animales experimentales debe s...

Un método de identificación de conductores desconocidos de la carcinogénesis utilizando un enfoque imparcial se describe. El método utiliza el<em&gt; La Bella Durmiente</em&gt; Transposón como un mutágeno aleatorio dirigido a tejidos específicos. Mapeo genómico de inserciones de transposones que impulsan la formación de tumores identifica nuevos oncogenes y genes supresores tumorales

Identificación de los<em&gt; La Bella Durmiente</em&gt; Transposón inserciones en tumores sólidos utilizando vinculador mediada por PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Este procedimiento muestra cómo identificar nuevos oncogenes y genes supresores de tumores mediante el mapeo de la transposición en las inserciones en el ratón que impulsan la formación de tumores. Esto se logra primero generando y cosechando tumores a partir del modelo de ratón transgénico. Los siguientes pasos del procedimiento son aislar el ADN del tumor, realizar una PCR mediada por un enlazador, luego secuenciar las muestras de ADN amplificadas y analizar la transposición en las inserciones.En última instancia, el procedimiento identifica los genes impulsores de tumores candidatos. La principal ventaja de utilizar la PCR mediada por enlazador junto con un cribado genético imparcial que utiliza transposones de la bella durmiente, es que podemos identificar fácilmente nuevos impulsores genéticos del cáncer. Comience siempre la disección rociando el exterior del ratón sacrificado con etanol al 70%.Los tejidos y tumores recolectados deben dividirse en cuatro secciones, de 50 a 100 miligramos de tamaño. Fije una sección en formina tamponada al 10% durante 18 horas, seguida de etanol al 70%. Esta sección se puede utilizar para la tinción h y e, o para la inmunohistoquímica.Congele las secciones restantes en nitrógeno líquido. Estos se pueden almacenar en un congelador y usar para el D-N-A-R-N-A y el aislamiento de proteínas para recolectar ADN de una muestra tumoral congelada. Primero pica finamente el pañuelo con una cuchilla de afeitar.A continuación, digiere el tejido en un tubo de 1,5 mililitros con un mililitro de tampón de lisis celular y cinco microlitros de 20 miligramos por mililitro. La solución de proteasa K vórtice la mezcla a fondo y proceda con una extracción de ADN estándar basada en isopropanol. Comience este protocolo recociendo los enlazadores en un tubo de 1,5 mililitros.Mezcle 50 microlitros de cada solución de enlace con dos microlitros de cloruro de sodio concentrado. Luego coloque el tubo en un bloque de calor a 95 grados centígrados. Después de cinco minutos, apague el fuego y deje que se enfríe lentamente a temperatura ambiente, lo que puede tardar una hora o más después de enfriarse.Los enlazadores anales se pueden almacenar en el congelador hasta que se necesiten. Prepare 2 placas de 96 pocillos de Ali citando un microgramo de ADN de cada muestra en los pocillos correspondientes en ambas placas de 96 pocillos. Por ejemplo, coloque un microgramo de ADN de la muestra uno en el pocillo A, una de las dos placas de pocillos.El ADN en una de las placas de 96 pocillos se digerirá usando la enzima NLA tres del lado derecho y digerirá las muestras de ADN en la otra placa de 96 pocillos usando la enzima BFA uno del lado izquierdo. Deje que el ADN se digiera durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, terminar la digestión con calor, inactivando las enzimas durante 20 minutos.Ahora limpie las reacciones de digestión con una placa de 96 pocillos mini loot. Con la pipeta multicanal, transfiera cada muestra al mini botín. Placa de 96 pocillos.Coloque la placa de pocillos mini loot 96 en un colector de vacío. Aplique una aspiradora a la placa hasta que los pozos se vean secos. Por lo general, 15 minutos a lo largo de este protocolo.Se debe tener mucho cuidado de no contaminar las muestras. Cuando se trabaja con 96, las placas de pocillos mantienen los pocillos cubiertos con tapas tanto como sea posible y evitan pasar la pipeta sobre pocillos abiertos porque cualquier gota de líquido no deseado puede arruinar la muestra. Retire la mini placa de botín del colector de vacío y bloquee la parte inferior de la placa con una toalla de papel hasta que esté completamente seca.Vuelva a suspender el ADN en la placa de 96 pocillos del mini botín agregando 30 microlitros de agua destilada doble a cada uno. Bueno, coloque la mini placa de botín en un agitador orbital configurado a alto durante dos minutos.A continuación, transfiera el contenido de la mini placa de botín a una placa limpia de 96 pocillos. Para realizar las reacciones de ligadura del enlazador. Prepare la reacción de ligadura mezclando una cantidad suficiente de tampón de ligadura, un enlazador arrodillado del paso 3.2 T cuatro ligasa de ADN y agua en un depósito de reactivo.Utilice una pipeta multicanal para transferir 10 microlitros de ADN digerido del paso anterior a una nueva placa de 96 pocillos. A continuación, utilice una pipeta multicanal para Eloqua 10 microlitros de la reacción de ligadura a todos los pocillos de la placa de 96 pocillos. Después de todo, los pozos han sido cargados con ADN y reactivos de ligadura.Incubar la placa durante cuatro horas o toda la noche a 16 grados centígrados. A la mañana siguiente. Finalice la ligadura inactivando la T four ligasa a 65 grados centígrados durante 10 minutos.Al igual que antes, limpie la reacción de ligadura con mini placas de botín y un colector de vacío para secar la placa y luego seque la parte inferior de la placa hasta que esté completamente seca. Resuspender el ADN en 30 microlitros de agua bidestilada. Colóquelo en un agitador orbital durante dos minutos y luego transfiera el contenido de la mini placa de botín a una placa limpia.A continuación, realice una segunda digestión de ADN con bam H uno para destruir los transposones concatados restantes. Digiera el ADN a 37 grados centígrados durante tres a seis horas o toda la noche, y luego la digestión se limpia usando mini placas de botín siguiendo el mismo procedimiento que antes. Realice una PCR de 30 ciclos utilizando un cebador específico para la transposición y un cebador específico para el enlazador.La reacción debe contener tres microlitros del ADN digerido con enlazadores. A continuación, limpie la reacción de PCR usando un mini botín. 96 placas de pocillos y un colector de vacío como se realizaba anteriormente.Vuelva a suspender el ADN en 30 microlitros de agua y transfiera las suspensiones a un 96 limpio. Bien jugado, proceda diluyendo dos microlitros de los productos de reacción de PCR en 148 microlitros de agua bidestilada utilizando solo dos microlitros de los productos diluidos. Realice PCR de 30 ciclos utilizando versiones anidadas de los cebadores en volúmenes de 100 microlitros.Estos cebadores son para la máquina Illumina GA two X. Cada muestra tendrá un código de barras único de 12 pares de bases de la ejecución de PCR, 45 microlitros de cada producto en un gel al 1% con bromuro AUM. Debe haber un frotis de productos de PCR que representen amplicones de las diferentes inserciones de transposones en el tumor.Utilice el método de lavado al vacío descrito anteriormente para limpiar los 50 microlitros restantes de PCR, luego vuelva a suspender el ADN en 50 microlitros de agua y vuelva a realizar el lavado al vacío. Ahora Resus, suspende el ADN en 30 microlitros de TE y transfiérelo a una placa limpia de 96 pocillos. Determinar la concentración de ADN en cada muestra.A continuación, combine cantidades iguales de ADN de cada muestra en un solo tubo. Es posible secuenciar varios cientos de muestras de ADN en un solo carril de una tirada de Illumina, siempre y cuando cada muestra se haya generado utilizando un cebador con código de barras distinto utilizando el protocolo. Un L-M-P-C-R exitoso debería amplificar cientos de transposiciones en inserciones en un solo tumor después de ejecutar la mitad del producto de PCR secundario en un gel al 1%, un frotis de ADN representa esta amplificación.Si la PCR LM no tiene éxito, habrá una ausencia del frotis de ADN. En su lugar, verá bandas definitivas de secuenciación de ADN de uno a 200 tumores en un solo carril de la plataforma Illumina GA two X que debería producir más de 30 millones de secuencias de 100 pares de bases cada una mientras intenta este procedimiento. Es importante recordar que debe trabajar lenta y cuidadosamente para asegurarse de que no se produzca contaminación después de este procedimiento.El análisis de los impulsores genéticos del cáncer recientemente descubiertos se puede realizar para responder preguntas adicionales como, ¿cuáles de estos impulsores podrían ser objeto de terapia?

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