Identificación de los La Bella Durmiente Transposón inserciones en tumores sólidos utilizando vinculador mediada por PCR
1 de febrero de 2013
Un método de identificación de conductores desconocidos de la carcinogénesis utilizando un enfoque imparcial se describe. El método utiliza el La Bella Durmiente Transposón como un mutágeno aleatorio dirigido a tejidos específicos. Mapeo genómico de inserciones de transposones que impulsan la formación de tumores identifica nuevos oncogenes y genes supresores tumorales
Este procedimiento muestra cómo identificar nuevos oncogenes y genes supresores de tumores mediante el mapeo de la transposición en las inserciones en el ratón que impulsan la formación de tumores. Esto se logra primero generando y cosechando tumores a partir del modelo de ratón transgénico. Los siguientes pasos del procedimiento son aislar el ADN del tumor, realizar una PCR mediada por un enlazador, luego secuenciar las muestras de ADN amplificadas y analizar la transposición en las inserciones.
En última instancia, el procedimiento identifica los genes impulsores de tumores candidatos. La principal ventaja de utilizar la PCR mediada por enlazador junto con un cribado genético imparcial que utiliza transposones de la bella durmiente, es que podemos identificar fácilmente nuevos impulsores genéticos del cáncer. Comience siempre la disección rociando el exterior del ratón sacrificado con etanol al 70%.
Los tejidos y tumores recolectados deben dividirse en cuatro secciones, de 50 a 100 miligramos de tamaño. Fije una sección en formina tamponada al 10% durante 18 horas, seguida de etanol al 70%. Esta sección se puede utilizar para la tinción h y e, o para la inmunohistoquímica.
Congele las secciones restantes en nitrógeno líquido. Estos se pueden almacenar en un congelador y usar para el D-N-A-R-N-A y el aislamiento de proteínas para recolectar ADN de una muestra tumoral congelada. Primero pica finamente el pañuelo con una cuchilla de afeitar.
A continuación, digiere el tejido en un tubo de 1,5 mililitros con un mililitro de tampón de lisis celular y cinco microlitros de 20 miligramos por mililitro. La solución de proteasa K vórtice la mezcla a fondo y proceda con una extracción de ADN estándar basada en isopropanol. Comience este protocolo recociendo los enlazadores en un tubo de 1,5 mililitros.
Mezcle 50 microlitros de cada solución de enlace con dos microlitros de cloruro de sodio concentrado. Luego coloque el tubo en un bloque de calor a 95 grados centígrados. Después de cinco minutos, apague el fuego y deje que se enfríe lentamente a temperatura ambiente, lo que puede tardar una hora o más después de enfriarse.
Los enlazadores anales se pueden almacenar en el congelador hasta que se necesiten. Prepare 2 placas de 96 pocillos de Ali citando un microgramo de ADN de cada muestra en los pocillos correspondientes en ambas placas de 96 pocillos. Por ejemplo, coloque un microgramo de ADN de la muestra uno en el pocillo A, una de las dos placas de pocillos.
El ADN en una de las placas de 96 pocillos se digerirá usando la enzima NLA tres del lado derecho y digerirá las muestras de ADN en la otra placa de 96 pocillos usando la enzima BFA uno del lado izquierdo. Deje que el ADN se digiera durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, terminar la digestión con calor, inactivando las enzimas durante 20 minutos.
Ahora limpie las reacciones de digestión con una placa de 96 pocillos mini loot. Con la pipeta multicanal, transfiera cada muestra al mini botín. Placa de 96 pocillos.
Coloque la placa de pocillos mini loot 96 en un colector de vacío. Aplique una aspiradora a la placa hasta que los pozos se vean secos. Por lo general, 15 minutos a lo largo de este protocolo.
Se debe tener mucho cuidado de no contaminar las muestras. Cuando se trabaja con 96, las placas de pocillos mantienen los pocillos cubiertos con tapas tanto como sea posible y evitan pasar la pipeta sobre pocillos abiertos porque cualquier gota de líquido no deseado puede arruinar la muestra. Retire la mini placa de botín del colector de vacío y bloquee la parte inferior de la placa con una toalla de papel hasta que esté completamente seca.
Vuelva a suspender el ADN en la placa de 96 pocillos del mini botín agregando 30 microlitros de agua destilada doble a cada uno. Bueno, coloque la mini placa de botín en un agitador orbital configurado a alto durante dos minutos.
A continuación, transfiera el contenido de la mini placa de botín a una placa limpia de 96 pocillos. Para realizar las reacciones de ligadura del enlazador. Prepare la reacción de ligadura mezclando una cantidad suficiente de tampón de ligadura, un enlazador arrodillado del paso 3.2 T cuatro ligasa de ADN y agua en un depósito de reactivo.
Utilice una pipeta multicanal para transferir 10 microlitros de ADN digerido del paso anterior a una nueva placa de 96 pocillos. A continuación, utilice una pipeta multicanal para Eloqua 10 microlitros de la reacción de ligadura a todos los pocillos de la placa de 96 pocillos. Después de todo, los pozos han sido cargados con ADN y reactivos de ligadura.
Incubar la placa durante cuatro horas o toda la noche a 16 grados centígrados. A la mañana siguiente. Finalice la ligadura inactivando la T four ligasa a 65 grados centígrados durante 10 minutos.
Al igual que antes, limpie la reacción de ligadura con mini placas de botín y un colector de vacío para secar la placa y luego seque la parte inferior de la placa hasta que esté completamente seca. Resuspender el ADN en 30 microlitros de agua bidestilada. Colóquelo en un agitador orbital durante dos minutos y luego transfiera el contenido de la mini placa de botín a una placa limpia.
A continuación, realice una segunda digestión de ADN con bam H uno para destruir los transposones concatados restantes. Digiera el ADN a 37 grados centígrados durante tres a seis horas o toda la noche, y luego la digestión se limpia usando mini placas de botín siguiendo el mismo procedimiento que antes. Realice una PCR de 30 ciclos utilizando un cebador específico para la transposición y un cebador específico para el enlazador.
La reacción debe contener tres microlitros del ADN digerido con enlazadores. A continuación, limpie la reacción de PCR usando un mini botín. 96 placas de pocillos y un colector de vacío como se realizaba anteriormente.
Vuelva a suspender el ADN en 30 microlitros de agua y transfiera las suspensiones a un 96 limpio. Bien jugado, proceda diluyendo dos microlitros de los productos de reacción de PCR en 148 microlitros de agua bidestilada utilizando solo dos microlitros de los productos diluidos. Realice PCR de 30 ciclos utilizando versiones anidadas de los cebadores en volúmenes de 100 microlitros.
Estos cebadores son para la máquina Illumina GA two X. Cada muestra tendrá un código de barras único de 12 pares de bases de la ejecución de PCR, 45 microlitros de cada producto en un gel al 1% con bromuro AUM. Debe haber un frotis de productos de PCR que representen amplicones de las diferentes inserciones de transposones en el tumor.
Utilice el método de lavado al vacío descrito anteriormente para limpiar los 50 microlitros restantes de PCR, luego vuelva a suspender el ADN en 50 microlitros de agua y vuelva a realizar el lavado al vacío. Ahora Resus, suspende el ADN en 30 microlitros de TE y transfiérelo a una placa limpia de 96 pocillos. Determinar la concentración de ADN en cada muestra.
A continuación, combine cantidades iguales de ADN de cada muestra en un solo tubo. Es posible secuenciar varios cientos de muestras de ADN en un solo carril de una tirada de Illumina, siempre y cuando cada muestra se haya generado utilizando un cebador con código de barras distinto utilizando el protocolo. Un L-M-P-C-R exitoso debería amplificar cientos de transposiciones en inserciones en un solo tumor después de ejecutar la mitad del producto de PCR secundario en un gel al 1%, un frotis de ADN representa esta amplificación.
Si la PCR LM no tiene éxito, habrá una ausencia del frotis de ADN. En su lugar, verá bandas definitivas de secuenciación de ADN de uno a 200 tumores en un solo carril de la plataforma Illumina GA two X que debería producir más de 30 millones de secuencias de 100 pares de bases cada una mientras intenta este procedimiento. Es importante recordar que debe trabajar lenta y cuidadosamente para asegurarse de que no se produzca contaminación después de este procedimiento.
El análisis de los impulsores genéticos del cáncer recientemente descubiertos se puede realizar para responder preguntas adicionales como, ¿cuáles de estos impulsores podrían ser objeto de terapia?
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Descripción general
Este artículo describe un método para identificar oncogenes y genes supresores de tumores novedosos mediante la localización de inserciones de transposones en un modelo murino. El enfoque utiliza el transposón Sleeping Beauty como agente mutagénico aleatorio, lo que permite el descubrimiento de factores genéticos implicados en el desarrollo del cáncer.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Carcinogénesis
- Mapa genómico
- Biología de los transposones
Antecedentes
- La carcinogénesis implica alteraciones genéticas complejas.
- Los transposones pueden servir como herramientas para la mutagénesis.
- La identificación de genes conductor es crucial para comprender el cáncer.
- La PCR mediada por adaptadores mejora la detección de inserciones de transposones.
Objetivo del estudio
- Identificar factores desconocidos que inducen la formación de tumores.
- Utilizar un enfoque de cribado genético sin sesgo.
- Mapear las inserciones de transposones en el ADN tumoral.
Métodos Utilizados
- Generación de tumores en un modelo de ratón transgénico.
- Aislamiento de ADN tumoral de tumores recolectados.
- PCR mediada por adaptadores para amplificar muestras de ADN.
- Secuenciación y análisis de inserciones de transposones.
Resultados principales
- Identificación de genes candidatos conductores de tumores.
- Se descubrieron oncogenes y genes supresores tumorales novedosos.
- El método demostró ser efectivo en el mapeo de alteraciones genéticas.
Conclusiones
- El transposón Sleeping Beauty es una herramienta valiosa para la investigación del cáncer.
- Este método permite la identificación imparcial de los factores genéticos causantes.
- Estudios futuros pueden basarse en estos hallazgos para explorar los mecanismos del cáncer.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La identificación de los factores genéticos responsables del cáncer sigue siendo un desafío fundamental en las fases iniciales de descubrimiento debido al alto ruido de fondo provocado por mutaciones pasajeras. El sistema de transposón Sleeping Beauty combinado con PCR mediada por adaptador permite realizar pantallas genéticas directas imparciales en ratones para identificar genes candidatos oncogénicos y genes supresores tumorales. Este enfoque facilita la validación de dianas al reducir la ambigüedad mecanicista y mejorar la confianza predictiva en modelos preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante mutagénesis funcional in vivo.
- Valor operativo: Dirige la transposición a tipos celulares específicos utilizando sistemas Cre-lox para la validación de dianas tisulares específicas.
- Valor predictivo: Identifica genes dentro de sitios comunes de inserción como conductores de cáncer de alta confianza para la clasificación de carteras.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Listo para ensayo: Genera cientos de amplicones distintos por tumor que representan sitios de inserción del transposón para análisis posteriores.
- Reproducibilidad: Utiliza pasos estandarizados de PCR mediada por enlazador y PCR anidada para garantizar una detección consistente entre muestras.
- Escalabilidad: Permite la secuenciación multiplexada de cientos de muestras de tumores en una sola vía de Illumina mediante cebadores con códigos de barras.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela la heterogeneidad genética observada en tumores humanos mediante la captura de diversos perfiles de inserción en múltiples tumores.
- Continuidad traslacional: Vincula la mutagénesis en fase de descubrimiento con la validación preclínica al identificar genes susceptibles de ser blanco de terapias.
- Reducción del riesgo mecanicista: Distingue entre mutaciones conductoras y pasajeras mediante el análisis estadístico de sitios comunes de inserción.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la generación de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos activos, al proporcionar dianas validadas genéticamente a partir de ensayos in vivo.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante cribados genéticos directos imparciales que reducen el ruido de fondo proveniente de mutaciones pasajeras.
- Cribado: Proporciona muestras de ADN listas para ensayos con resultados cuantitativos adecuados para la localización de sitios de inserción y secuenciación.
- Análisis: Permite la identificación estadística de sitios comunes de inserción para priorizar genes candidatos implicados en el cáncer.
- Investigación Traducional: Conecta la mutagénesis in vivo con la validación de objetivos al revelar genes con relevancia terapéutica potencial.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para cribados genéticos en múltiples modelos de cáncer y tipos de tejidos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza en la validación de dianas al vincular inserciones de transposones con el potencial tumorigénico.
- Valor operativo: Estandariza la detección de inserciones de transposones mediante protocolos optimizados de PCR mediada por adaptadores.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar evidencia funcional in vivo para la priorización de dianas.
- Impacto en la cartera: Apoya el avance ajustado al riesgo al distinguir genes conductoras del fondo genómico.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en genética de ratones, biología de transposones y técnicas de biología molecular.
- Depende del acceso a equipos de PCR, electroforesis en gel y plataformas de secuenciación.
- Necesita protocolos estandarizados para el aislamiento de ADN, hibridación de adaptadores y digestión enzimática en todos los conjuntos de muestras.
- Incluye consideraciones de adaptación al aplicar el sistema a diferentes líneas conductoras de Cre o modelos de tumores.
- Comprende limitaciones prácticas, como la necesidad de obtener una cantidad suficiente de tumor y evitar cuidadosamente la contaminación cruzada durante el procesamiento de múltiples pasos.
