Name: Marcaje metabólico del ARN recién transcrito para alta resolución Gene perfiles de expresión de la síntesis de RNA, producción y descomposición en cultivo celular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprende a medir la síntesis, procesamiento y degradación del ARN en cultivos celulares eucariotas mediante marcaje metabólico con 4-tiouridina. Este método aumenta diez veces la sensibilidad para detectar cambios en la expresión génica.

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Nos gustaría dar las gracias a Amie Regan de una cuidadosa lectura del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por NGFN Plus subvención # 01GS0801, MRC comunión subvención y subvención G1002523 NHSBT WP11-05 al LD ​​y DFG subvención FR2938/1-1 de CCF

1. Marcaje metabólico con 4-tiouridina Haga un plan detallado de la configuración experimental / calendario, por ejemplo, cuándo agregar la 4SU de cultivo celular y cuándo cosechar las muestras. Plan de al menos 5 minutos entre cada condición. Sólo el tratamiento de células de un estado a la vez. Maneje max. 3 - 5 platos en un momento dado. Manipular las células tan rápidamente como sea posible para reducir al mínimo los cambios en la temperatura y los niveles de CO 2. Evite la exposición de las células a la luz brillante después de añadir 4SU ya que esto puede dar lugar a la reticulación de RNA 4SU marcados a las proteínas celulares. Inicio de etiquetado <ol><li> Descongelar 4-tiouridina (4SU) justo antes de uso y la pipeta cantidad requerida de 4SU para cada condición en un tubo Falcon estéril. </li><li> Tomar la cantidad requerida de medio de cultivo celular (5 ml por placa de 10 cm) de los platos y añadir a tubo Falcon 4SU que contiene y mezclar bien. Retire y deseche el medio restante de los platos. </li> &lt;li&gt; Aplicar 4SU medio que contiene de nuevo a los platos. </li></ol> Fin de etiquetado <ol start="4"><li> Retire el medio de cultivo celular de las células. Añadir 5 ml de Trizol a cada placa. Para los experimentos de complejos incluyendo múltiples puntos de tiempo o condiciones, este paso se lleva a cabo mejor por dos personas, una eliminación del medio, el otro la adición de Trizol y cosechar el lisado. </li><li> Incubar durante 5 min a temperatura ambiente para la lisis celular completa. </li><li> Utilice una pipeta de 10 ml para enjuagar la placa cuidadosamente con el Trizol añadido. Esto ayuda a la lisis celular completa y recuperación de la muestra. Maneje con cuidado ya Trizol es extremadamente peligroso al entrar en contacto con la piel o los ojos! Tener un antídoto para las quemaduras de fenol en la mano (por ejemplo, polietilenglicol 300 o 400 en alcoholes metilados industriales (70:30)). Transferir las muestras a tubos de polipropileno. Tenga en cuenta que los tubos Falcon estándar no resisten estas elevadas fuerzas g). Las muestras pueden ser almacenadas a -20 ° C durante al menos un mes hasta el ARN total is preparado. </li></ol> 2. Preparación de ARN usando Modificado Protocolo de Trizol <ol><li> Añadir 1 ml de cloroformo (0,2 ml por ml de Trizol) y agitar vigorosamente durante 15 segundos. Incubar a temperatura ambiente durante 2 - 3 min. </li><li> Centrifugar a 13.000 × g durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Transferir fase superior acuosa (que contiene el ARN) a un nuevo tubo de 15 ml de polipropileno. </li><li> Añadir ½ del volumen de reacción de precipitación de amortiguación tanto ARN e isopropanol (por ejemplo, a 3 ml de sobrenadante añadir 1,5 ml de tampón de precipitación ARN y 1,5 ml de isopropanol). </li><li> Mezclar bien. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Centrifugar a 13.000 × g durante 10 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante. </li><li> Centrifugar brevemente (5000 × g durante 30 segundos) y retirar el isopropanol residual con 200 l pipeta. </li><li> Añadir un volumen igual de etanol al 75% y agitar tubo hasta que se desenganche el pellet. Evite romper en muchos pedazos pequeños como esto puede hacer que la eliminación de secuelasl etanol difícil. </li><li> Centrifugar a 13.000 × g durante 10 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante. </li><li> Centrifugar brevemente ARN y eliminar el etanol restante con una pipeta de 200. Repita el paso y retirar el etanol restante con una pipeta de 20. Después de estos dos pasos, se debe realizar no más secado del pellet. </li><li> Añadir 100 l de H 2 O por 100 g de ARN rendimiento esperado y mezclar bien pipeteando arriba y abajo 5 - 6 veces para ayudar a disolver el ARN. </li><li> Disolver y desnaturalizar el ARN mediante calentamiento a 65 ° C durante 10 minutos (agitador) y colocar inmediatamente en hielo. </li><li> Medir la concentración de ARN a 260 nm utilizando un espectrofotómetro NanoDrop, siguiendo las instrucciones del fabricante. Este ARN se puede almacenar a -80 ° C durante al menos un mes. </li></ol> 3. Biotinilación tiol específica de recién transcritos de ARN <ol><li> Comience con 60-80 g de ARN celular total. </li><li> Constituir el etiquetado de reacción. Pipetear en el siguienteorden (por mu g de ARN): <ol class="lalpha"><li> 1 l de tampón 10x Biotinilación </li><li> 7 l de ARN (que contienen 1 RNA mu g diluidos en nucleasa libre de H 2 O) </li><li> 2 l de biotina-HPDP (1 mg / ml de DMF) </li></ol></li></ol> Siempre agregue la biotina HPDP pasado y mezclar inmediatamente con la pipeta. En caso de que la biotina precipita, contenido de DMF se puede aumentar a una concentración final de 40%. <ol start="3"><li> Incubar a temperatura ambiente durante 1,5 horas con rotación. </li><li> Añadir un volumen igual de cloroformo. Mezcle vigorosamente. Incubar durante 2 - 3 minutos hasta que las fases comienzan a separarse y burbujas comienzan a desaparecer. </li><li> Se centrifuga a 20000 × g durante 5 min a 4 ° C. Transferir con cuidado la fase acuosa superior a un nuevo tubo. </li><li> Repetir los pasos 3.4 y 3.5 una vez. Es posible que desee llevar a cabo este paso en 2 ml de fase Lock Gel tubos pesados ​​para reducir la pérdida de RNA. </li><li> ARN precipitación: añadir 1/10 del volumen de NaCl 5 M y un volumen igual deisopropanol a la fase acuosa. </li><li> Se centrifuga a 20000 × g durante 20 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante. </li><li> Añadir un volumen igual de 75% de etanol, se centrifuga a 20.000 xg durante 10 min a 4 ° C, desechar el sobrenadante. </li><li> Girar brevemente y eliminar el etanol residual con 200 l pipeta. </li><li> Girar brevemente y eliminar el etanol residual con 20 l pipeta. </li><li> No permita que el ARN se sequen. Vuelva a suspender en 50 a 100 l H 2 O (~ 1 l por 1 entrada g ARN). Mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo 5-6 veces. </li><li> Comprobar la calidad del ARN por análisis electroforético de excluir la degradación del ARN. </li></ol> 4. Dot Blot análisis de 4SU incorporación (Opcional) Incorporación 4SU puede ser fácilmente determinada por análisis de transferencia de punto de ARN con biotina. Este es un paso opcional que permite la resolución de problemas y la estimación de las tasas de incorporación 4SU relativas a un control oligo ADN biotinilado. Para este ensayo se recommend usando yodoacetil-biotina en lugar de biotina-HPDP para la biotinilación de ARN 4SU marcados en el paso 3.2. Esto resulta en una biotinilación irreversible de 4SU-ARN. Por lo tanto, los métodos basados ​​en columnas (por ejemplo RNeasy) se pueden utilizar para la recuperación de cantidades mucho más pequeñas de ARN biotinilado (por ejemplo, 5 g). Mientras que el uso de ARN biotinilado biotina-HPDP también es adecuado para este ensayo, la señal resultante es más débil y la relación señal-ruido menos favorable (Figura 3). <ol><li> Siga el protocolo para 4SU el etiquetado y el aislamiento de ARN celular total como se describe en las secciones 1 y 2. </li><li> Biotinilar 4SU marcado RNA como se describe en la sección 3 reemplazando biotina HPDP con yodoacetilo-biotina y realizar dos extracciones cloroformo para eliminar completamente excesivos residuos yodoacetilo-biotina. </li><li> Recuperar ARN con biotina por isopropanol / precipitación con etanol como se describe o utilizando un enfoque basado en columnas (por ejemplo RNeasy) en el caso de pequeñas cantidades de ARN (&lt;10 g) Se utilizan. </li><li> Incubar la membrana Zeta en agua libre de nucleasa con agitación durante 10 min. </li><li> Tome la membrana fuera del agua libre de nucleasa y eliminar el exceso de líquidos mediante la colocación de la membrana en entre dos toallas de papel limpias y presión firmemente. El secado al aire de la membrana durante 5 minutos se traducirá en puntos más agradables. </li><li> Para cada muestra, preparar 20 l de 200 ng de ARN / l blot utilizando tampón de unión fría del punto de hielo (NaOH 10 mM, EDTA 1 mM). Aplicar 5 l de esta dilución (es decir, 1 g de ARN), así como tres diluciones de 10 veces posteriores (es decir, 100, 10, y 1 ng de ARN, respectivamente) a la membrana Zeta por pipeteado. Pipeteado a través de un rack vacío de puntas de pipeta puede ser empleada para proporcionar una separación distribuido uniformemente. Alternativamente, utilizar un aparato de transferencia de puntos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Aplicar 5 l de la biotina marcada con oligo de ADN a concentraciones que van desde 20 ng / l a 20 pg / l (es decir, 100 a 0,1 ng de oligo) como un cont positivorol a la membrana mediante pipeteo. Utilice una muestra biotinilado, 4SU-ingenuo como control negativo. </li><li> Aire secar la membrana durante 5 min. </li><li> Se incuba la membrana durante 30 min en 40 ml de tampón de bloqueo con balanceo. </li><li> Incubar la membrana con 10 ml de 1:1000 de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante durante 15 minutos (5 ml de PBS + 5 ml de SDS al 20% + 10 l de estreptavidina peroxidasa de rábano picante) </li><li> Lavar la membrana dos veces en 40 ml de PBS + 10% de SDS (20 ml de PBS + 20 ml de SDS al 20%) durante 5 min. </li><li> Lavar la membrana dos veces en 40 ml de PBS + 1% de SDS (38 ml de PBS + 2 ml de SDS al 20%) durante 5 min. </li><li> Lavar la membrana dos veces en 40 ml de PBS + 0,1% de SDS (40 ml de PBS + 200 l 20% de SDS) durante 5 min. </li><li> Retire el exceso de líquido mediante la colocación de la membrana entre dos toallas de papel limpias y presionando firmemente. </li><li> Visualizar HRP unida a la membrana utilizando ECL según las instrucciones del fabricante. </li><li> Colocar la membrana en papel de aluminio / bolsa de plástico, eliminar las burbujas de aire y se incuba durante 2 minutos en la oscuridad. </li><li> Exponga membranapelícula durante 1 - 5 min. </li></ol> 5. La separación de RNA con y sin etiqueta usando perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina <ol><li> Calor tampón de lavado (3 ml por muestra) a 65 ° C en un baño de agua. </li><li> Prepare fresco ditiotreitol 100 mM (DTT) en nucleasa libre de H 2 O. Hacerlo por decantación 15 - 30 mg de polvo de TDT en un tubo Falcon de 50 ml limpio colocado en la escala ultra-fino. Pese y agregue la cantidad necesaria de nucleasa libre de H 2 O. </li><li> Calor biotinilado muestras de ARN a 65 º C durante 10 min para desnaturalizar e inmediatamente se coloca sobre hielo. </li><li> Lugar μMacs columnas en el soporte magnético. Se recomienda no procesar más de 12 muestras a la vez (6-8 muestras son óptimas). </li><li> Columnas Pre-equilibre Miltenyi con 1 ml de tampón de lavado temperatura ambiente. Esto tomará alrededor de 15 min. </li><li> Mientras tanto, añadir 100 l de perlas de estreptavidina a 50 - 100 l de ARN con biotina. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos con rotación. </li> &lt;<html> li&gt; Si cualquiera de las columnas no se ha iniciado el drenaje por ahora esto puede facilitarse por presionando suavemente en la parte superior de la columna con un dedo enguantado. Una vez que el flujo ha comenzado las columnas drenan fácilmente. </li><li> Aplicar los ARN / los granos para las columnas. Deseche el flujo continuo a menos que quiera recuperar la fracción de ARN sin etiqueta (ver sección 7). </li><li> Lavar tres veces con 0,9 ml de 65 ° C de tampón de lavado (1 ml puntas de pipeta se encogen al pipetear tampones a 65 ° C). </li><li> Lavar tres veces con 0,9 ml de tampón de lavado temperatura ambiente. </li><li> Pipetear 700 l RLT Buffer (Kit de Limpieza MinElute RNeasy, Qiagen) en nuevos tubos de 2 ml y se colocan debajo de las columnas. </li><li> Se eluye el ARN recién transcrito en el búfer RLT mediante la adición de 100 l de DTT 100 mM a las columnas. </li><li> Lleve a cabo una ronda de elución segundos 3 minutos más tarde en el mismo tubo mediante la adición de otros 100 l de DTT 100 mM. </li></ol> 6. La recuperación de recién ARN transcrito ontenido &quot;&gt; Continuar con la limpieza MinElute RNeasy (Qiagen) de protocolo siguiendo las instrucciones del fabricante. Elute en 25 l de H 2 O. Medir concentraciones de ARN sin nucleasa usando un espectrofotómetro Nanodrop. Para evitar la necesidad de descongelar y volver a congelar RNA antes de presentar a un ensayo de alto rendimiento, se recomienda la preparación de ADNc inmediatamente después de la recién transcrito de ARN se purifica. Utilizar 2,5 l de los ARN recién transcrito en 20 l de la mezcla de síntesis de ADNc para la síntesis de ADNc, siguiendo las instrucciones del fabricante. Realizar controles de QRT-PCR utilizando 1 : 10 diluciones de la mezcla de ADNc de la tienda de ARN a -80 ° C.. 7. Recuperación de sin rotular, consolidar RNA (Opcional) En caso de que el ARN no unido necesita ser recuperado; recolectar y combinar el flujo a través (después de añadir la solución de perlas de estreptavidina-ARN a las columnas) y del primer lavado para su posterior precipitación. Por lo general, es suficiente para precipitar sólo el 50% del ARN no unido como this contendrá&gt; 80% del material de partida. <ol><li> Añadir un volumen igual de isopropanol (no necesita ninguna sal que se añade como el tampón de lavado ya contiene 1 M de NaCl). </li><li> Se centrifuga a 20000 × g durante 20 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante. </li><li> Añadir un volumen igual de 75% de etanol, se centrifuga a 20.000 xg durante 10 min a 4 ° C, desechar el sobrenadante. </li><li> Girar brevemente y eliminar el etanol residual con 200 l pipeta. </li><li> Girar brevemente y eliminar el etanol residual con 20 l pipeta. </li><li> No permita que el ARN se sequen. Resuspender en 100 l H 2 O. Mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo 5-6 veces. Incubar a 65 ° C durante 10 min con agitación y transferir directamente a hielo. </li><li> Comprobar la calidad del ARN por análisis electroforético de excluir la degradación del ARN. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Metabólicas etiquetado de recién transcrito RNA aumenta sustancialmente el poder de las tecnologías de alto rendimiento como los microarrays y RNA-Seq, proporcionando plantillas más adecuadas para hacer frente a la cuestión biológica de interés. El presente protocolo se sometió a una amplia optimización. Se permite el enriquecimiento&gt; 1.000 veces de ARN recién transcrito y proporciona resultados altamente reproducibles. El diseño experimental de un experimento de 4SU-etiquetado es de impo...

Perfiles de expresión génica es una herramienta clave usada para estudiar los procesos celulares y la red asociada a la interacción compleja. Los estudios sobre la abundancia de ARNm han sido por lo general el método de elección para obtener conocimientos básicos sobre los mecanismos moleculares subyacentes. El desarrollo de microarrays de todo el transcriptoma 1 y, más recientemente, de secuenciación de nueva generación de ARN (ARN-ss) 2-4 alimentó este enfoque. Aunque estas tecnologías han revolucionado nuestra comprensión de la complejidad de la expresión génica celular, se enfrentan a limitaciones importantes debido a las propiedades intrínsecas de la muestra de la plantilla, es decir, ARN celular total. Primero, los cambios a corto plazo en los niveles de ARN total no se ajustan a los cambios en las tasas de transcripción, pero son inherentemente dependiente en la vida media de los respectivos transcripciones de ARN. Mientras que cinco veces la inducción de una transcripción de corta duración, por ejemplo de codificación para un factor de transcripción, será fácilmente detectable en ARN totaldentro de una hora, la misma inducción de una transcripción de larga duración, por ejemplo, que codifica para una enzima metabólica, permanecerá prácticamente invisible. Además, incluso una completa desconexión (&gt; 1.000 veces baja regulación) de la tasa de transcripción de un gen normal, con una vida media durante cinco horas ARN simplemente se llevará cinco horas para sus niveles de ARN total disminuirá en sólo dos veces . Por lo tanto, el análisis de ARN total favorece la detección de un máximo de regulación de las transcripciones de corta vida, muchos de los cuales codifican para factores de transcripción y genes con funciones de regulación 5. Además, la verdadera cascada de cinética de la regulación se oscurece y eventos de señalización primaria no puede ser diferenciada de la secundaria. Ambos, a su vez, puede dar lugar a un sesgo sustancial en posteriores análisis de la bioinformática. En segundo lugar, las alteraciones en los niveles de ARN total no se pueden atribuir a los cambios en la síntesis de ARN o la caries. Las mediciones de esta última requieren enfoques invasivos de células, por ejemplo, el bloqueo transcriptisobre el uso de actinomicina D 6, y el seguimiento prolongado de curso RNA decadencia en el tiempo. Con un ARNm media de la semivida en células de mamífero de 5 - 10 h 5,7, los niveles de mRNA de la mayoría de los genes sólo se han disminuido en menos de dos veces después de varias horas de detención transcripcional. Estas más bien pequeñas diferencias dan como resultado mediciones imprecisas groseramente de mRNA vida media para la mayoría de los genes celulares debido a la naturaleza exponencial de las ecuaciones matemáticas subyacentes. Por último, mientras que el ARN-ss de ARN celular total reveló que aproximadamente la mitad de nuestros genes están sujetos a eventos alternativos de corte y empalme 8, la cinética subyacentes, así como los mecanismos dinámicos rectores de tejido y el contexto específico de regulación de procesamiento del ARN siguen siendo poco conocidos. Además, la contribución de procesamiento del ARN para la expresión diferencial de genes, en particular para los ARN no codificantes, queda por determinar. En conjunto, estas limitaciones constituyen importantes obstáculos paramodelización cinética bioinformático de los mecanismos moleculares subyacentes. Recientemente hemos desarrollado un enfoque, perfiles de expresión génica denominada de alta resolución, para superar estos problemas 5,7,9. Se basa en el marcaje metabólico de ARN recién transcrito utilizando 4-tiouridina (4SU-etiquetado), un derivado de uridina que ocurre naturalmente, y proporciona acceso directo a las transcripciones recién transcrito con una interferencia mínima en el crecimiento celular y la expresión génica (véase la Figura 1) 5, 10-12. La exposición de células eucariotas a los resultados de 4SU en su rápida absorción, la fosforilación de 4SU-trifosfato, y la incorporación en el ARN recién transcrito. Después del aislamiento del ARN celular total, la fracción de ARN 4SU-marcado es biotinilado tiol-específicamente la generación de un enlace disulfuro entre la biotina y el ARN recién transcrito. &quot;Total RNA celular&quot; puede entonces ser cuantitativamente separado en la etiqueta (&#39;recién transcrita&#39;) y sin marcar (&quot;pre-existing &#39;) ARN con alta pureza usando perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina. Por último, ARN marcado se recupera de las perlas por simple adición de un agente reductor (por ejemplo, ditiotreitol) escindir el enlace disulfuro y la liberación de los ARN recién transcrito a partir de las perlas. Recientemente transcrito de ARN representa la actividad transcripcional de cada gen durante el marco de tiempo de la exposición 4SU. 4SU-etiquetado en el plazo de minutos proporciona así una imagen instantánea de la expresión de genes eucariotas y una plantilla ideal para los análisis bioinformáticas aguas abajo (por ejemplo, el análisis de promotor). En los casos en que se puede suponer condiciones de estado estable, las relaciones entre el recién transcrito / total, recién transcritas / sin etiqueta y sin etiqueta / ARN total proporcionan acceso no invasivo para RNA precisos vida media 7,13. Además, es importante tener en cuenta que los transcritos de ARN recientemente purificadas después de tan poco como 5 minutos de 4SU-etiquetado (5 min 4SU-ARN) es menor de 15 y 60 min 4SU-ARN.Al llevar a cabo tanto de ultra-corta y progresivamente más largo 4SU-etiquetado en un solo entorno experimental combinado con ARN-ss, la cinética de procesamiento del ARN se revelan a una resolución de 9 nucleótidos. Por último, los análisis de tiempo-luego de ARN recién transcrito y totales combinados con modelos computacionales permiten un análisis integral de la síntesis de ARN y la decadencia 14. En conclusión, este enfoque permite el análisis directo de la dinámica de la síntesis de ARN, el procesamiento, y la degradación en las células eucariotas. Es aplicable en todos los principales organismos modelo incluidos los mamíferos, insectos (Drosophila), anfibios (Xenopus), y la levadura 5,15,16. Es directamente compatible con el análisis de microarrays 5,17, ARN-ss 9,13,14, y es aplicable en vivo 12,15. A continuación, detallamos la metodología para etiquetar, aislar y purificar el ARN recién transcrito en células de mamífero cultivadas. Además, potenciómetroSe discuten los problemas y dificultades al.

<table><tbody><tr><td>4-tiouridina</td><td>Carbosynth</td><td>T4509</td><td>Prepare 50 mM de caldo en H2O estéril, almacene a -20 & grados; C en alícuotas de 50-500 &mu; l, deseche el reactivo no utilizado, no vuelva a congelar.</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)</td><td><fuerte>ADVERTENCIA - ¡CORROSIVO y PELIGROSO PARA LA SALUD!</fuerte> Garantizar el acceso inmediato al antídoto del fenol (PEG-Metanol); Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma</td><td>372978</td><td><fuerte>ADVERTENCIA - PELIGROSO PARA LA SALUD</fuerte></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio, sin nucleasas</td><td>Sigma</td><td>C8532</td><td>Prepare una solución madre de 1,6 M con agua sin nucleasas.</td></tr><tr><td>5M NaCl sin nucleasas</td><td>Sigma</td><td>71386</td><td>Solución madre</td></tr><tr><td>H2O</td><td>Sigma</td><td>W4502</td> sin nucleasas <td>Hacer alícuotas de 1 ml en tubos sin nucleasas.</td></tr><tr>Tampón <td></td><td></td><td>de precipitación de ARN</td><td>1,2 M NaCl, 0,8 M de citrato de sodio en agua libre de nucleasas. Prepárese con anticipación en condiciones estrictamente libres de nucleasas. Almacenar a temperatura ambiente en tubos falcon de 50 ml.</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma 459844</td><td></td><td>Úselo con agua libre de nucleasas para preparar etanol al 80%, almacene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>1 M Tris Cl sin nucleasas, pH 7,5</td><td>Lonza</td><td>51237</td><td>Solución madre</td></tr><tr><td>500 mM EDTA sin nucleasas, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>Solución madre</td></tr><tr><td>10x Tampón de biotinilación (BB)</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA en agua sin nucleasas, hacer alícuotas de 1 ml.</td></tr><tr><td>Dimetilformamida (DMF)</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link biotina-HPDP</td><td>Pierce</td><td>21341</td><td>Prepare 1 mg/ml de solución madre disolviendo 50 mg de biotina-HPDP en 50 ml de DMF. Un calentamiento suave mejora la solubilización. Tienda a 4 & grados; C en alícuotas de 1 ml.</td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Tubos pesados 2.0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0032 005.152</td><td>Opcional para la etapa de extracción de cloroformo.</td></tr><tr><td>Membrana zeta</td><td>BIORAD</td><td>162-0153</td><td></td></tr><tr><td>10x Tampón</td><td></td><td></td> de unión a la transferencia de puntos <td>100 mM NaOH, 10 mM</td></tr><tr><td>EDTA Biotina-oligo</td><td></td><td></td><td>5'-biotina, 25 nucleótidos, cualquier secuencia</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>Fisher</td><td>BPE9738</td><td>Para 100 ml de solución madre al 20%, agregue 20 g de SDS a 80 ml de PBS pH 7-8 y ajuste el volumen a 100 ml. Mantenga todas las soluciones de SDS de alto porcentaje por encima de 20 °C. Caliente las soluciones deben precipitar ligeramente SDS.</td></tr><tr><td>EZ-Link Yodoacetyl-LC-Biotin</td><td>Pierce</td><td>21333</td><td>Prepare 1 mg/ml de solución madre disolviendo 50 mg de yodoacetil-biotina en 50 ml de DMF. Un calentamiento suave mejora la solubilización. Tienda a 4 & grados; C en alícuotas de 1 ml. Genera una biotinilación irreversible y específica de tiol.</td></tr><tr><td>Tampón de fosfato solución salina</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> bloqueador <td>de manchas de puntos Mezclar 20 ml 20% SDS con 20 ml 1 x PBS pH 7-8 y añadir EDTA hasta la concentración final de 1 mM.</td></tr><tr><td>Estreptavidina-rábano picante peroxidasa </td><td>Vector Laboratories</td><td>SA5004</td><td>Almacenar a -20 &deg;C. Mezclar 10 ml 20% SDS con 10 ml 1 x PBS. Agregue 20 &mu; l Estreptavidina-HRP antes de su uso. </td></tr><tr><td>Reactivo ECL</td><td>GE Healthcare RNP2109</td><td></td><td>Utilizar siguiendo las instrucciones del fabricante.</td></tr><tr><td>Super RX, Película X-RA, 18x24 cm</td><td>Fujifilm</td><td>47410 19236</td><td></td></tr><tr><td>&mu; Macs Streptavidin Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-074-101</td><td>Guarde las cuentas a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de lavado <td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 en H2O libre de nucleasas.</td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>43817</td><td>Prepare como 100 mM de DTT en H2O libre de nucleasas, siempre prepare fresco antes de usar.</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Almacene las columnas a 4 & deg; C, el resto de los componentes del kit a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno con tapa de rosca de 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.005</td><td>Compatible con Dimetilformamida</td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno con tapa de rosca de 2,0 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.005</td><td>Compatible con Dimetilformamida</td></tr><tr><td>Tubos de 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Compatible con Dimetilformamida</td></tr><tr><td>Tubos de 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Compatible con Dimetilformamida</td></tr><tr><td colspan="4">Todas las soluciones/reactivos deben almacenarse a temperatura ambiente a menos que se especifique lo contrario.</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment </td></tr><tr><td>espectrofotómetro UV/VIS</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 1000</td><td>O equivalente. Utilice un volumen bajo (1-2 &mu; l) para mediciones de bajas concentraciones de ARN para evitar una pérdida excesiva de muestras.</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de polipropileno de 15 ml</td><td>VWR International</td><td>525-0153</td><td>A diferencia de los tubos estándar de 15 ml, estos toleran hasta 15.000 &#215; g</td></tr><tr><td>Centrífuga de alta velocidad</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-25</td><td>O equipo equivalente capaz de alcanzar 13.000&#215; g</td></tr><tr><td>Rotor de alta velocidad</td><td>Beckman Coulter</td><td>JLA-16250</td><td>O equipo equivalente capaz de alcanzar 13,000&#215; g</td></tr><tr><td>Adaptadores para tubos de 15 ml</td><td>Laborger&#228; te Beranek</td><td>356964</td><td>O equipo equivalente capaz de alcanzar 13.000&#215; g</td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>5430 R</td><td>O equivalente.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer compact</td><td>o equivalente.</td></tr><tr><td>Soporte magnético</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>Un soporte tiene capacidad para 8 &mu; Columnas de Macs.</td></tr><tr><td>Beca Baño de Agua</td><td></td><td>SUB Aqua 5</td><td>O equivalente.</td></tr><tr><td>Escala ultrafina</td><td>A& D</td><td>GR-202</td><td>O equivalente.</td></tr><tr><td>E-Gel iBase Power System</td><td>Invitrogen</td><td>G6400UK</td><td>Para geles de ARN; o equivalente.</td></tr><tr><td>E-Gel EX 1% geles prefabricados de agarosa</td><td>Invitrogen</td><td>G4020-01</td><td>Para geles de ARN; o equivalente.</td></tr></tbody></table>

marcaje metabólico del arn recién transcrito para alta resolución gene perfiles de expresión de la síntesis de rna, producción y descomposición en cultivo celular

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

El desarrollo de microarrays de todo el transcriptoma y de secuenciación de nueva generación ha revolucionado nuestra comprensión de la complejidad de la expresión génica celular. Junto con una mejor comprensión de los mecanismos moleculares implicados, las mediciones precisas de la cinética subyacentes se han convertido en cada vez más importante. Aquí, estas metodologías poderosas se enfrentan a grandes limitaciones debido a las propiedades intrínsecas de las muestras de plantilla que estudian, es decir, el ARN celular total. En muchos casos, los cambios en el ARN celular total se producen ya sea demasiado lento o demasiado rápido para representar los eventos moleculares subyacentes y su cinética con suficiente resolución. Además, la contribución de las alteraciones en la síntesis de ARN, el procesamiento, y la decadencia no se diferencian fácilmente. Recientemente hemos desarrollado alta resolución-perfiles de expresión génica para superar estas limitaciones. Nuestro enfoque se basa en el marcaje metabólico de los recién transcrito de ARN con 4-thiouricenar (por lo tanto también se conoce como 4SU-etiquetado) seguido por rigurosa purificación de ARN recién transcrito utilizando biotinilación específico de tiol y perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina. Es aplicable a una amplia gama de organismos, incluyendo vertebrados, Drosophila, y levadura. Hemos aplicado con éxito 4SU-etiquetado para estudiar la cinética en tiempo real de las actividades de factor de transcripción, proporcionar mediciones precisas de ARN vidas medias, y obtener nuevos conocimientos sobre la cinética de procesamiento del ARN. Por último, el modelado computacional se puede emplear para generar un análisis integrado, integral de los mecanismos moleculares subyacentes.

1. Material de Partida y rendimientos esperados Después de 1 hora (h) de 4SU-exposición recién transcrito de ARN representa cerca de 1 - 4% del total de ARN celular. Este será menor en crecimiento detenido células ya que ya no sintetizan ARN para tener en cuenta para el crecimiento celular / replicación. Al etiquetar durante 1 hora, se recomienda iniciar el ensayo con 60 a 80 g de ARN total. A partir de menos de 30 g del total de ARN resultados en pequeños gránulos de ARN que son difíciles de v...

El ARN celular total proporciona una plantilla pobres para el estudio de los cambios a corto plazo en la síntesis de ARN y la descomposición, así como la cinética de procesamiento del ARN. A continuación, describimos marcaje metabólico de ARN recién transcrito con 4-tiouridina seguido por biotinilación específico de tiol y la purificación de ARN recién transcrito que permiten superar estas limitaciones.

Marcaje metabólico del ARN recién transcrito para alta resolución Gene perfiles de expresión de la síntesis de RNA, producción y descomposición en cultivo celular

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Este método tiene como objetivo medir directa y precisamente la cinética del procesamiento y decaimiento de la síntesis de ARN en cultivos de células eucariotas. Las células, en presencia de cuatro tiouridinas, etiquetan metabólicamente el ARN recién transcrito, luego se lisan las células marcadas y se purifica el ARN celular total; a continuación, se realiza una donación específica de biotina tiolada para biotinilar selectivamente las moléculas de ARN recién transcritas. A continuación, se utilizan esferas magnéticas recubiertas de estreptavidina para capturar los transcritos recién transcritos y marcados con tiouridina, separándolos del ARN preexistente, obteniendo fracciones de ARN que contienen ARN total, recién transcrito y no marcado (preexistente).El ARN puede entonces ser sometido a análisis posteriores, incluyendo Q-R-T-P-C-R, microarreglos o secuenciación de nueva generación. En comparación con estudios sobre ARN total celular, el análisis del ARN recién transcrito proporciona un aumento de aproximadamente diez veces en la sensibilidad para detectar cambios a corto plazo en la expresión génica. Además, facilita mediciones precisas de los tiempos de vida media del ARN, y por primera vez revela realmente la cinética del procesamiento del ARN. La marcación metabólica de transcritos recién sintetizados puede aplicarse con éxito para desentrañar los mecanismos moleculares reguladores de la expresión génica.También puede aplicarse a otros organismos modelo como ops, oph y levadura. Comience con un plan detallado del experimento, dejando al menos cinco minutos entre cada condición. Derrita la etiqueta de tiouridina cuatro justo antes de usarla y distribuya la cantidad necesaria para cada condición en tubos Falcon estériles.Para cada condición de tratamiento, transfiera cinco mililitros del medio de cultivo celular de cada placa de cultivo de 10 centímetros al tubo que contiene cuatro tiopurinas y mezcle bien. Aspire completamente el medio restante de los cultivos. Luego, agregue nuevamente el medio etiquetado a las células e incube durante el tiempo definido experimentalmente. Después de retirar el medio de cultivo celular, añada cinco mililitros de triol a cada placa.Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente para lograr la lisis celular completa. Enjuagar cuidadosamente la placa con el triol añadido y transferir las muestras a tubos de polipropileno, los cuales pueden soportar la centrifugación a 13.000 G. Las muestras pueden entonces almacenarse a menos 20 grados Celsius o usarse inmediatamente para preparar el ARN celular total siguiendo el protocolo de triol. Comenzar con muestras de 60 a 80 microgramos de ARN celular total. Para la reacción de marcado, añadir un microlitro de tampón de biotina 10 x a un microgramo de ARN diluido en siete microlitros de agua libre de nucleasas.Luego, agregue dos microlitros de biotina HPDP al uno miligramo por mililitro, DMF por un microgramo de ARN y mezcle inmediatamente mediante pipeteo. Si la biotina precipita, se puede aumentar el contenido de DMF. Incube la reacción a temperatura ambiente durante 1,5 horas con rotación, manteniendo la concentración final de 40 %.A continuación, agregue un volumen igual de cloroformo, mezcle vigorosamente e incube durante dos o tres minutos hasta que las fases comiencen a separarse y las burbujas empiecen a desaparecer. Centrifugue las muestras y luego transfiera cuidadosamente la fase acuosa superior a un tubo nuevo. Después de una segunda extracción con cloroformo, agregue una décima parte del volumen de cloruro de sodio cinco molar y un volumen igual de isopropanol.Para precipitar el ARN de la fase acuosa, se debe centrifugar el ARN para formar un botón. Deseche el sobrenadante y lave el botón una vez con un volumen igual de etanol al 75 %; tras la centrifugación, deseche el sobrenadante. Gire brevemente y elimine el etanol residual con una pipeta de 200 microlitros.Centrifugar nuevamente y eliminar el etanol residual con una pipeta de 20 microlitros. Suspender nuevamente el ARN en 50 a 100 microlitros de agua, mezclando bien mediante pipeteo. Evaluar la calidad del ARN mediante electroforesis para descartar degradación del ARN.Equilibrar tres mililitros de tampón de lavado por muestra a 65 grados Celsius en un baño de agua. Asimismo, desnaturalizar las muestras de ARN biotiniladas a 65 grados Celsius durante 10 minutos. Luego, colocar inmediatamente en hielo.Coloque las columnas microm máx en el soporte magnético. Equilibre previamente las columnas Milton e con un mililitro de tampón de lavado a temperatura ambiente. Mientras tanto, agregue 100 microlitros de perlas de estreptavidina al ARN biotinilado e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos con rotación.Si alguna de las columnas no ha comenzado a drenar, presione suavemente la parte superior de la columna con un dedo enguantado. Una vez que comience el flujo, las columnas drenan fácilmente. Aplique las mezclas de perlas de ARN a las columnas. Si se va a analizar el ARN no marcado, entonces recoja el flujo atravesado de la fracción de ARN no marcado, luego lave tres veces con 0,9 mililitros de tampón de lavado a 65 grados Celsius, seguido de tres lavados con 0,9 mililitros de tampón de lavado a temperatura ambiente.A continuación, pipetee 700 microlitros de tampón RLT en nuevos tubos de dos mililitros y colóquelos debajo de las columnas. Añada 100 microlitros de DTT recién preparado, 100 milimolar, a las columnas para eluir el ARN recién transcrito al tampón RLT. Después de tres minutos, añada otros 100 microlitros de DTT 100 milimolar a la columna y recoja el EENT en el mismo tubo.Continúe con el protocolo de limpieza RN easy mini loot según se describe en las instrucciones del fabricante; agregue 25 microlitros de agua libre de nucleasas a la columna y coloque las columnas en tubos dentro de una centrífuga. Después de un minuto de centrifugación, retire las columnas de los tubos y determine las concentraciones de ARN utilizando un espectrofotómetro nano drop. Tenga en cuenta que las mediciones espectrofotométricas de ARN recién transcrito no son muy confiables y tienden a sobrestimar el contenido real de ARN.Para evitar la necesidad de descongelar y volver a congelar el ARN antes de someterlo a un ensayo de alto rendimiento, recomendamos preparar ADNc inmediatamente después de que se purifique el ARN recién transcrito. Utilice 2,5 µL de la plantilla de ARN recién transcrito en una reacción de síntesis de ADNc de 20 µL siguiendo las instrucciones del fabricante. Diluya las muestras de ADNc de uno a diez y analice cinco µL de la dilución de ADNc mediante qRT-PCR.Almacene las muestras de ARN CD a menos 80 grados Celsius para determinar la concentración mínima de cuatro SU necesaria para la recuperación eficiente del ARN recién transcrito. Purifique el ARN recién transcrito tras la marcación con cuatro SU a concentraciones crecientes de cuatro SU y analice mediante electroforesis. Aquí, la recuperación del ARN recién transcrito marcado durante una hora en fibroblastos humanos primarios aumentó sustancialmente desde 50 hasta 200 micromoles de cuatro SU, pero luego comenzó a estabilizarse. Alternativamente, mida la incorporación de cuatro SU mediante análisis de dot blot en el ARN biotinilado utilizando un conjugado de estreptavidina peroxidasa de rábano picante.La eficiencia de biotinilación del biotin-HPDP es aproximadamente tres veces menor que la del biotin-acetil-OTU. Así, uno de cada tres o cuatro residuos de su en transcripción reciente.El ARN se biotinila mediante biotina HPDP. Las intensidades de señal también pueden cuantificarse mediante comparación con el control biotinilado. La recuperación de ARN recién transcrito mediante oligos de ADN es altamente cuantitativa.Estos datos derivados del Bioanalyzer de Agilent muestran que el ARN recién transcrito contiene cantidades significativamente mayores de transcritos grandes no plegados. Finalmente, las tasas de incorporación de cuatro su en el ARN recién transcrito incluso pueden cuantificarse directamente mediante análisis espectrofotométrico. Esto requiere precipitar el ARN recién transcrito con glicógeno, isopropanol y etanol.El pico adicional a 330 nanómetros refleja la tasa de incorporación de cuatro SU en el ARN recién transcrito. No olvide que trabajar con tril puede ser extremadamente peligroso. Por lo tanto, debe estar fácilmente disponible un antídoto para los huesos de fenol que consiste en polietilenglicol 300 mezclado con alcohol metílico industrial, en una proporción de 70 a 30.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar metabólicamente y purificar el ARN recién transcrito, lo que en total le llevará aproximadamente ocho horas para seis a doce muestras.

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Biología

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Marcaje metabólico del ARN recién transcrito para alta resolución Gene perfiles de expresión de la síntesis de RNA, producción y descomposición en cultivo celular (Video) | JoVE Journal

Marcaje metabólico del ARN recién transcrito para alta resolución Gene perfiles de expresión de la síntesis de RNA, producción y descomposición en cultivo celular

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