La evaluación de la administración de genes nanopartículas poliméricas por nanopartículas de análisis de seguimiento y de alto rendimiento Citometría de Flujo

El objetivo general de este procedimiento es realizar y evaluar experimentos de entrega génica utilizando nanopartículas poliméricas no virales. Esto se logra primero transfectando células con partículas de entrega génica. La eficiencia de transfección luego se evalúa mediante microscopía y análisis de citometría de flujo de alto rendimiento.

A continuación, se determina la concentración de distribución del tamaño de las nanopartículas y los plásmidos por partícula mediante un instrumento de análisis de seguimiento de nanopartículas. En última instancia, este método permite la caracterización del tamaño de las nanopartículas y la eficacia de transfección utilizando nanopartículas. La principal ventaja del uso de nanopartículas poliméricas biodegradables para la transferencia génica es que pueden ser más seguras y eficaces que otros métodos de transferencia génica.

La principal ventaja del análisis de seguimiento de nanopartículas frente a métodos existentes como la dispersión dinámica de la luz es que el análisis de seguimiento de nanopartículas proporciona directamente la distribución promedio por número y la concentración de partículas. Este método ayudaría a responder preguntas clave en el campo de la transferencia génica no viral, como el número de plásmidos por partícula, lo cual es importante para estudios de coexpresión. El siguiente protocolo se demuestra utilizando células endoteliales retinianas humanas o hre como células modelo y poli beta aminoésteres o PBA AEs como polímeros modelo.

Tenga en cuenta que es posible que sea necesario ajustar las condiciones de cultivo y los disolventes según las células y los polímeros utilizados 24 horas antes de la transfección. Utilice una pipeta multicanal para sembrar hre en placas de cultivo de tejidos transparentes, con fondo plano, de 96 pocillos, a una concentración de 25 a 50 células por microlitro.

Esto dará un 70 a 80 % de confluencia el día de la transfección; prepare y etiquete placas claras de 96 pocillos no tratadas para cultivo de tejidos, que servirán como placas maestras para preparar y diluir el PBA y el ADN. Se prepararán dos placas idénticas.

Uno para evaluar la toxicidad y otro para evaluar la eficiencia de transfección. Siga las soluciones stock del polímero de poli beta amino éster o PVAE y P-E-G-F-P-N 1D NA a temperatura ambiente. Una vez descongelado, use una pipeta de 12 canales para preparar un pocillo que contenga 50 microlitros de ADN al 0,06 miligramos por mililitro en tampón de acetato de sodio 25 milimolar para cada condición.

A continuación, en la misma placa, diluya los polímeros PBAE hasta 10 miligramos por mililitro en tampón de acetato de sodio. Luego, diluya aún más los polímeros PBAE en relaciones de peso de polímero a peso de ADN de 30 y 60, en 50 microlitros de tampón de acetato de sodio. Para la formación de nanopartículas, utilice una pipeta de 12 canales para combinar los 50 microlitros de PBAE diluido con los 50 microlitros de ADN plasmídico diluido, mezclando vigorosamente mediante aspiración y expulsión repetida.

Luego, deje que la mezcla incube a temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir la autoensamblaje. Tras la autoensamblaje, utilice una pipeta de 12 canales para añadir gota a gota 20 microlitros de la solución de nanopartículas a cada pocillo de las células sembradas que contienen medio para transfectar cuatro pocillos por condición, como se muestra en este diagrama. Para cada placa, reserve al menos cuatro pocillos para cada uno de los controles negativo y positivo.

El control negativo consiste en células no tratadas y los controles positivos consisten en células transfectadas con un reactivo disponible comercialmente, como lipo 2000 o Fuge hd. Incube las placas con las células transfectadas a 37 grados Celsius durante cuatro horas. Después de la incubación, utilice la pipeta de 12 canales para eliminar el medio de las células y sustitúyalo por 100 microlitros por pocillo de medio hre fresco. Incube durante 24 a 48 horas adicionales.

Al día siguiente, retire una placa del incubador. Evalúe la transfección celular y la toxicidad mediante microscopía de fluorescencia, y cuantifique la toxicidad celular utilizando el ensayo Cell Titer 96 Aqueous One según se describe en el texto adjunto. Después de 48 horas, retire la otra placa del incubador.

Evalúe la eficiencia de transfección mediante fluorescencia, microscopía y citometría de flujo, tal como se describe en el texto adjunto. Utilice los datos de toxicidad y transfección obtenidos aquí para determinar las concentraciones óptimas de PBAs a utilizar en experimentos futuros. El equipo nano site NS 500 es un instrumento de análisis de seguimiento de nanopartículas que puede proporcionar información sobre la distribución de tamaño de una muestra de nanopartículas mediante el seguimiento de la difusión de nanopartículas individuales; antes de su uso, prepare el sistema fluidico del nano site en un tubo microcentrífugo de 0,5 mililitros.

Prepare el PBA y el ADN plasmático para el análisis como antes, a las mismas concentraciones utilizadas en la sección anterior de este video. Después del autoensamblaje, diluya la solución de nanopartículas 100 veces en PBS en un nuevo tubo de 1,5 mililitros para obtener un volumen final de al menos 500 microlitros. Esto producirá una concentración de nanopartículas dentro del rango adecuado para el análisis de seguimiento de nanopartículas.

A continuación, cargue la muestra en el sitio nano. Asegúrese de no introducir burbujas de aire y verifique visualmente que haya entre 20 y 100 partículas en la pantalla. Un número ideal para el seguimiento de nanopartículas es aproximadamente 50 partículas.

Si hay demasiadas o muy pocas partículas, lave el NS 500, ajuste la dilución en PBS y vuelva a cargar la muestra. Si el número de partículas en la pantalla está entre 20 y 100, capture videos. Una vez que se hayan capturado los videos, continúe con la etapa de procesamiento abriendo un archivo de video en el mismo software.

Luego, una vez que el archivo esté abierto, aumente la ganancia de la pantalla. Seleccione el ajuste automático de los parámetros de la imagen haciendo clic en las casillas correspondientes. Si el software reconoce una partícula en la pantalla, esta será marcada con una cruz roja.

Una vez que todas las partículas estén marcadas, haga clic en el botón de procesar en el software para procesar el archivo de video. A continuación, se mostrarán el tamaño de las partículas, los promedios del tamaño de distribución y la concentración de partículas para verificar que el recuento de partículas sea preciso. Repita este procedimiento utilizando la misma muestra diluida por dos y por cuatro.

Las células en PBS apre fueron transfectadas con nanopartículas E-G-F-P-P-B-A-E como se muestra en este video. Para evaluar visualmente la eficiencia de transfección, se realizó imágenes mediante microscopía de fluorescencia. Estas imágenes muestran la fluorescencia, el campo brillante y las imágenes fusionadas de las células transfectadas. Como se observa en la imagen fusionada, la mayoría de las células expresan EGFP y mantienen una morfología normal.

Para cuantificar la eficiencia de transfección, se realizó citometría de flujo, como se puede observar en esta figura tras la selección de la población viable. La población no resecada no contenía células positivas para EGFP. Sin embargo, el 71,6 % de las células tratadas fueron positivas para EGFP. A continuación, se utilizó el análisis de seguimiento de nanopartículas para determinar la distribución del tamaño y la concentración de las nanopartículas.

Para este análisis, es importante que la distribución del tamaño de partículas sea monodispersa. Utilizando esta información, se puede calcular el número promedio de plásmidos por partícula dividiendo la concentración de plásmidos en solución entre la concentración de partículas determinada por el NS 500. El número de plásmidos por partícula es una distribución que refleja la distribución del tamaño de partículas.

En la muestra, habrá partículas más grandes con un valor de plásmidos por partícula superior al promedio, así como partículas más pequeñas con un valor de plásmidos por partícula inferior al promedio. Al realizar este procedimiento, es importante recordar no dejar que los polímeros degradables permanezcan demasiado tiempo en disolvente acuoso antes de añadir las nanopartículas a las células; para usar ncy, ajuste la dilución adecuada para la determinación del tamaño. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo transfectar tipos celulares adherentes con polímeros de entrega génica no virales, así como de cómo medir la eficacia de la transfección y la distribución del tamaño de las partículas.

No olvide que trabajar con células humanas representa un riesgo biológico. Siempre use equipo de protección personal y trabaje dentro de una cabina de seguridad biológica al realizar este procedimiento.