Evaluación de la función muscular del músculo extensor largo digitorum Ex vivo Y tibial anterior del músculo In situ En ratones

El objetivo general de este procedimiento es determinar con precisión las propiedades mecánicas de los músculos de las extremidades de los ratones. Esto se logra midiendo las propiedades contráctiles y pasivas del músculo extensor largo de los dedos ex evo, o midiendo las propiedades contráctiles del músculo tibial anterior in situ, finalmente se pueden obtener resultados que permiten una mejor comprensión de los cambios fisiológicos en diversas enfermedades musculares y si las intervenciones experimentales mejoran la función muscular. Este método proporciona una evaluación completa de la propiedad contráctil y pasiva del músculo esquelético, que son dos aspectos inseparables de la función mecánica del músculo esquelético necesarios para el movimiento del cuerpo.

Por lo tanto, la demostración visual del procedimiento de disección muscular es fundamental porque requiere muchas habilidades y manipulación. Además, la principal ventaja de la evaluación NC 2 de la propiedad contráctil de los músculos grandes sobre los métodos existentes como el SA in vitro, es que el enfoque de instituto no altera el flujo sanguíneo normal y la oxigenación. Una de las principales preocupaciones en el estudio de la fisiología muscular es la oxigenación del músculo objetivo.

En una AS in vitro para músculos grandes, como el músculo TA, es posible que la difusión de oxígeno no llegue al centro del músculo. Las implicaciones de esta técnica se extienden a la terapia de las enfermedades musculares, ya que la medición precisa de la función mecánica del músculo esquelético también puede utilizarse para evaluar la progresión de las enfermedades musculares y determinar la eficacia terapéutica de nuevas intervenciones génicas, celulares y farmacológicas. Todos los procedimientos con animales presentados aquí han sido aprobados por el comité institucional de cuidado de animales.

Se trata de una cirugía de no supervivencia para establecer el sistema de prueba muscular para los experimentos ex vivo. Comience ensamblando el baño de tejido asegurando el tubo de oxigeno al baño de tejido de la camisa de agua. Conecte el baño ensamblado al aparato de montaje muscular y coloque la válvula de aguja en el drenaje del baño.

Conecte la línea de gas y las líneas de circulación de agua al baño. Permita que 30 grados centígrados de agua circule en la cámara de la camisa y que cinco PSI de gas fluyan a través del tubo de oxigeno. Llene el baño con tampón de timbre y equilibre con un flujo de gas constante.

Encienda los instrumentos y cargue el software DMC para diseccionar el músculo EDL, anestesiar y colocar el mouse en una almohadilla térmica. Afeita la extremidad trasera y comprueba si hay sedación realizando un pellizco en el dedo del pie. Coloque el ratón en la tabla de disección y retire la piel de la pierna.

Use dos alfileres de modista para asegurar la extremidad trasera en el pie y en el músculo gracilis. Coloque una lámpara de calentamiento sobre el mouse para mantener la temperatura corporal central a 37 grados centígrados y superfusione continuamente todos los músculos expuestos con un tampón de timbre caliente bajo un microscopio estereoscópico, diseccione la piel para exponer el tendón TA distal y el ligamento extensor, y retire suavemente la fascia que cubre el músculo TA. Cortar el ligamento extensor para liberar el tendón TA distal.

Corta el tendón TA distal y úsalo para eliminar el músculo TA con un trozo fino de algodón empapado en tampón de ringer. Detener la hemorragia causada por la ruptura de la vasculatura del músculo TA. A continuación, con una sutura de seda de pan, haga un nudo cuadrado doble seguido de un nudo de bucle en la unión distal del músculo tendinoso del músculo EDL.

A continuación, haga una incisión en el músculo bíceps femenino para exponer el tendón proximal y hacer el mismo conjunto de nudos en la unión del músculo proximal y el tendón. Usa la misma línea de sutura para hacer un nudo cuadrado doble. Para asegurar el brazo de palanca, gancho a los nudos proximales o distales.

Para diseccionar suavemente el músculo EDL de la extremidad posterior. Primero, corte el tendón proximal superior a los nudos de sutura y corte la vasculatura debajo del músculo. A continuación, corte el tendón distal inferior al nudo de sutura.

Cubra la extremidad trasera expuesta con un trozo de algodón empapado en timbres. Finalmente, coloque el gancho en el brazo de la palanca y alinee los músculos verticalmente entre los electrodos. Asegure la línea de sutura distal al poste fijo.

Sumerge el músculo en el tampón del timbre y ajusta la tensión de reposo a 1,0 gramos. Permita que el músculo se equilibre durante al menos 10 minutos. Para medir las propiedades contráctiles del músculo EDL, establezca los parámetros para cada uno de los siguientes protocolos en el software DMC como se presenta aquí.

Para el primer protocolo, estabilice el músculo EDL estimulándolo tres veces a 150 hercios con un descanso de 62 entre estimulaciones. Para el segundo protocolo, permita que los músculos se relajen durante dos minutos y luego determine la longitud óptima o LN estimulando el músculo EDL a diferentes tensiones en reposo. Utilice el calibrador digital para medir la longitud óptima del músculo entre los nudos distal y proximal.

Deja que el músculo se relaje durante dos minutos. Para el protocolo tres, ajuste la tensión en reposo a L nada y mida la fuerza muscular en la estimulación de una sola contracción. Determine la tensión de contracción o pt, el tiempo hasta la tensión máxima o TPT y el tiempo de relajación medio del pt.

Deja que el músculo se relaje durante dos minutos. Para llevar a cabo el cuarto protocolo, ajuste la tensión en reposo a LN y mida la fuerza del músculo testicular generada a diferentes frecuencias de estimulación. Mida el P NAUGH donde la fuerza muscular alcanza la fuerza titánica máxima.

Mida el tiempo hasta el pico de tensión y la mitad del tiempo de relajación para el p. Comience el protocolo cinco permitiendo que el músculo se relaje durante cinco minutos, ajuste la tensión en reposo a L Naugh y aplique 10 ciclos de contracciones excéntricas con dos minutos de descanso entre ciclos. Calcule la pérdida de fuerza relativa de la PN después de cada ciclo de contracción excéntrica.

Finalmente, separe el músculo EDL del aparato y corte los tendones en el sitio de sutura. Determine el peso muscular húmedo y calcule el área de la sección transversal del músculo. Para medir las propiedades pasivas del músculo EDL, diseccione el músculo EDL contralateral y conéctelo al aparato como se demostró anteriormente.

En este video, someta el músculo a un protocolo de estiramiento de seis pasos en el que el músculo se tensa al 160% en incrementos del 10%. Analice el perfil de deformación por estrés para evaluar la propiedad viscosa del músculo EDL, estire y mantenga el músculo al 10%L cero y mida la tasa de relajación del estrés en los siguientes períodos de tiempo. Comience calentando la etapa animal termocontrolada a 37 grados centígrados con agua circulatoria.

Encienda y cargue el software DMC. Después de exponer el músculo TA en la extremidad trasera del ratón anestesiado, use una sutura de seda de pan para hacer un nudo cuadrado doble alrededor del ligamento rotuliano. A continuación, haga un nudo cuadrado doble seguido de un nudo en bucle en la unión músculo-tendinosa o MTJ del tendón ta distal.

Utiliza la misma sutura para hacer un bucle aproximado de 10 milímetros. Coloque al animal boca abajo y exponga el músculo bíceps femenino. Exponga el nervio ciático y haga un nudo cuadrado doble alrededor de su extremo proximal.

Corta el nervio superior al nudo y disecciona cuidadosamente alrededor de cinco milímetros de su longitud hacia la rodilla. No estire ni dañe el nervio. Prepare el músculo ta contralateral como se demostró anteriormente en este video y cubra una de las extremidades traseras con un trozo de algodón empapado en tampón de timbre.

A continuación, coloque al animal boca abajo en la plataforma del animal y use las líneas de sutura del ligamento rotuliano alrededor de la rodillera para hacer un nudo cuadrado doble para asegurar la rodilla. Luego, después de sujetar las patas en el bloque de protección SIL, asegure la plataforma del animal en la plataforma termocontrolada y coloque la lámpara de calor para mantener la temperatura corporal central del animal a 37 grados centígrados. Después de colocar el electrodo en la plataforma, conecte el nervio ciático al electrodo, luego corte el tendón TA de la extremidad posterior descubierta distal al nudo distal y fije el lazo de sutura al gancho del brazo de palanca.

Cubra el músculo expuesto de la extremidad posterior con timbres tibios, tampón de algodón empapado para registrar las medidas contráctiles del músculo TA. Utilice los parámetros y el protocolo del software DMC que se ha demostrado anteriormente en este vídeo para el músculo EDL y utilice el software para analizar los datos. Después de tomar medidas del músculo TA, separe el asa distal de sutura del tendón TA del gancho del brazo de palanca y mida las propiedades contráctiles del músculo TA contralateral como se demuestra Después de sacrificar al animal, retire los músculos TA y determine su peso húmedo.

Para calcular el área de la sección transversal, esta tabla muestra las propiedades morfométricas del músculo EDL en ratones negros normales 10 y deficientes en distrofina o MDX a los cuatro a seis meses de edad. Aquí se muestran las propiedades contráctiles y pasivas representativas del músculo EDL de ratones negros 10 y MDX, incluyendo el tiempo de fuerza titánica máxima específica de la fuerza de contracción hasta la tensión máxima y el tiempo de relajación medio de la fuerza titánica máxima absoluta. El tiempo hasta la tensión máxima y el tiempo de relajación media también se pueden calcular a partir de la fuerza de contracción absoluta.

El perfil de deformación por estrés y la tasa de relajación por estrés se utilizan para describir las propiedades pasivas del músculo EDL. La ausencia de distrofina tiene un impacto significativo en las propiedades contráctiles y pasivas del músculo EDL. Las fuerzas específicas de Twitch y Titanic se reducen significativamente en el músculo M-D-X-E-D-L.

Por ejemplo, el tiempo hasta la tensión máxima es significativamente más rápido, mientras que el tiempo de relajación media es significativamente más lento en el músculo M-D-X-E-D-L. Además, el perfil de deformación por estrés sugiere que la rigidez aumenta significativamente en el músculo M-D-X-E-D-L. El músculo M-D-X-E-D-L también produce una fuerza de resistencia significativamente mayor antes de alcanzar el pico de estrés, mientras que el estrés posterior al pico disminuye mucho más rápido.

Además, la tasa de relajación del estrés fue significativamente mayor en el músculo M-D-X-E-D-L en comparación con la del músculo negro 10 EDL. Una vez dominado el procedimiento de disección, el análisis ex vivo de la propiedad contráctil y pasiva del músculo EDL se puede realizar en 40 minutos. Y la evaluación in situ de la propiedad contráctil de ambos músculos TA se puede realizar en 60 minutos después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores evaluaran las propiedades contráctiles y pasivas del músculo esquelético en el campo de la enfermedad muscular para ayudar a determinar la eficiencia del tratamiento después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como el análisis histopatológico del músculo esquelético para responder a preguntas adicionales. Por ejemplo, el efecto del tratamiento experimental sobre la histopatología del músculo esquelético.