La evaluación de la administración de genes nanopartículas poliméricas por nanopartículas de análisis de seguimiento y de alto rendimiento Citometría de Flujo

El objetivo general de este procedimiento es realizar y evaluar experimentos de administración de genes utilizando nanopartículas poliméricas no virales. Esto se logra primero seccionando células con partículas de entrega de genes. A continuación, la eficiencia de la transfección se evalúa mediante microscopía y análisis de citometría de flujo de alto rendimiento.

A continuación, se determina la concentración de distribución del tamaño de las nanopartículas y los plásmidos por partícula utilizando un instrumento de análisis de seguimiento de nanopartículas. En última instancia, este método permite la caracterización del tamaño de las nanopartículas y la eficacia de la transfección mediante nanopartículas. La principal ventaja del uso de nanopartículas poliméricas biodegradables para la administración de genes es que pueden ser más seguras y efectivas que otros métodos de transferencia de genes.

La principal ventaja del análisis de seguimiento de nanopartículas sobre los métodos existentes, como la dispersión dinámica de la luz, es que el análisis de seguimiento de nanopartículas proporciona directamente el número, la distribución media y la concentración de partículas. Este método ayudaría a responder preguntas clave en el campo de la entrega de genes no virales, como el número de plásmidos por partícula, que es importante para los estudios de coexpresión. El siguiente protocolo se demuestra utilizando células endoteliales de la retina humanas o hre como células modelo y poli beta amino ésteres o PBA AE como polímeros modelo.

Tenga en cuenta que es posible que sea necesario ajustar las condiciones de cultivo y los disolventes en función de las células y los polímeros utilizados 24 horas antes. Transfección. Utilice una pipeta multicanal para sembrar el hilo en un cultivo de tejido transparente tratado de forma plana. Placas inferiores de 96 pocillos a una concentración de 25 a 50 células por microlitro.

Esto dará un 70 a 80% de fluidez el día de la transfección, prepare y etiquete el cultivo claro no tisular tratado. Placas de 96 pocillos que sirven como placas maestras para preparar y diluir el PBA y el ADN. Se prepararán dos platos idénticos.

Uno para evaluar la toxicidad y otro para evaluar la eficiencia de la transfección. Siga las soluciones madre de poli beta aminoéster o polímero PVAE y P-E-G-F-P-N 1D NA a temperatura ambiente. Una vez lavado, use una pipeta de 12 canales para preparar un pocillo que contenga 50 microlitros de 0,06 miligramos por mililitro de ADN en tampón de acetato de sodio de 25 milimolares para cada condición.

A continuación, en el mismo plato, diluya los polímeros PBAE a 10 miligramos por mililitro en tampón de acetato de sodio. A continuación, diluya aún más los polímeros PBAE en proporciones de peso de polímero a peso de ADN de 30 y 60 y 50 microlitros de tampón de acetato de sodio. Para la formación de nanopartículas, utilice una pipeta de 12 canales para combinar los 50 microlitros de PBA diluido con los 50 microlitros de ADN plasmático diluido mezclados vigorosamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

A continuación, deje que la mezcla se incube a temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir el automontaje. Después del autoensamblaje, use una pipeta de 12 canales para agregar 20 microlitros de la solución de nanopartículas gota a gota a cada pocillo de las celdas sembradas que contienen medio transfectar cuatro pocillos por condición, como se muestra en este diagrama. Para cada placa, reserve al menos cuatro pocillos para cada uno de los controles negativos y positivos.

control negativo consiste en células no tratadas y los controles positivos, consisten en células transfectadas con un reactivo disponible comercialmente como lipo 2000 o Fuge hd. Incubar las placas con las células transfectadas a 37 grados centígrados durante cuatro horas Después de la incubación, utilice la pipeta de 12 canales para eliminar el medio de las células y sustituirlo por 100 microlitros por pocillo de agua fresca. Incubar a medio durante 24 a 48 horas adicionales.

Al día siguiente, retire una placa de la incubadora. Evalúe la transfección celular y la toxicidad mediante microscopía de fluorescencia, y cuantifique la toxicidad celular utilizando el ensayo acuoso de título celular 96 como se describe en el texto adjunto. Después de 48 horas, retire la otra placa de la incubadora.

Evaluar la eficiencia de la transfección mediante fluorescencia, microscopía y citometría de flujo, tal como se describe en el texto adjunto. Utilice los datos de toxicidad y transfección adquiridos aquí para determinar las concentraciones óptimas de PBA que se utilizarán en futuros experimentos. El nano sitio NS 500 es un instrumento de análisis de seguimiento de nanopartículas que puede proporcionar información sobre la distribución del tamaño de una muestra de nanopartículas mediante el seguimiento de la difusión de nanopartículas individuales antes de su uso en un tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros.

Prepare el PBA y el ADN plasmático para el análisis como antes en las mismas concentraciones utilizadas en la sección anterior de este video. Después del autoensamblaje, diluir la solución de nanopartículas 100 veces en PBS en un nuevo tubo de 1,5 mililitros para obtener un volumen final de al menos 500 microlitros. Esto producirá una concentración de nanopartículas en el rango apropiado para el análisis de seguimiento de nanopartículas.

A continuación, cargue la muestra en el sitio nano. Asegúrese de no introducir burbujas de aire revisadas visualmente para asegurarse de que haya entre 20 y 100 partículas en la pantalla. Un número ideal para el seguimiento de nanopartículas es de aproximadamente 50 partículas.

Si hay demasiados o muy pocos, enjuague el NS 500, ajuste la dilución en PBS y vuelva a cargar la muestra. Si el número de partículas en la pantalla está entre 20 y 100, capture videos. Una vez capturados los vídeos, proceda a la fase de procesamiento abriendo un archivo de vídeo en el mismo software.

Luego, una vez que el archivo esté abierto, aumente la ganancia de pantalla. Seleccione el ajuste automático de los parámetros de la imagen haciendo clic en las casillas correspondientes. Si el software reconoce una partícula en la pantalla, se marcará con una cruz roja.

Una vez que todas las partículas estén marcadas, haga clic en el botón de procesamiento en el software para procesar el archivo de video. A continuación, se mostrarán el tamaño de partícula, los promedios de tamaño de distribución y la concentración de partículas para verificar que el recuento de partículas sea preciso. Repita este procedimiento utilizando la misma muestra diluida por dos x y cuatro.

Forex en PBS apre se transfectaron con las nanopartículas E-G-F-P-P-B-A-E como se muestra en este video. Para evaluar visualmente la eficiencia de la transfección, se realizaron imágenes de microscopía de fluorescencia. Estas imágenes muestran el campo claro de fluorescencia y las imágenes combinadas de las células transfectadas, como se ve en la imagen fusionada, la mayoría de las células expresan EGFP y mantienen una morfología normal.

Para cuantificar la eficiencia de la transfección se realizó citometría de flujo, como se puede observar en esta figura, después de la activación de la población viva. La población no resecada no contenía células positivas para EGFP. Sin embargo, el 71,6% de las células tratadas dieron positivo para el nanositio de EGFP. El análisis de seguimiento de nanopartículas se utilizó para determinar la distribución y concentración del tamaño de las nanopartículas.

Para este análisis, es importante que la distribución del tamaño de partícula sea monodispersa. Con esta información, se puede calcular el número medio de plásmidos por partícula dividiendo la concentración de plásmidos en solución por la concentración de partículas determinada por el NS 500. El número de plásmidos por partícula es una distribución que refleja la distribución del tamaño de partícula.

Dentro de la muestra, habrá partículas más grandes con un valor de plásmidos por partícula mayor que el promedio, así como partículas más pequeñas con un valor de plásmidos por partícula más bajo que el promedio. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no debe permitir que los polímeros degradables permanezcan en el solvente acuoso demasiado tiempo antes de agregar nanopartículas a las células para su uso, ajuste la dilución adecuada para el tamaño. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo transfectar tipos de células de adherencia con polímeros de entrega de genes no virales, así como medir la eficacia de la transfección, así como la distribución del tamaño de las partículas.

No olvide que trabajar con células humanas es biopeligroso. Siempre use equipo de protección personal y trabaje en un gabinete de bioseguridad mientras realiza este procedimiento.