Name: Inyección estereotáctica de microARN que expresan lentivirus al ratón hipocampo CA1 Región y evaluación de los resultados del comportamiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprende a inyectar lentivirus que expresan microARN en la región CA1 del hipocampo de ratones mediante estereotaxia. Este método permite evaluar efectos cognitivos y estudiar funciones neurológicas con control espacial y temporal preciso.

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Este estudio ha sido financiado por el Centro de Edmond Safra y Lily para las Ciencias del Cerebro (SB comunión), The Heritage Biomédica Programa de Asociación de Ciencia legado de la Israel Science Foundation (Grant N º 378/11, a HS) y la Fundación Alemana para la Ciencia de Israel Investigación y Desarrollo (GIF) (Grant No. 1093-32.2/2010, a HS).

1. Preparación Lentivirus <ol><li> Se cultivan las células HEK-293FT a 90% de confluencia. </li><li> En el día de la transfección medio celular cambio de DMEM libre de suero suplementado con 1 mM de glutamina y 50 mg / ml de penicilina-estreptomicina. </li><li> Co-transfectar las células con un vector pLKO.1-Puro y con plásmidos que codifican para la delta R8.2 y VSV-G restos y los genes miARN de interés, utilizando 10 l de 1 mg / ml de polietilenimina como un portador 9. </li><li> Recoger lentivirus envasados ​​a las 24 horas y 48 horas después de la transfección, filtrar con filtro de 0,45 micras. </li><li> Concentrar los lentivirus utilizando ultracentrifugación en 70.000 xg, durante 2 horas y 15 ° C, alícuota y almacenar a -70 ° C. </li><li> Medida título del virus mediante la infección de células HEK-293T con preparaciones de virus diluidas en serie (1 a 10 -6 ml de vector por pocillo). El título resultante (se recomienda un mínimo de ~ 1 × 10 9 partículas infecciosas por ml) se evalúa para la expresión de la GEne de interés, utilizando puromycin selección y cuantificación de las buenas prácticas agrarias expresión de los virus a través de recuento de células fluorescentes. </li></ol> Para el protocolo más detallado de preparación lentivirus ver 10. 2. Preparación de los animales para la cirugía <ol><li> Cirujanos atuendo debe incluir bata quirúrgica, guantes estériles, gorro y mascarilla. </li><li> Pesar el animal, a continuación, anestesiar con una IP-inyección de una mezcla de ketamina, con el volumen proporcional al peso de los animales como se especifica para cada fármaco. Para una mezcla de ketamina / xilazina, un intervalo de dosis de 80-200 mg / kg de ketamina y 7-20 mg / kg de xilazina se utiliza por lo general para los ratones. </li><li> Espere hasta que el animal esté totalmente anestesiado, a continuación, comprobar si la falta de reflejo de retirada de la pata trasera del animal mediante la ampliación de la extremidad y pulsando con el dedo. </li><li> Inyectar el animal por vía subcutánea con Rimadyl, tal como se especifica en la caja, para aliviar el dolor. Rango de dosis típica para Rymadil es 5-10 mg. </li><li> Colocar el animal sobre una almohadilla térmica para mantener una temperatura corporal constante y humedecer los ojos con el ungüento. </li><li> Afeitar el área entre los dos oídos con una máquina de recorte. </li><li> Desinfecte la piel con betadine. </li></ol> 3. La exposición de la calavera y perforación <ol><li> Colocar el animal en el interior del stereotact mediante el ajuste de las varillas en las grietas justo por delante de las orejas del animal. </li><li> Utilice un bisturí para realizar una incisión anterior-posterior de unos 1,5 cm entre las orejas y mantenerla abierta con pinzas de cirugía (serfines). </li><li> Limpie la superficie del cráneo con un bastoncillo de algodón hasta la intersección de la sutura coronal y las suturas sagital, es decir, el bregma y la intersección entre las suturas coronal y lambdoid, es decir, lambda, son visibles. </li><li> Dirija la punta de la jeringa, que se celebró por la stereotact, hasta el punto de bregma, en los tres ejes. Anote las coordenadas. Este punto podría ser considerado como el po ceroint en los tres ejes. </li><li> Levantar la jeringa en el eje vertical, de manera que un movimiento planar no rayar el cráneo y mover el cabezal de la jeringa a la ubicación correcta. Inyecciones CA1 del hipocampo requieren las siguientes coordenadas en relación con el bregma en mm: -2 en el eje anterior / posterior, ± 1.8 en el eje lateral / medial y -1,5 en el eje dorsal / ventral. </li><li> Baje la punta de la jeringa hasta que toque el cráneo y marcar el lugar con un marcador. Retire la jeringa hacia atrás para evitar puñaladas. </li><li> Perforar un agujero poco profundo, sólo en el hueso del cráneo con una multa perforador. Sostenga el perforador constante para que no se siga perforar en la parte de abajo de tejidos blandos. Usted puede evitar esto se estabiliza por un lado con el otro y por la perforación en pulsos cortos. </li></ol> 4. La inyección de la Lentivirus <ol><li> Retirar 0,5 ml de la solución concentrada de lentivirus. </li><li> Coloque la jeringa encima del agujero y baje lentamente en forma vertical hasta que ReaChes la superficie del cráneo. Continuar para bajar la jeringa en el cerebro muy lentamente. En este paso algo de sangrado puede ocurrir que no indica necesariamente una penetración fallado. Si se produce una hemorragia fregar con una esponja de algodón. </li><li> Establecer la bomba digital para 0,02 ml / min (0,5 l se inyecta en 25 min) y comenzar la infusión. Infusión lenta permite la propagación efectiva del virus en el tejido y evita el flujo de retorno. En algunos tipos de jeringas en cuenta la inserción de la jeringa para una mayor profundidad de 0,5 mm antes de retirarse a las coordenadas y la infusión de originales. </li><li> Una vez finalizada la infusión esperar otros 5 minutos para permitir que el material que se extienda en el cerebro en lugar de retirarse de nuevo en el canal formado por la jeringa. </li><li> Retire la jeringa muy lentamente y observar los flujos de espalda. Si se observa un flujo hacia atrás en este paso, una fracción del material inyectado fue probablemente perdió. </li></ol> 5. Cierre de heridas y la recuperación <ol><li> Seal ªe enrollado con histoacryl. Asegúrese de evitar fugas del histoacryl en los ojos. </li><li> Inyectar la vía intraperitoneal animales (IP) con 1 ml de solución salina precalentada, para evitar la deshidratación. </li><li> Colocar el animal en una jaula de recuperación que se coloca sobre una almohadilla caliente. Ver el animal mientras se recupera durante una hora adicional. </li></ol> En caso de pérdida de peso, inapetencia, se debe realizar debilidad / incapacidad para obtener alimentos o agua, estado moribundo o infección, la eutanasia del animal. Los métodos aceptables para la eutanasia de roedores son los barbitúricos, anestésicos inhalados, CO 2, CO, o cloruro de potasio en combinación con la anestesia general. Después de 4 a 6 semanas, evaluar la memoria de navegación del animal se evalúa en el laberinto de agua de Morris. Los lentivirus se suele infectar a la mayoría de las células dentro de la esfera de la inyección. 6. Evaluación del Comportamiento en el laberinto de agua de Morris <ol><li> Capacitar a los animales en el Mlirio laberinto de agua. Para el entrenamiento exacto y el protocolo de pruebas de ver 11. Después de cada ensayo, el animal secar con una toalla seca, reemplazarlo en su jaula y refrescar el agua en el tanque. </li><li> Prueba de los animales en el laberinto de agua de Morris durante 3 días consecutivos, 4 ensayos cada día. Cada día insertar el animal en el laberinto en cada una de las 4 direcciones del laberinto (norte, sur, este y oeste) en un orden cambiante, por ejemplo, el primer día: este-oeste-norte-sur, de dos días: al oeste y el sur -noreste. Limpie los animales después de cada ensayo. </li><li> Durante la prueba de los ensayos realizar el seguimiento del animal con un sistema de seguimiento, tales como el sistema de seguimiento Noldus. </li><li> Después de la prueba de ensayo 12 ª, insertar el animal en el tanque de agua sin la plataforma durante un minuto. Esto se usaría para analizar la estrategia de buscar el animal está tomando. </li><li> Analizar los datos como se sugiere en 12. </li></ol>

<ol><li>Siegel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+screen+implicates+microRNA-138-dependent+regulation+of+the+depalmitoylation+enzyme+APT1+in+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).</li>
<li>Jin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+interaction+between+the+fragile+X+mental+retardation+protein+and+the+microRNA+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway.</a> Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).</li>
<li>Simon, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+miR-1+regulates+a+MEF-2-dependent+retrograde+signal+at+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions.</a> Cell. 133, 903-915 (2008).</li>
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<li>Jakobsson, J., Lundberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+for+use+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors for use in the central nervous system.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).</li>
<li>Berson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic-associated+loss+of+hnRNP-A%2FB+in+Alzheimer%27s+disease+impairs+cortical+splicing+and+cognitive+function+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice.</a> EMBO Molecular Medicine. , (2012).</li>
<li>Haramati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+as+repressors+of+stress-induced+anxiety%3A+the+case+of+amygdalar+miR-34%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).</li>
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<li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo%3A+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).</li>
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<li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morris+Water+Maze+Experiment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Morris Water Maze Experiment.</a> J. Vis. Exp. (19), e897(2008).</li>
<li>Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morris+water+maze+test+for+learning+and+memory+deficits+in+Alzheimer%27s+disease+model+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice.</a> J. Vis. Exp. (53), e2920(2011).</li>
<li>Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approach+for+intracerebroventricular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic approach for intracerebroventricular delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Inyección estereotáctica de un lentivirus es relativamente un método rápido para la evaluación in vivo, tanto para la altura o baja regulación de genes diferentes y miRNAs. La principal alternativa es un ratón genéticamente modificado que es una técnica consume mucho más laborioso y a continuación, inyección directa lentivirus. Además, la regulación hacia arriba, en la inyección de lentivirus, se produce en un momento específico en el ratón adulto y no incluye la posibilidad de permeabilidad durante el...

El papel de los miRNAs específicos en el funcionamiento del sistema nervioso ha sido recientemente cuestionado por inyección lentiviral en varios estudios. MiRNAs se han encontrado para ser crucial para el mantenimiento y la re-formación de la estructura sinapsis 1, 2 sinaptogénesis y la remodelación de sinapsis y mantenimiento 3. Estos estudios sugieren fuertemente que los miRNAs están comprometidos, a través de efectos reguladores múltiples niveles, tanto en la conformación y en el mantenimiento de la salida principal del sistema nervioso, la función cognitiva. Inyección estereotáctica de las partículas de lentivirus en regiones específicas en el cerebro de roedores permite la búsqueda de alteraciones en la morfología de la sinapsis y la actividad neuronal, y se utilizó para establecer el significado funcional de las transcripciones sobreexpresados ​​4,5. La infección directa de las neuronas en áreas del cerebro bien definidos con miARN-expresión de los lentivirus pueden estar implicados en estudios de envejecimiento, trastornos cerebrales y la neurodegeneración; Estudios de miRNAs en el ámbito de la regulación del comportamiento 6-8 están en un estado mucho menos avanzada, y la inyección estereotáctica de los genes miARN-expresando partículas de lentivirus seguido por pruebas de comportamiento puede ser útil para tales fines. Un método mucho más laborioso para inducir la sobre o sub-expresión implica ingeniería genética knock-in o ratones knockout. Sistemas genéticos pueden permitir para un control condicional y temporal en la expresión (por ejemplo, Cre-Lox, los sistemas Tet), pero éstos apenas ofrecer la especificidad espacial del procedimiento de inyección y casi siempre hay una cierta cantidad de falta de estanqueidad. Además, los procedimientos de ingeniería no requieren cirugía y se pueden utilizar a través de laboratorios con relativamente buena reproducibilidad, sin embargo, son más lentos y requieren mucha más mano de obra y de recursos financieros. Además, el control temporal de la sobre o sub-expresión en ratones inyectados es mucho más preciso en comparación con ratones modificados genéticamente.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Escala de pesaje para roedores</td><td>Burtons (UK)</td><td>115-455</td><td></td></tr><tr><td>almohadilla térmica</td><td>FIRstTechnology</td><td>DCT-25</td><td></td></tr><tr><td>Stoelting</td><td>51465</td><td></td><td></td></tr><tr><td>estereotact</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí y cuchillas</td><td>Kent scientific</td><td></td><td></td>INS500348</tr><tr><td>Jeringa Harland Hamilton</td><td></td><td>7632-01</td><td></td></tr><tr><td>perforadora</td><td>Stoelting</td><td>51449</td><td></td></tr><tr><td>bomba digital</td><td>Harvard aparato</td><td>704507</td><td></td></tr><tr><td>Tanque de agua y plataforma</td><td>Stoelting</td><td>60135</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>ketamine </td><td>Vetoquinol(Lure France)</td><td></td><td></td>3055503</tr><tr><td>domitor</td><td>Orion pharma</td><td>107140-10</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl</td><td>Pfizer salud animal</td><td>24751</td><td></td></tr><tr><td>ungüento humectante - Synthomycine 5%</td><td>Rekah Pharmaceutical</td><td>195</td><td> </td></tr><tr><td>histoacryl</td><td>Braun</td><td>112101</td><td></td></tr><tr><td>solución salina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr></tbody></table>

inyección estereotáctica de microarn que expresan lentivirus al ratón hipocampo ca1 región y evaluación de los resultados del comportamiento

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

Los microARN (miRNA) son pequeñas moléculas de ARN de cadena simple reguladoras unos 22 nucleótidos de longitud que pueden cada destino numerosas transcripciones de ARNm y dim toda una expresión de los genes de la vía de la destrucción de inducir y / o inhibición de la traducción de estos objetivos. Varios miRNAs juegan un papel clave en el mantenimiento de la estructura y la función neuronal y en las funciones cerebrales de alto nivel, y se buscan métodos para manipular los niveles para explorar estas funciones. A continuación, presentamos un método directo en vivo para el examen de las consecuencias cognitivas de miRNAs forzadas exceso en ratones mediante la inyección estereotáxica de partículas virales miRNA-codificación. Específicamente, el protocolo actual consiste en la inyección en la región CA1 del hipocampo, lo que contribuye a la consolidación de mamífero memoria, el aprendizaje, y las respuestas al estrés, y ofrece un lugar de la inyección conveniente. Las coordenadas se miden de acuerdo con el bregma ratón y virus de la perfusión se controla y se mantiene muy lento digitalmente.Después de la inyección, la herida de la cirugía se cierra herméticamente y los animales recuperarse. Los lentivirus que codifican silenciadores de los objetivos de mRNA correspondientes sirven para implicar a la interacción específica de los genes miARN / target responsable del efecto observado, con los ratones no tratados, los ratones inyectados con solución salina y ratones inyectados con vectores lentivirus &quot;vacías&quot; como controles. Un mes después de la inyección, los animales se examinan en el laberinto de agua de Morris (MWM) para la evaluación de su aprendizaje navegación y capacidades de la memoria. El MWM es un tanque redondo lleno de agua coloreada con una pequeña plataforma sumergida 1 cm por debajo de la superficie del agua. Señales visuales estable alrededor del tanque para permitir la navegación espacial (sonido y el campo magnético de la tierra también puede ayudar a los animales en la navegación). Vigilancia de la cámara de vídeo permite la medición de la ruta de la natación y el tiempo para encontrar y constituir la plataforma. El ratón se enseña por primera vez que el montaje de la plataforma escondida ofrece un escape de la natación forzada, sino que se prueba para el uso de este escape y finalmente, la plataforma se retira y las pruebas de la sonda examinar si el ratón recuerda su ubicación anterior. Pruebas repetidas durante varios días consecutivos destacan un mejor rendimiento de los ratones examinados en latencias más cortas para encontrar y montar la plataforma, y ​​las rutas que más directas para llegar a la plataforma o la ubicación. Si no se presenta dicha mejora representa problemas de aprendizaje y de la memoria y / o ansiedad, que puede entonces ser probado específicamente (por ejemplo, en el laberinto elevado en cruz). Este enfoque permite la validación de miRNAs específicos y las transcripciones de destino en lo cognitivo estudiado y / o procesos relacionados con el estrés.

La inyección de 0,5 l lentivirus en la región CA1 en el hipocampo del ratón, con la velocidad de flujo se indica en la sección de protocolo produce una esfera infectada de alrededor de 1 mm en el eje rostral caudal, y alrededor de 0,5 mm en la dirección medial-lateral y la parte anterior -posterior ejes (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50170/50170fig1.jpg" /> Figura 1. Punto de bregma y aparato de inyec...

Los microARNs tienen funciones importantes en la estructura y función del cerebro. Aquí se describe un método para hacer cumplir miRNA hipocampo sobreexpresión mediante inyección estereotáxica de un lentivirus que expresan los genes miARN ingeniería. Este enfoque puede servir como una manera relativamente rápida para evaluar la<em&gt; In vivo</em&gt; Efectos de miRNAs sobreexpresados ​​en regiones específicas del cerebro.

Inyección estereotáctica de microARN que expresan lentivirus al ratón hipocampo CA1 Región y evaluación de los resultados del comportamiento

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar los efectos neurológicos y cognitivos de la sobreexpresión de microARN en ratones. Esto se logra mediante la preparación de un lentivirus que expresa microARN como segundo paso. El lentivirus se inyecta en una región cerebral específica, lo que permite que el microARN se sobreexprese y realice la regulación sobre sus dianas.Se obtienen resultados que muestran los efectos cognitivos de la sobreexpresión de microARN debido a la administración anatómicamente dirigida del lentivirus en el cerebro del ratón. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la ingeniería genética es que la ingeniería genética es una técnica mucho más laboriosa y que consume más tiempo que la inyección directa de lentivirus. Además, la inyección de lentivirus permite un control completo espacial y temporal, así como el seguimiento de la molécula que se sobreexpresa.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las neuronas espejo, como cuál sería el efecto de una sobreexpresión o subexpresión de una mirror específica en el aprendizaje y la memoria evaluados mediante pruebas conductuales. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de enfermedades neurodegenerativas porque los microARN son susceptibles de intervenciones terapéuticas. Incube las células empaquetadoras sembradas hasta que alcancen una confluencia del 90 %, luego transfecte primero y cambie su medio a DMEM libre de suero, suplementado con un milimolar de glutamina y 50 miligramos por mililitro.Penicilina estreptomicina, luego realice una transfección simultánea de las células con el plásmido vector A-P-L-K-O 0,1 pur que codifica para las porciones delta R 8,2 y VSVG, y el plásmido con el microARN de interés. Utilice 10 microlitros de polietileno al 1 miligrama por mililitro como vehículo a las 24 y 48 horas. Tras la transfección, recolecte los lentivirus empaquetados y filtre a través de un filtro de 0,45 micrómetros.Concentre el filtrado con lentivirus mediante ultracentrifugación a 15 grados Celsius y 70.000 Gs durante dos horas. Descarte el sobrenadante y suspenda el lentivirus en la cantidad mínima de agua destilada desionizada necesaria para disolver completamente el precipitado, de modo que no queden grumos visibles. A continuación, prepare alícuotas del concentrado para almacenarlas a menos 70 grados Celsius.A continuación, mida el virus más infeccioso empaquetando células con diluciones seriadas del virus. En una placa de 12 pocillos, desde un mililitro de vector hasta una millonésima de mililitro de vector por pocillo. La titulación resultante debe ser de al menos 1000 millones de partículas infecciosas por mililitro.Pese el animal y anestésielo con una inyección IP de una mezcla de ketamina. Utilice el volumen proporcional al peso del animal según lo especificado para cada fármaco. Espere hasta que el animal esté completamente anestesiado.Luego verifique la ausencia de reflejo de retirada en la extremidad trasera cuando no haya reflejo. Inyecte al animal por vía subcutánea el analgésico IL según lo indicado en el envase. Coloque al animal bajo una lámpara de calor o sobre una almohadilla térmica y humedezca sus ojos con pomada. Por último, afeite el área entre las dos orejas con una máquina de recorte y sane la piel con etanol al 70 %. Coloque al animal dentro del estereotáxico y ajuste las barras en las hendiduras, justo por dentro de las orejas del animal. Luego use un bisturí para realizar una incisión anteroposterior de aproximadamente 1,5 centímetros entre las orejas y mantenga la incisión abierta con pinzas quirúrgicas.A continuación, limpie la superficie del cráneo con un hisopo de algodón hasta que sea visible la intersección entre la sutura coronal y las suturas sagitales. Esto incluye el bgma y la intersección entre las suturas coronal y lambdoidea o el lambda. Ahora coloque la punta de la jeringa sostenida en el estereotáctico en el punto bgma en los tres ejes, justo en las coordenadas.Son los puntos cero. A continuación, eleve la jeringa en el eje vertical para que un movimiento plano no raspe el cráneo desde el bgma. Mueva la jeringa a la ubicación requerida hacia el hipocampo ca uno, por ejemplo, dos milímetros hacia abajo en el eje AP, 1,8 milímetros arriba y abajo en el eje LM y 1,5 milímetros hacia abajo en el eje DV.A continuación, baje la punta de la jeringa hasta que toque el cráneo. Marque el punto, luego retire la jeringa para dejar espacio para la fresa en ese lugar. Utilizando un taladro fino, haga un orificio superficial en el hueso del cráneo.Sostenga el taladro firmemente y no lo introduzca en el tejido blando. Realizar perforaciones en pulsos cortos puede ser útil durante el procedimiento. Asegúrese de estudiar una mano utilizando la otra para que la perforación a través del hueso no penetre más profundamente en el tejido blando.Retire medio mililitro de la solución concentrada de lentivirus e introdúzcalo en la jeringa. Coloque la jeringa sobre el orificio y bájela lentamente en forma vertical hasta que alcance la superficie del cráneo. Continúe bajando la jeringa hacia el cerebro muy lentamente.Configure la bomba digital a 0,02 mililitros por minuto para inyectar lentamente el volumen en 25 minutos. Esto evitará el flujo inverso y garantizará una correcta difusión. Inicie la infusión en algunos tipos de jeringas.Considere insertar la jeringa medio milímetro adicional antes de retirarse a las coordenadas originales e iniciar la infusión mientras se administra la sustancia. Humedezca el área expuesta con PBS para prevenir la deshidratación del tejido. Al finalizar, espere cinco minutos antes de retirar la jeringa.Esto permite que el material se extienda hacia el cerebro en lugar de retroceder por el trayecto de la jeringa. Luego, retire la jeringa muy lentamente y observe si hay reflujo. Si se observa un reflujo, probablemente se perdió una fracción del material inyectado.Cierre la herida con histoacrilón teniendo cuidado de no permitir que el histoacrilón se filtre hacia los ojos del animal. A continuación, para evitar que el animal se deshidrate, inyecte un mililitro de solución salina tibia por vía intraperitoneal. Coloque al animal en una jaula de recuperación que esté sobre una almohadilla calentada.Observe al animal mientras se recupera durante una hora tras cuatro a seis semanas, y evalúe la memoria de navegación del animal mediante el laberinto acuático de Morris. En este momento, el lentivirus ya habrá infectado la mayoría de las células diana. Para entonces, una inyección de 0,5 microlitros de lentivirus en el ca.Se preparó una región del hipocampo de un ratón según lo descrito en el protocolo. Posteriormente, se sacrificó al animal y se analizaron cortes de 40 micrones de grosor de su cerebro. Para la expresión de GFP, la tinción con DAPI puede observarse en rojo.En resumen, esto produjo una esfera infectada de aproximadamente un milímetro en el eje rostral-caudal y de aproximadamente 0,5 milímetros en los ejes medial-lateral y anterior-posterior. Los ratones inyectados con un vector lente que codifica un microARN se compararon con los controles en el laberinto acuático de Morris. Después de tres días de entrenamiento, la trayectoria representativa de un ratón control hacia la plataforma sumergida, mostrada en verde, fue mucho más corta que la de un animal experimental en rojo.En general, los animales de experimentación tuvieron más dificultades para aprender la tarea en comparación con los controles, una vez dominada. Esta técnica puede realizarse en aproximadamente 40 minutos por ratón. Con el caudal como único factor limitante al seguir este procedimiento.Otros métodos, como la inyección sistemática de oligonucleótidos, pueden realizarse para responder preguntas como hasta qué punto este procedimiento altera la comunicación entre el cerebro y el cuerpo. No olvide que trabajar con lentivirus puede ser extremadamente peligroso y que deben tomarse precauciones, como el uso de bata de laboratorio desechable tyvac y guantes neutros. Además, el material de vidrio y plástico que contenga desechos líquidos debe descontaminarse antes de desecharse en una bolsa de bioseguridad.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

Este video demuestra la inhibición mediada por microARN de las corrientes sinápticas excitadoras en cortes de cerebro de hipocampo de ratón. Las neuronas CA3 se infectaron con un vector viral recombinante que alberga una construcción para expresar un indicador fluorescente, un canal de membrana activado por luz y un microARN que regula a la baja la expresión de los canales de calcio dependientes de voltaje. Al colocar un corte en una cámara de registro y parchear una neurona CA1 con una pipeta...

Inhibición mediada por microARN de las corrientes postsinápticas excitatorias en cortes de hipocampo de ratón

Fuente: Chen, S., et al., Cirugía estereotáxica para la manipulación genética en células estriatales de cerebros de ratones neonatales. J. Vis. Exp. (2018)Este video demuestra la inyección estereotáxica de un vector viral que codifica la recombinasa Cre y la proteína de fluorescencia verde o GFP en el cuerpo estriado de un cachorro de ratón modificado genéticamente para lograr la manipulación génica mediante la extirpación de un casete STOP flanqueado por loxP, activando la proteína de...

Microinyección estereotáctica de un vector viral para la manipulación génica en un cachorro de ratón estriado

Fuente: Pereira, M. et. al., Reprogramación directa in vivo de células gliales residentes en interneuronas mediante inyección intracerebral de vectores virales. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra la inyección estereotáxica de un virus adenoasociado en la corteza cerebral de un ratón transgénico para administrar genes reporteros fluorescentes y de reprogramación neuronal dependientes de Cre en células gliales.

Inyección estereotáxica de vectores virales para la reprogramación de células gliales en un modelo de ratón

Fuente: Fricano-Kugler, C. J., et al. Diseño, envasado y entrega de retro y lentivirus CRISPR de alto título mediante inyección estereotáxica. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra la inyección viral estereotáxica para una edición precisa de genes neuronales en el cerebro del ratón. El protocolo garantiza la administración precisa del virus a la circunvolución dentada, lo que permite el etiquetado fluorescente y la eliminación de genes mediada por CRISPR para estudiar los circuitos...

Inyección viral estereotáxica para la edición de genes neuronales dirigidos en el cerebro del ratón

En este artículo se describe cómo microinject vectores virales en el cerebro del ratón y luego probar en un paradigma de preferencia un lugar acondicionado que incluye una fase de adquisición, extinción y reintegro.

La microinyección estereotáxica de vectores virales que expresan Cre recombinasa para estudiar el papel de los genes diana de cocaína acondicionado Place Preferencia

Inyección estereotáctica de lentivirus que expresan los ADNc o shRNAs pueden modular la expresión génica en áreas específicas del cerebro de los ratones. A continuación, presentamos un protocolo para combinar inyecciones estereotáxica con las tareas de comportamiento, como la prueba de campo abierto (OFT) y la prueba de natación forzada (FST).

Aplicando estereotáctica Técnica de Inyección para el Estudio de los efectos genéticos sobre Comportamientos animales

Aquí, presentamos un protocolo para la infusión cerebral estereotáxica directa de beta-amiloide. Esta metodología proporciona un modelo de ratón alternativo in vivo para abordar los efectos a corto plazo de la beta-amiloide en las neuronas cerebrales.

Infusión estereotáxica de Oligomeric beta-amiloide en el hipocampo del ratón

Los microRNAs desempeñan un papel crucial en el cerebro y son objetivos potenciales para modelar la neurodegeneración. Sin embargo, perturbar los niveles de miARN es un desafío debido a la corta longitud del miARN y la inaccesibilidad del tejido cerebral. Este video presenta un método para el diseño de antagomir y la administración específica del cerebro utilizando un neuropéptido en ratones.

Una alternativa sencilla para inyección estereotáctica para el Cerebro Derribo específico de miARN

El sistema / Cas9 CRISPR ofrece el potencial para que la edición del genoma específico accesible y asequible para la comunidad científica. Este protocolo está destinado a demostrar cómo crear virus que Knockout un gen de interés utilizando el sistema / Cas9 CRISPR y, a continuación, inyectarlos estereotáxica en el cerebro del ratón adulto.

Proyectos, Embalaje y Entrega de alto título de CRISPR Retro y lentivirus vía estereotáxica Inyección

El objetivo de este protocolo es describir un enfoque para analizar el comportamiento de las células madre/progenitoras neurales adultas en respuesta a la manipulación quimiogenética de un circuito neural local específico.

Regulación específica del circuito de ensayo de células precursoras neuronales hipocampales adultas

Este artículo demuestra la preparación de una ventana de encargo de la proyección de imagen complementada con la cánula de la infusión y su implantación sobre la región CA1 del hipocampo en ratones.

Procedimiento De Craneotomía Para La Visualización De Las Actividades Neuronales En El Hipocampo De Comportarse Ratones

Aprende a inyectar lentivirus que expresan microARN en la región CA1 del hipocampo de ratones mediante estereotaxia. Este método permite evaluar efectos cognitivos y estudiar funciones neurológicas con control espacial y temporal preciso.

Inyección estereotáctica de microARN que expresan lentivirus al ratón hipocampo CA1 Región y evaluación de los resultados del comportamiento (Video) | JoVE Journal

Inyección estereotáctica de microARN que expresan lentivirus al ratón hipocampo CA1 Región y evaluación de los resultados del comportamiento

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