Extracelularmente Identificar las neuronas motoras de un músculo en la piscina Motor Aplysia californica

El objetivo general de este procedimiento es identificar extracelularmente las neuronas motoras individuales para un grupo de motores, y luego monitorearlas y controlarlas durante los patrones motores. Esto se logra colocando primero la masa bucal preparada de plegia con electrodos de gancho conectados a nervios clave en una placa de registro especializada, y luego preparando los ganglios bucales y los ganglios cerebrales para la estimulación extracelular y los registros. El segundo paso es conectar electrodos de succión a los nervios y músculos clave de la masa bucal para conectar transductores forzados al músculo objetivo y colocar electrodos de vidrio extracelular en la vaina de los ganglios bucales.

A continuación, localice las neuronas motoras objetivo con los electrodos de vidrio extracelular. El paso final es estimular y registrar extracelularmente las neuronas motoras objetivo mientras se miden simultáneamente las fuerzas de contracción muscular. En última instancia, la técnica de estimulación y registro extracelular se utiliza para mostrar la identificación de neuronas motoras individuales y su actividad neuronal durante diferentes patrones motores similares a la alimentación.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la identificación intracelular de neuronas, es que las conferencias de vidrio extracelular pueden identificar y monitorear múltiples neuronas motoras en la misma preparación durante los movimientos musculares. Jeff McManus, otro estudiante graduado de mi laboratorio, ayudará a demostrar el procedimiento. En este procedimiento para preparar los electrodos de succión, primero corte un trozo de tubo de polietileno de unos 10 centímetros de largo. Sujeta el tubo por ambos extremos y colócalo muy cerca de la llama generada por el mechero bunsen mientras lo giras hasta que se ablande.

A continuación, estira el tubo con cuidado mientras lo alejas de la llama. La parte media del tubo se alargará y se estrechará a medida que se tire de él, después de eso, corte el tubo por la mitad para formar dos electrodos de sección. Estos electrodos de succión generalmente se aplican en los extremos cortados de los nervios o músculos, aunque a veces se pueden aplicar al paso.

Después de colocar los electrodos de gancho bajo el microscopio, corte el nervio bucal y el nervio esofágico bilateralmente en el punto de unión a la masa bucal. A continuación, tire del ganglio cerebral hacia adelante para apartarlo del camino del músculo I dos. A continuación, corte el músculo I dos sobre el saco ular.

Extienda el corte lateral y anteriormente y tire del colgajo del músculo I dos hacia adelante para exponer el nervio ular. Corte las dos ramas RN y asegúrese de que las ramas sean lo suficientemente largas para la fijación del electrodo de succión. Continúe el corte en un círculo amplio alrededor de los ganglios bucales.

Tenga cuidado de no cortar los BN de dos o de tres BN hasta que los ganglios bucales y la parte adjunta del músculo I dos puedan separarse completamente de la masa bucal. Después de eso, corte los tres BN bilaterales en el punto de fijación a la masa bucal más allá de la fijación del electrodo de gancho. A continuación, aplique una fina capa de grasa para vacío a la muesca de la placa de grabación que conecta la cámara trasera y la plataforma central.

Posteriormente, aplique una fina capa de superpegamento de gel rápido en el fondo de vidrio de la cámara frontal donde se colocará la masa bucal. Transfiera con cuidado el ganglio cerebral, los ganglios bucales y la masa bucal a la placa de registro. Asegúrese de que ninguno de los electrodos del gancho esté apretado, lo que podría dañar los nervios.

A continuación, coloque con cuidado la masa bucal sobre el pegamento en la cámara frontal de la placa de grabación. Asegúrese de que su superficie ventral esté pegada al fondo del plato y evite que los ganglios y los electrodos toquen el pegamento. Luego, agregue solución salina de plegia al plato para inducir el fraguado del pegamento.

Luego, bajo el microscopio, agarre la vaina del ganglio cerebral y tire de ella hacia la cámara posterior con un par de pinzas y asegúrese de que los hemogramas atraviesan la muesca. A continuación, fije los nervios del ganglio cerebral que no sean los CBC. Para evitar daños a los hemogramas intactos.

Aplique más grasa de vacío sobre los CBC de modo que la parte superior de la grasa de vacío quede ligeramente más alta que la pared de protección y no se produzcan fugas entre las cámaras. A continuación, añade más solución salina plegia a ambas cámaras del plato para que los ganglios queden completamente sumergidos. Para estabilizar los ganglios bucales, el primer alfiler, los extremos de los tres BN en la base del cigarro de la plataforma central.

Dado que los tres BN se registrarán utilizando electrodos de gancho, los pines deben colocarse más distalmente que los puntos de fijación de los electrodos de gancho y luego sujetar los extremos de los BN y los extremos. A continuación, utilice dos pasadores, que se han doblado 90 grados, como ganchos para estirar y anclar los CBC de modo que no se dañen. A continuación, sujete las ramas RN entre la cámara posterior y los ganglios bucales.

Luego, el músculo I dos estará en la parte superior de los ganglios bucales para exponer los dos nervios I, use fórceps para agarrar el músculo I dos y tirar de él sobre los ganglios bucales y sujetar dos esquinas del músculo I dos para evitar dañar el nervio I dos. Después, corte el nervio I dos distal hasta el punto donde sus dos ramas, inerve el músculo I dos y corte el resto del músculo I dos y voltee el nervio I dos hacia atrás sujetando el nervio I dos entre las dos ramas RN. A continuación, ajuste la ubicación de los clavos para estirar y agregar tensión si un nervio está demasiado flojo o para liberar la tensión si un nervio está demasiado apretado.

Para estabilizar aún más los ganglios bucales, agregue más clavos en la vaina entre los nervios. Dado que los ganglios bucales están colocados con el lado del ojo hacia arriba, gire los ganglios bucales. Si las neuronas de interés están en el lado rostral.

Para rotar uno de los dos ganglios bucales, use pinzas finas para agarrar un poco de la vaina sobrante del hemograma que está cerca de los ganglios bucales. A continuación, fije el exceso de la vaina del CBC entre el CBC y el BM tres, y añada un alfiler adicional en la vaina del ganglio bucal en el lado cercano a la cámara frontal para minimizar el movimiento del ganglio bucal. Para recortar la vaina que cubre los ganglios bucales.

Use pinzas finas para agarrar la vaina en el lado cercano a la cámara posterior. A continuación, corte el exceso de vaina con unas tijeras finas sin exponer los cuerpos celulares. Con el fin de minimizar el daño, solo retire la cantidad mínima de vaina necesaria para ver los cuerpos celulares.

Después de recortar la vaina de los ganglios bucales, tire del nervio iTune y los RN sobre los ganglios bucales y sujételos entre los ganglios bucales y la cámara frontal. Para rotar aún más los ganglios bucales y llenar el electrodo con solución salina aple, conecte el extremo libre de un tubo de polietileno de 15 a 20 centímetros de largo en la jeringa al extremo del electrodo de vidrio. A continuación, tire del émbolo de la jeringa hacia atrás para llenar el electrodo con una solución salina de plegia.

Coloque el electrodo de vidrio extracelular lleno en la muesca del soporte del manipulador. A continuación, utilice el manipulador para colocar la punta del electrodo en la solución salina de plegia que contiene los ganglios bucales. Después de eso, inserte un cable plateado de cloruro de plata en el electrodo para dar servicio al cable de grabación y conéctelo a un cable BNC que se conecta al amplificador.

A continuación, conecte otro cable al cable BNC para que sirva como cable de referencia con el otro extremo del cable colocado en la solución salina de la plejia. En este paso, recorte el extremo estrecho de la punta del electrodo de succión para que coincida con el diámetro del nervio. El diámetro interior de la punta del electrodo debe ser similar o ligeramente menor que el diámetro del nervio para garantizar una succión ajustada.

Dado que el nervio iTune y el RN están muy cerca el uno del otro, coloque sus electrodos en el mismo manipulador para ahorrar espacio. Gire los dos electrodos y asegúrese de que sus puntas estén cerca una de la otra. A continuación, elija uno de ellos para la grabación de nervios iTune, el otro para la grabación RN.

Coloque la punta del electrodo en la solución salina de la plegia. Conecte el extremo libre del tubo de polietileno de la jeringa al electrodo de succión. A continuación, utilice la jeringa para llenar el electrodo con solución salina aple.

Posteriormente, mueva la punta del electrodo cerca del extremo del nervio I dos y use la jeringa para succionar el nervio en el electrodo. La longitud del nervio dentro del electrodo debe ser de aproximadamente 0,5 a un milímetro. Para asegurar un sellado hermético, repita la succión del electrodo que se conectará al rn para conectar los transductores de fuerza al músculo.

Doble la aguja curva de cada sutura y ate la sutura al transductor de fuerza. Agarre y levante suavemente una pequeña cantidad de músculo con pinzas e inserte la aguja a través de la parte posterior del músculo I uno I tres hasta el punto doblado de la aguja. Ahora conecte otro transductor de fuerza a la parte anterior del músculo en las mandíbulas.

A continuación, levante los transductores de fuerza hasta que las suturas se tensen, pero no estire demasiado para comprobarlo. Vea la medición desde el transductor de fuerza cuando la sutura tiene cierta holgura. Después de eso, levante el transductor hasta que la medición esté ligeramente por encima de este nivel de referencia.

Para localizar una neurona candidata, use el manipulador para presionar suavemente la punta del electrodo de vidrio extracelular sobre la vaina sobre el centro del soma neuronal, que es la mejor ubicación para la estimulación y el registro de la selectividad celular. Esta figura muestra la estimulación extracelular de B tres y el registro del soma B tres, así como de las regiones nerviosas y musculares correspondientes de arriba a abajo. Los canales son los registros del soma B tres, el BN contralateral dos, el BN dos ipsilateral, el BN tres ipsilateral, la fuerza de contracción de la región anterior del músculo I uno I tres y la fuerza de contracción de la región posterior del músculo I uno I tres.

El recuadro azul resalta la duración de las fuerzas en las regiones anterior y posterior del músculo I, uno, I, tres, B, tres, solo se proyecta en el BN dos ipsilateral. Aquí están las grabaciones extracelulares del B, tres, soma y nervios en un patrón motor similar al EST, así como un patrón motor similar al ingente. Los recuadros azules indican las fases de protracción y retracción de los patrones.

Las barras rojas en el canal SOMA B 3 resaltan los potenciales de acción registrados desde el soma B 3, mientras que las barras rojas en el canal IB 2 indican el momento correspondiente cuando B 3 está disparando en el BN 2 ipsilateral. Durante la alimentación, patrones motores. Tenga en cuenta que la unidad BN dos de B tres es la más grande de todas las unidades.

Por lo tanto, también podemos detectar el BN dos unidades de B tres directamente desde las grabaciones BN dos sin registros SOMA. Esta figura muestra la estimulación extracelular de B 43 y el registro de su soma, así como de las regiones nerviosas y musculares correspondientes de arriba a abajo. Los canales son registros del soma B 43, el BN contralateral dos, el BN ipsilateral dos, el BN ipsilateral tres, la fuerza de contracción de la región anterior del músculo I uno I tres y la fuerza de contracción de la región posterior del músculo I uno I tres.

El recuadro azul resalta las mediciones de fuerza del músculo I uno I tres durante B 43. La actividad B 43 se proyecta solo en el BN dos ipsilateral. Aquí están las grabaciones extracelulares del soma B 43 y los nervios en un patrón motor similar a la ingesta, así como un patrón motor similar a la ingesta.

Los recuadros azules indican las fases de protracción y retracción de los patrones. Las barras rojas en el canal SOMA B 43 resaltan los potenciales de acción registrados en el soma B 43, mientras que las barras rojas en el canal IBN dos indican el momento correspondiente cuando B 43 está disparando en el BN 2 ipsilateral. En estos patrones, obsérvese que las unidades BN dos de B 43 son pequeñas y muy difíciles de detectar sin registros de verano, pero disparan constantemente al final del programa motor BN dos, lo que proporciona otra forma de identificarlas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar extracelularmente neuronas modernas individuales para múltiples.