Aislar y inmunoticción Los linfocitos y las células dendríticas de las placas de Peyer murinas de

El objetivo general de este procedimiento es aislar e inmunoteñir linfocitos y células dendríticas de parches de neuronas pagadoras, utilizando dos enfoques experimentales paralelos. Primero, los impuestos especiales parches frescos de los pagadores del ratón, el intestino delgado. A continuación, disocie físicamente los parches del pagador, recoja el tejido y páselo a través de un filtro de malla para generar una suspensión de una sola célula para el análisis de citometría de flujo.

Coseche las células por centrifugación y distribuya las alícuotas en una placa inferior redonda de 96 pocillos. A continuación, etiquete las células con anticuerpos contra marcadores de superficie específicos del tipo de célula. Proceda inmediatamente al análisis de citometría de flujo para enumerar los tipos específicos de células: en paralelo, aísle los parches del pagador y congele las muestras de tejido.

En bloques OCT, sección criogénica, las muestras se etiquetan con anticuerpos contra marcadores de superficie específicos del tipo de célula y luego se visualizan mediante microscopía láser de barrido confocal en conjunto. Estos métodos cuantificarán las células B, las células T y las células dendríticas en compartimentos específicos dentro de los tejidos del parche del pagador. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque los tejidos del parche de PI son extremadamente frágiles y pueden dañarse fácilmente.

Durante la manipulación. Coloque el intestino delgado recién aislado sobre una cama de toallas de papel húmedas o toallitas húmedas. A continuación, humedezca suavemente el intestino delgado con solución salina para evitar la deshidratación de los tejidos.

Ahora, identifique visualmente los parches individuales de los pagadores ubicados en el lado antimesentérico del intestino. Por lo general, un solo ratón tiene de cinco a 10 parches de pago visibles que se distribuyen uniformemente desde el duodeno hasta el íleon. El uso de tijeras quirúrgicas curvas generalmente extirpa los parches del pagador individual.

Colóquelos en una solución fría de clasificación de equilibrio de madeja, manteniendo el tejido a cuatro grados centígrados para preservar la viabilidad celular. A continuación, transfiera los parches del pagador a cinco mililitros de medio de disociación del bazo y agite a 250 RPM durante 15 a 20 minutos a 37 grados centígrados. Luego, para generar una suspensión de una sola célula, coloque la muestra en un colador de células de malla de nailon estéril de 70 micras y muela a la fuerza el tejido en la malla usando la base de un émbolo de una jeringa de un cc para eliminar los agregados celulares restantes.

Decantar la suspensión celular a través de una segunda celda de 70 micras, colar y recoger las células en un tubo cónico de 15 o 50 mililitros. Dispense de 10 a las cinco celdas por pocillo en una celda de pellets de placa inferior redonda de 96 pocillos por centrifugación durante cinco minutos a 1000 veces. G.A continuación, decantar el sobrenadante invirtiendo suavemente la placa.

Ahora vuelva a suspender las células en el tampón de bloques FC e incube en hielo durante 15 minutos. A continuación, añada anticuerpos conjugados con flúor directamente a las suspensiones celulares en la dilución deseada e incube en células de lavado con hielo con 100 microlitros de tampón de flujo. A continuación, vuelva a suspender las células en 400 microlitros de tampón de fijación para analizar las células mediante citometría de flujo y aislar los parches de los pagadores para la criosección.

Corte segmentos transversales de 0,5 centímetros del intestino delgado que contengan un solo parche de pagador. Transfiera el tejido a una placa de Petri que contenga PBS. A continuación, coloque los segmentos de tejido intestinal verticalmente dentro de moldes base que contengan OCT.

Sumerge los moldes en nitrógeno líquido y deja que el tejido se congele por completo. Retire los moldes de base congelados del nitrógeno líquido con pinzas. Deje que el molde se caliente a temperatura ambiente el tiempo suficiente para que los bordes del bloque OCT se ablanden.

A continuación, retire el bloque congelado de OCT del molde. Invierta el molde y presione suavemente en la parte posterior para expulsar el bloque sobre una pieza limpia de papel de aluminio de cuatro por cuatro centímetros. Envuelva inmediatamente el tejido en el papel de aluminio y colóquelo en una bolsa de muestras etiquetada almacenada en nitrógeno líquido o en crioterapia de hielo seco, corte el tejido utilizando un microtomo criogénico LI a CM 3 0 5 0 s o equivalente.

Ajuste la temperatura de la cámara del criostato a menos 21 grados centígrados. Lo ideal es cortar secciones de 12 a 14 micras de grosor. Recoja las secciones en portaobjetos de microscopio de vidrio Supercross plus.

Inspeccione las muestras visualmente con un microscopio óptico estándar de baja potencia. Sumerge los portaobjetos en acetona durante dos minutos. Tenga en cuenta que la incubación prolongada puede hacer que los tejidos se desprendan del portaobjetos.

Lave las muestras tres veces con PBST. A continuación, rodea las secciones con un rotulador hidrofóbico para imágenes. Ahora incube las muestras en tampón de bloques, superponga las secciones de tejido con una solución de anticuerpos primarios.

Seque el área alrededor de las secciones con toallitas Kim u otro pañuelo absorbente sin tocar las secciones de tejido reales. Con una pipeta o un gotero, coloque suavemente una gota de medio de montaje de oro prolongado directamente sobre la sección. Aplique un cubreobjetos de vidrio, evitando las burbujas de aire y secando cualquier exceso de montaje.

El análisis por fax medio de suspensiones monodispersas de células parche de pagadores totales revela una clara distinción entre preparaciones celulares buenas y malas en preparaciones celulares buenas. Con más del 80% de viabilidad, la gran mayoría de las celdas muestran una alta dispersión hacia adelante, lo que indica un alto volumen de celdas y una baja dispersión lateral consistente con una baja granularidad de celdas. En este experimento, la mala preparación de las células se preparó deliberadamente para demostrar que en una población mala, la mayoría de las células exhiben un FSC bajo, un SSC alto y están fuera de la marcha R indicada.

Es probable que estas células estén sufriendo apoptosis y/o necrosis. Aquí un cóctel de hasta cuatro Fluor diferentes. Cuatro anticuerpos monoclonales conjugados para discriminar entre una variedad de tipos de células.

En los parches de pago se utilizaron suspensiones de células únicas, marcándolas con un grupo de marcadores de diferenciación. CD 19 y B 20 revelan que las células B constituyen alrededor del 60% de los pagadores cerrados. Los subconjuntos de células T específicos de la población de células parche se pueden enumerar fácilmente mediante doble marcaje con anticuerpos contra las células T CD tres y CD cuatro, o CD tres y CD ocho, CD cuatro positivas y CD ocho positivas constituyen aproximadamente el 23% y el 9% respectivamente del total de células parche pagadoras.

Los subconjuntos de DC, que serían CD 11 C positivo y CD 1 0 3 positivos, también se pueden enumerar mediante este método. Los CD 11 C positivos contribuyen a aproximadamente el 8% de la población total cerrada, lo que equivale aproximadamente a 10.000 CD por parche de pagador. Entre la población de células C C positivas, aproximadamente el 4,7% eran dos veces positivas para B y 20 positivas.

Se obtienen resultados similares cuando se recogen células parcheadas de los pagadores de ratones C 57 black six. Las preparaciones celulares deficientes pueden conducir a resultados muy engañosos, en gran parte porque las células muertas o moribundas tienden a unirse a los anticuerpos de manera inespecífica. Por lo general, estos conducen a una sobrerrepresentación de células B 2 2 0 positivas y CD tres positivas dobles positivas, así como B dos 20 células B positivas y CD cuatro células T positivas dobles positivas.

Las secciones criogénicas de los parches de los pagadores de ratones son susceptibles de análisis histopatológico, así como de etiquetado inmunológico. Mientras que la potencia de las secciones in proporciona más resolución a nivel celular cuando se tiñe con h y e, las zonas claras y oscuras de los centros germinales del parche de los pagadores se delimitan más fácilmente en las secciones de sección criogénica. En esta sección criogénica típica de los pagadores, los anticuerpos anti CD tres, etiquetan las células T contra los anticuerpos CD 11 C.

Destacan las células dendríticas y los anticuerpos anti B 20. Destacar las células B después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo comprendieran cómo tipos específicos de células, como las células dendríticas, dentro de los tejidos linfoides asociados al intestino responden a los antígenos intestinales y a los patógenos microbianos.

Esta información ha influido en el diseño y desarrollo de vacunas para las mucosas.