Name: Time-lapse de imágenes de Primaria preneoplásicas células epiteliales mamarias derivadas de los modelos de ratones genéticamente modificados del cáncer de mama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Aprenda a utilizar la imagen de lapso de tiempo para analizar células epiteliales mamarias preneoplásicas de ratones modificados genéticamente. Este método permite cuantificar comportamientos celulares y estudiar el desarrollo temprano del cáncer de mama.

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Los autores desean agradecer a Bofan Wu y Raithel cristiana de asistencia técnica y Michael Rieger para su introducción a imágenes de células vivas. Apoyado por el NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Ref. 316 (REN) del Departamento de Defensa W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU (World Class University) programa a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (R31-10069) (PAF ), NIH RR025828 GI20-01 (barrera contra roedores equipos de la instalación) y NIH NCI 5P30CA051008 (Microscopía e Imagen y Recursos Compartidos Animal).

<html> 1. Esquema General <ol><li> Generar cultivos primarios de células epiteliales mamarias preneoplásicas de las glándulas mamarias de animales diseñados genéticamente y controlar ratones de tipo salvaje. </li><li> Captura de imágenes en vivo de células cada 15 minutos utilizando la imagen Volocity software de adquisición (versión 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) durante un máximo de 5 días. </li><li> Ver time-lapse imágenes directamente a evaluar el tiempo y el mecanismo de formación de colonias de células epiteliales, la incidencia de la apoptosis, y la eliminación gradual de los cambios morfológicos. </li><li> Convertir Volocity generado. Pilas TIFF. Archivos JPG utilizando Automatización MetaMorph Microscopía y software de análisis de imágenes (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) y cambiar el nombre de los archivos de imágenes digitales (el cambio de nombre 2.1.6, <a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get / Sistema / Administración de archivos / THE Rename.shtml-</a> ) para permitir la compatibilidad con el software de la herramienta de seguimiento de Timm (TTT,tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. html). </li><li> Uso de TTT, generar mapas de destino celular para la determinación de la hora entre las divisiones celulares (tiempos de vida de células) y los patrones de división celular (simétrico frente asimétrica). </li><li> Analizar datos cuantitativos de los pasos 3 y 5 para determinar si existen diferencias estadísticamente significativas entre los diferentes modelos de ratones genéticamente modificados y / o controles de tipo salvaje. </li></ol> 2. Generación de cultivos primarios de células epiteliales mamarias <ol><li> Preparar medios completos para el aislamiento de células epiteliales mamarias individuales después de una variación de las instrucciones del fabricante (EpiCult-B de ratón Medium Kit, StemCell Technologies, Vancouver, BC). Combinar 450 ml Epi-Cult-medio B, 50 ml Epi-Cult suplemento B proliferación, 5% suero bovino fetal (FBS), 50 mg / ml de Penicilina / Estreptomicina (PenStrep) y 10 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF). </li><li> Preparar Disociación de prensa mediante la combinación de 1 parte de un 10x colagenasa / hialuronidasa mezcla con 9 partes de medio completo de 2,1. </li><li> Eutanasiar ratón e inmediatamente proceder a la necropsia. Coloque el ratón sobre su espalda en una plataforma necropsia espuma de poliestireno y asegurar las cuatro extremidades para que la piel ventral es tensa. Saturar la piel ventral y el cabello, incluyendo el que cubre las extremidades, con un 70% de etanol. Exponer # 2/3 (torácica) y n º 4/5 (inguinal) glándulas mamarias haciendo una incisión en la línea media a través de la piel (no entre el peritoneo) que se extiende en un Y-incisión en la piel medial de cada extremidad delantera y un revés incisión en Y a través de la piel medial de cada extremidad trasera. </li><li> Con disección roma separa la piel del underlyingperitoneum, tire hacia atrás en ambos lados de la piel hasta que esté tensa, y fijarlo a la plataforma de la necropsia de espuma de poliestireno con alfileres. Comenzando por el lado exterior, utilice una disección roma con un uso juicioso de Dissection tijeras para aislar el inguinal intacta y / o torácicos glándulas mamarias de tejido conjuntivo subyacente y el músculo. Coloque no más de dos glándulas mamarias en un plato de 10 cm estéril de Petri y se mueven a la campana de cultivo de tejido. </li><li> En la campana de cultivo de tejidos, glándulas para examinar los ganglios linfáticos mamarios que se identifican como pequeños, bien circunscritos nódulos con un color amarillento. Extirpar los ganglios linfáticos de la glándula que rodea utilizando bisturí estéril y pinzas. Picar el tejido mamario en ~ 1 mm 3 cubos con dos escalpelos estériles, una en cada mano. </li><li> Place picado tejido mamario en 5 ml de medio de disociación, mezclar suavemente pipeteando arriba y abajo 2-3 veces usando una pipeta de 10 ml, y se incuba durante la noche (hasta ~ 16 horas) en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2 en un tubo cónico de 50 ml con tapón aflojado. </li><li> A la mañana siguiente, preparar una mezcla fría de solución salina equilibrada de 1 parte de Hanks (HBSS) que contenía FBS al 2% y 4 partes de solución de cloruro amónico tamponada para promover rojo bllisis celular ood (HFAmCl), así como HBSS frío complementado con FBS al 2% (HF). Pre-caliente Tripsina-EDTA (0,25%), 5 mg / ml Dispasa en solución salina equilibrada de Hank modificada, 1 mg / ml de DNasa I, y medios completos. </li><li> Quitar el tubo de centrífuga cónico con el tejido mamario de la incubadora y suavemente pulso vórtice 2-3 seg dos veces. Centrifugar el tubo a 450 × g durante 5 min (temperatura ambiente o 4 º C), y descartar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el precipitado en un mínimo de 10 HFAmCl ml y centrifugar a 450 xg durante 5 min (temperatura ambiente o 4 º C) y eliminar el sobrenadante. </li><li> Añadir 3 ml de tripsina-EDTA al sedimento y mezclar primero con una pipeta de 5 ml y luego con una micropipeta P1000 hasta fibrosa (min 1-3). Añadir 10 ml de HF, centrifugar a 450 xg durante 5 min (temperatura ambiente o 4 º C) y eliminar el sobrenadante. </li><li> Añadir 2 ml de 5 mg / ml Dispasa y 200 l de 1 mg / ml de DNasa I de la pastilla y la mezcla con una micropipeta P1000 durante 1 min. La muestra debe ser cloudy pero no fibrosa. Si fibrosa, añadir 100 ml de DNasa I y mezclar de nuevo. </li><li> Añadir 10 ml de HF frío, la tensión a través de un filtro de células 40 micras y se centrifuga a 450 xg durante 5 min (temperatura ambiente o 4 º C) y eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento final en medio completo. Cuantificar el número total de células (usando un hemocitómetro o contador Coulter). Dos glándulas mamarias producen aproximadamente 1 x 10 6 a 1 x 10 7 células. Primario de placa de las células epiteliales en un fondo plano 6-así placa a una densidad de 1,5 x 10 5 células por pocillo. </li></ol> 3. Vivo de células de imágenes <ol><li> Inmediatamente después de sembrar las células, se coloca la placa 6-así de forma segura en una platina de microscopio en un 5% de CO 2 / saturado humidity/37 ° C de temperatura de la cámara de incubación. Ajuste el condensador para iluminación Kohler y el centro de los anillos de fase. Para los experimentos presentados aquí, un invertido Nikon Eclipse TE300/PerkinElmer Spinning Disc Confocalsistema de microscopio en el modo de campo amplio de contraste de fase con una lente de objetivo de 10x se utilizó. </li><li> Abra el software de adquisición de imágenes, crear y nombrar una biblioteca para las imágenes con lapso de tiempo, y guardar en un lugar con suficiente espacio para archivos grandes. Los experimentos que aquí se presenta la imagen utilizada Volocity adquisición de software (versión 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA). </li><li> Permitir que la placa se equilibre en el microscopio incubadora durante un mínimo de 15 min. Baje las lentes para evitar etapa de lente interferencia. En el marco del &quot;Stage&quot;, seleccione &quot;Calibrar escenario&quot;. Readquirir el plano focal conjunto, Z = cero en los puntos x, y, z pestaña y marca de imagen seleccionando &quot;Añadir punto&quot; en el &quot;Stage&quot; la partida. Coloque puntos en el medio de cada pocillo de la placa de 6 pocillos para la formación de imágenes como formación de imágenes de contraste de fase puede estar distorsionada cerca de la periferia de pocillos de plástico. Organizar puntos en un cuadrado en 4 x 4 campos (650 x 700 micras campos micras), cada uno con una pequeña parte (alrededor del 5%). Guardar los puntos seleccionados en &quot;Stage &quot;. </li><li> En &quot;Stage&quot;, seleccione &quot;Crear mapa foco&quot; y siga las instrucciones para ajustar el enfoque de cada punto. Establezca el tiempo de adquisición de imágenes para capturar 4 imágenes por hora (cada 15 minutos). Esto se puede ajustar dependiendo de los requisitos del experimento específico. Guarde el mapa foco en &quot;Stage&quot;. </li><li> Haga clic en la herramienta del lado derecho &quot;Adquisición de imágenes de&quot; bar y guardar los ajustes de imagen. Pulse el botón de grabación para comenzar la creación de imágenes. Después de 1 hora, comprobar el enfoque de las imágenes para ver si es necesario realizar ajustes. </li><li> Monitorear y continuar imágenes en vivo durante 5 días, y termina cuando las células se vuelven confluentes. </li></ol> 4. Visualización directa de imágenes de lapso de tiempo para evaluar la oportunidad y Mecanismo de Formación Inicial epitelial colonia de células, la incidencia de la apoptosis y la eliminación gradual de los cambios morfológicos <ol><li> Visualización directa de imágenes con lapso de tiempo se puede realizar utilizando cualquier software de visualización de vídeo compatible (por ejemplo, <a href="http://www.real.com/" target="_blank">http:</a>/ / Www.real.com/ realplayer u otro software freeware o disponible comercialmente). Las imágenes pueden verse en. Formato TIFF en este paso o después de la conversión a archivos JPG. (Ver paso 5). </li><li> Para determinar mecanismo de formación de colonias inicial, comenzar con una pila de una sola imagen que representa un sitio de formación de imágenes en la placa. En las tramas iniciales, las células será flotante. Siga imágenes seriadas para determinar cuando la célula epitelial primero se adhiere a la placa. En este paso, las células epiteliales pueden ser identificadas y diferenciadas de fibroblastos por su morfología más cuboidal. Siga esta célula epitelial solo a través de imágenes en serie y seguir su destino a través de las siguientes 24 horas. Registrar si se convierte rodeada por otras células epiteliales o se somete a la división celular o la apoptosis. Si rodeada por las células epiteliales, el mecanismo de formación de colonias se puede determinar directamente mediante la visualización de si las células circundantes se derivan de células flotantes que luego se agregan con la célula inicial adherente (s) ode división de la célula adherente inicial. Registrar el número de colonias formadas por agregación de células frente a la división celular durante la primera 24 hr. </li><li> Para determinar el número de células adherentes que inicialmente se someten a apoptosis durante un período de tiempo específico, siga imágenes en serie para la aparición de características clásicas de la apoptosis en desarrollo en una célula que ha sido adherente ( <a href="http://www.alsa.org/research/about-als-research/cell-death-and-apoptosis.html" target="_blank">http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html</a> ), y el número de células apoptóticas detectadas durante toda la duración de la formación de imágenes o dentro de marcos de tiempo específicos registrados. </li><li> Con el tiempo, las células epiteliales en cultivo alterar su morfología a partir de una forma cuboide inicial a un aspecto más alargado consistente con EMT. Siga imágenes seriadas para determinar el día / hora después de la siembra, cuando esto ocurre. </li></ol> 5. Modificación del archivo de imagen <ol><li&gt; A través del software Volocity, exportar los archivos de imagen TIFF a pilas. Aquí Automation Microscopía MetaMorph y software de análisis de imágenes (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) fue usado para abrir los archivos TIFF de pila y que se guardaron luego en MetaMorph como imágenes JPG individuales.. </li><li> Cambiar el nombre de las carpetas de imágenes y archivos de acuerdo con los requisitos de software Timm herramienta de seguimiento Utilice un programa gratuito como THE Rename 2.1.6 ( <a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml</a> ) para cambiar el nombre de archivos en grupos. Crear una carpeta que contiene todas las carpetas y archivos de la experiencia y el nombre de la carpeta (por ejemplo, </em&gt; EXPERIMENTNAME). </li><li> Cree una subcarpeta para cada punto / posición en la que se tomaron imágenes de la cultura. Nombra las subcarpetas: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. El número de posición debe tener 3 dígitos. Ejemplo: 072511RN_p001. Poner todos los archivos de imagen de esa posición individual en la subcarpeta. </li><li> Añadir el punto de tiempo (utilizando 5 dígitos) y el número de canal (ya que sólo hay un canal de campo brillante, utilice &quot;0&quot;) al final de cada nombre de archivo en este formato: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg </li><li> Generar un archivo de registro para cada puesto, en primer lugar descargar el programa TTTlogfileconverter gratuitamente del sitio de TTT. Inicie el programa TTTlogfileconverter y seleccione la carpeta experimento. Entrada de un intervalo de imagen (en segundos). Para obtener una imagen tomada cada 15 minutos, entre 900 seg. A continuación, pulse el botón verde de registro encubierto archivos. </li></ol> 6. Generación de mapas destino celular de las células individuales mediante TTT <ol><li> Crear una carpeta llamada TTTexport y una subcarpeta llamada TTTfiles donde todos los datos de seguimiento de móviles serán almacenados siguiendo las instrucciones del software TTT </li><li> Inicie el programa TTT, seleccione las iniciales del usuario y haga clic en &quot;Continuar&quot;. </li><li> Pulse el botón &quot;Set NAS&quot;, seleccionar el usuario creado &quot;TTTexport&quot; carpeta y haga clic en Aceptar. En el navegador, seleccione una carpeta experimento, seleccione una carpeta de posición y pulse &quot;Load posición&quot; botón. </li><li> Establecer factor de ocular a &quot;10x&quot;. Cargar el número de imágenes requeridas (carga de todas las imágenes se recomienda por primera vez). </li><li> En la ventana de la celda editor, seleccione &quot;colonia Nuevo&quot; en el menú Archivo. En la ventana de Película, pulse la &quot;célula Track&quot; o F2 para comenzar a rastrear un celular. </li><li> Identificar una célula en la Movie ventana y el uso del ratón para colocar el cursor sobre la celda. Un círculo con el número de la celda debe aparecer después de F2 se ha hecho clic. Use la tecla &quot;0&quot; en el teclado numérico del teclado para rastrear la ubicación de la celda y pasar a la siguiente foto. Mover el cursor para seguir la colocación de cada celda a través de cada cuadro. Para eliminar una pista y volver a la imagen anterior pulse &quot;Supr&quot; en el teclado numérico. Para mover fotogramas a término sin el seguimiento de la prensa célula &quot;3&quot;, y para mover hacia atrás sin el seguimiento presione &quot;1&quot; en el teclado numérico. </li><li> Para marcar una división celular clic en la &quot;división&quot; en la ventana Movie. Con motivo de la muerte celular clic en la &quot;muerte celular&quot; en la ventana Movie. Una vez que se ha producido una división, las células hijas pueden ser rastreados en el mapa de celdas misma suerte al hacer clic derecho sobre el símbolo del círculo de la célula hija designado en la ventana del editor de la célula para iniciar el modo de seguimiento de forma automática. </li><li> Pulse F10 para guardar el árbol. Cada árbol se guardará en la tapa de salida designadoer (TTTExport). Para iniciar un mapa del destino celular nuevo, seleccione &quot;colonia Nuevo&quot; del menú &quot;Archivo&quot; y luego &quot;Abrir&quot; del menú en la ventana del editor Cell. </li><li> Tabular los datos de la celda de por vida después de la recolección de &quot;Celda de datos&quot; pestaña en la ventana de editor Cell. </li></ol> 7. Los análisis estadísticos <ol><li> Utilizar cualquiera de Student t-test (si se comparan dos genotipos) o ANOVA (si se compara&gt; dos genotipos) para determinar si las diferencias en los datos paramétricos, tales como el número de colonias de células iniciales, tiempos de vida celulares o horas hasta la aparición de EMT entre genotipos diferentes son estadísticamente significativo. Frecuencia de apoptosis puede ser comparado como el número / número total de células chapados utilizando la t de Student o prueba de ANOVA o con Mann-Whitney o Kruskal-Wallis cuando se derivan como un porcentaje de células adherentes. </li><li> Realizar pruebas de potencia utilizando datos de los análisis de experimentos iniciales para determinar cuántas repeticiones experimental necesario para realizar mapas y destino celular generada a partir de cada réplica para s adecuadapoder tatistical usando software libre disponible (por ejemplo <a href="http://statpages.org/" target="_blank">http://statpages.org/</a> ). En los experimentos presentados aquí, cultivos celulares derivados de tres ratones por genotipo fueron suficientes para determinar si había diferencias estadísticamente significativas en la formación de células colonia y tiempos de vida de células específicas cuando se hicieron modificaciones genéticas. </li></ol>

<ol><li>Jones, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+estrogen+signaling+pathways+collaborates+with+loss+of+Brca1+to+promote+development+of+ERalpha-negative+and+ERalpha-positive+mammary+preneoplasia+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer.</a> Oncogene. 27, 794-802 (2008).</li>
<li>Burga, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+proliferation+and+differentiation+properties+of+primary+mammary+epithelial+cells+from+BRCA1+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers.</a> Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).</li>
<li>Li, M., Wagner, K., Furth, P. A. Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+M+%22Methods+in+Mammary+Gland+Biology+and+Breast+Cancer%22">Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer</a>. Ip, M., Asch, B. , Kluwer Academic, Plenum Press. (2000).</li>
<li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+stem-cell-driven+regeneration+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals.</a> Nature. 453, 345-351 (2008).</li>
<li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+single-cell+imaging+of+mammalian+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells.</a> Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).</li>
<li>Eilken, H. M., Nishikawa, S. -I., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+single-cell+imaging+of+blood+generation+from+haemogenic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium.</a> Nature. 457, 896-900 (2009).</li>
<li>Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+tracking+hematopoiesis+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+hematology%22%5BJournal%5D)">Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level.</a> Current opinion in hematology. , (2012).</li>
<li>Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+cytokines+can+instruct+lineage+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice.</a> Science. 325, 217-218 (2009).</li>
<li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instruction+of+lineage+choice+by+hematopoietic+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines.</a> Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).</li>
<li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

Los pasos críticos Es importante asegurarse de que las glándulas mamarias se cosechan a partir de ratones de la misma edad de controlar por edad relacionados con la variabilidad en el comportamiento de células epiteliales mamarias. Cuando en placas las células, el mismo número de células se deben sembraron en cada pocillo para cada experimento. Las células deben ser relativamente escasa cuando enchapado, de modo que las culturas no se hacen confluentes demasiado rápido por lo que es posible seg...

Genéticamente modificados modelos de ratón son herramientas para estudiar y entender cómo diferentes lesiones genéticas que contribuyen al riesgo de desarrollar cáncer de mama. Por ejemplo, los ratones transgénicos han demostrado que la combinación de tres factores: la pérdida de la mama de longitud completa cáncer 1, inicio temprano (BRCA1) de genes en células epiteliales mamarias, la proteína p53 tumor (TP53) de la línea germinal haploinsuficiencia, y epiteliales mamarias célula diana hasta reguladas estrógeno receptor alfa (EEI) los resultados de expresión en el desarrollo del cáncer de mama en el 100% de los genes BRCA1 floxed (f) Virus 11/f11/Mouse tumor mamario (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( tet-op) -ER/MMTV-reverse tetraciclina transactivador (rtTA ratones a los 12 meses de edad en comparación con los porcentajes más bajos reportados en Brca1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / - ratones sin ERa sobre-expresión (~ 50 - 60%) y BRCA1 ratones f11/f11/MMTV-Cre sin Tp53 haploinsufdeficiencia (&lt;5%). 1 Dinámica de lapso de tiempo de imagen del comportamiento de preneoplásicas células epiteliales primarias mamarias revela diferencias en el comportamiento de las células que son menos fácilmente apreciadas en secciones de tejido estáticas. Las alteraciones en la proliferación y la diferenciación se observan en células primarias mamarias de humanos portadores de mutaciones BRCA1. 2 Creación de una sola célula suspensiones de células primarias epiteliales mamarias normales y de ratones transgénicos se generan a través de la disociación enzimática de tejido extirpado la glándula mamaria. 3 Time-lapse imágenes se ven a evaluar mecanismo y el momento de aparición de células colonia y la incidencia de los cambios morfológicos en las células, incluyendo epitelio-mesenquimal transición (EMT) y la apoptosis. Generación de mapas de destino celular, la cuantificación de la longitud de tiempo entre las divisiones celulares (tiempos de vida de células), y la determinación de los patrones de división celular se facilita por el uso de una sola célula de seguimiento. TimmHerramienta de Seguimiento &#39;s (TTT) es un software a disposición del público para generar una sola célula de mapas de destino. Su utilidad en la elucidación de mecanismos de destino de la célula se ha establecido 4,5 examinar el desarrollo normal de células madre hematopoyéticas 6-9 y la generación de neuronas. 10

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> EpiCult-B de ratón Basal Medium </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 05610 </td><td></td></tr><tr><td> EpiCult-B Suplementos proliferación del ratón </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 05612 </td><td></td></tr><tr><td> recombinante Factor de crecimiento epidérmico humano (EGFhr) </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 02633 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenasa / hialuronidasa </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 07912 </td><td></td></tr><tr><td> Scapels desechables </td><td> Pluma </td><td> 2975 # 10 </td><td></td></tr><tr><td> Solución salina equilibrada de Hanks </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 37150 </td><td></td></tr><tr><td> Lammonium Chloride </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 07800 </td><td></td></tr><tr><td> Tryspin-EDTA </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 07901 </td><td></td></tr><tr><td> Dispasa </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 07913 </td><td></td></tr><tr><td> DNasa I </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 07900 </td><td></td></tr><tr><td> 40 filtro de células micras </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 27305 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 06100 </td><td></td></tr><tr><td> Penstrep </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse de imágenes de primaria preneoplásicas células epiteliales mamarias derivadas de los modelos de ratones genéticamente modificados del cáncer de mama

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Imagen de lapso de tiempo se puede usar para comparar el comportamiento de cultivos primarios de células epiteliales mamarias preneoplásicas derivados de los diferentes modelos de ratón genéticamente modificadas de cáncer de mama. Por ejemplo, el tiempo entre las divisiones celulares (móviles vidas), números de células apoptóticas, la evolución de los cambios morfológicos, y el mecanismo de formación de colonias pueden ser cuantificados y comparados en las células que transportan determinadas lesiones genéticas. Cultivos primarios de células epiteliales mamarias se generan a partir de glándulas mamarias sin tumor palpable. Glándulas son cuidadosamente resecado con clara separación de músculo adyacente, se extraen ganglios linfáticos, y solo suspensiones de células enriquecidas de células epiteliales mamarias se generan por el tejido mamario de picar carne seguido por disociación enzimática y filtración. Solo suspensiones de células se colocan en placas y se coloca directamente bajo un microscopio en una cámara incubadora para vivo de células de imágenes. Dieciséis 650 micras x 700 micras campos en una configuración 4x4 de cada well de una placa de 6-así se crean imágenes cada 15 minutos durante 5 días. Lapso de tiempo imágenes son examinados directamente para medir los comportamientos celulares que pueden incluir mecanismo y frecuencia de formación de colonia de células dentro de las primeras 24 horas de placas las células (agregación frente a la proliferación celular), la incidencia de la apoptosis, y la eliminación gradual de los cambios morfológicos. Una sola célula de seguimiento se utiliza para generar mapas de destino celular para la medición de tiempos de vida de células individuales y la investigación de los patrones de división celular. Los datos cuantitativos se analizaron estadísticamente para evaluar las diferencias significativas en el comportamiento correlacionado con determinadas lesiones genéticas.

Las células epiteliales y fibroblastos se pueden distinguir por la morfología celular. Las células epiteliales tienen una forma cuboide (Figura 1A-B) y forman colonias de células (Figura 1A). Los fibroblastos, un tipo de células del estroma, tienen una morfología alargada (Figura 1C). Las células se redondean y flotando en el inicio de la formación de imágenes (Figura 2A-D). Después de la unión a la placa plana y se volviero...

Imagen de lapso de tiempo se utiliza para evaluar el comportamiento de las células mamarias preneoplásicas primarias epiteliales derivadas de los modelos de ratón genéticamente modificadas de riesgo de cáncer de mama para determinar si existen correlaciones entre los parámetros de comportamiento específicas y distintas lesiones genéticas.

Time-lapse de imágenes de Primaria preneoplásicas células epiteliales mamarias derivadas de los modelos de ratones genéticamente modificados del cáncer de mama

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

El objetivo general del siguiente experimento es determinar si las lesiones genéticas que predisponen al cáncer de mama alteran el comportamiento de las células de memoria plástica pineal en cultivo primario. Esto se logra aislando células epiteliales mamarias primarias de ratones modificados genéticamente. Como segundo paso, se realizan imágenes de lapso de tiempo de células vivas durante cinco a siete días, creando una película para analizar el comportamiento de las células.A continuación, se utiliza un programa de software que rastrea células individuales para cuantificar y comparar el comportamiento de las células aisladas de diferentes modelos de ratón modificados genéticamente para el cáncer de mama. Los resultados muestran que lesiones genéticas específicas inducen diferentes comportamientos en la memoria preneoplásica. Células epiteliales basadas en análisis cuantitativos del comportamiento realizados mediante el seguimiento de células individuales.Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre cómo las diferentes lesiones genéticas alteran el comportamiento de las células epiteliales mamarias preneoplásicas. También se puede aplicar a otros sistemas como preneoplásicos, células de otros órganos, células cancerosas de cualquier órgano, incluyendo el estudio de posibles cambios de comportamiento inducidos por la terapia, así como comparaciones del comportamiento de las células estromales de tejido normal y canceroso que demuestren el procedimiento. Hoy estarán la Dra. Priscilla Firth, autora principal de esta publicación, y Pete Johnson, gerente del Centro de Recursos Compartidos de Microscopía e Imágenes en el Centro de Investigación del Cáncer Lombardi de la Universidad de Georgetown.Sacrificar a un ratón y proceder inmediatamente a la necropsia. Coloque al ratón en decúbito supino sobre una plataforma de necropsia de espuma de poliestireno y asegure las cuatro extremidades para que la piel ventral esté tensa. Saturar la piel ventral y el cabello, incluida la piel de las extremidades, con etanol al 70%.Exponga las glándulas mamarias número dos y tres y número cuatro y cinco con una incisión en la línea media a través de la piel. Extienda la incisión con dos incisiones en Y a través de la piel medial de las cuatro extremidades. Tenga cuidado de no entrar en el peritoneo utilizando una disección roma.Separe la piel del peritoneo subyacente. Tire hacia atrás de ambos lados de la piel hasta que esté tensa y sujétela a la plataforma comenzando por el lado exterior. Use las tijeras para hacer una disección roma que aísle las glándulas mamarias inales o torácicas intactas del tejido conectivo y el músculo subyacentes.Coloque una o dos glándulas mamarias en una placa de Petri de 10 centímetros y muévalas a una campana de cultivo de tejidos. Ahora, examine las glándulas en busca de ganglios linfáticos mamarios. Nódulos pequeños y bien circunscritos de color amarillento.Con un bisturí y fórceps, retírelos de la glándula circundante. Pica el tejido mamario en cubos del tamaño de un milímetro con dos bisturíes. Colocar el tejido mamario picado en un tubo cónico de 50 mililitros con cinco mililitros de medio de disociación.Mézclalo con tación suave e incuba durante la noche. Mantenga la gorra suelta al día siguiente. Aislar y cultivar las células epiteliales primarias.Inmediatamente después de colocar las células. Coloque la placa de seis pocillos de forma segura en una platina de microscopio dentro de una cámara de incubación. Deje que el plato se equilibre durante un mínimo de 15 minutos.Ajuste el condensador para la iluminación Kohler y centre los anillos de fase. Abra el software de adquisición de imágenes, como velocity, y cree y asigne un nombre a una biblioteca para las imágenes de lapso de tiempo y guárdelas en una ubicación con suficiente espacio para archivos grandes. Baje las lentes para evitar interferencias con la lente de la plataforma.En el encabezado de la etapa, seleccione calibrar la etapa y vuelva a adquirir el conjunto de plano focal Z igual a cero en la pestaña X, Y, Z. Y marque los puntos de imagen seleccionando Agregar punto debajo de la plataforma. Coloque los puntos de imagen en el centro de cada pozo.Las imágenes de contraste de fase pueden estar distorsionadas cerca de la periferia de los pocillos de plástico. Organice los puntos en un cuadrado en campos de cuatro por cuatro, cada uno con una superposición de aproximadamente el 5%. Guarde los puntos seleccionados en la etapa.En la etapa, seleccione crear mapa de enfoque y siga las indicaciones para establecer el enfoque de cada punto. A continuación, configure el tiempo de adquisición de imágenes para que capture el número correcto de imágenes por hora. Ahora guarde el mapa de enfoque en el escenario.Proceda haciendo clic con el botón derecho en la adquisición de imágenes en la barra de herramientas del lado derecho. A continuación, guarde la configuración de imágenes. Presione el botón de grabación para comenzar el proceso de imagen después de una hora, verifique el enfoque de las imágenes para ver si es necesario algún ajuste.Monitoree y continúe con las imágenes en vivo durante cinco días cuando las células se vuelvan confluentes. Es fundamental monitorear las imágenes digitales adquiridas y ajustar el mapa de enfoque con frecuencia durante las primeras 24 horas porque las celdas se adherirán a la placa a partir de entonces al menos dos veces al día. Compruebe que las células estén enfocadas y que los cultivos no estén contaminados.Para determinar el mecanismo de formación inicial de la colonia, comience con una sola pila de imágenes que represente un sitio de imagen en la placa. En los fotogramas iniciales, las células serán flotantes, las células epiteliales y fibroblásticas se pueden distinguir por la morfología celular. Las células epiteliales tienen forma cúbica y forman colonias celulares.Los fibroblastos, un tipo de célula estromal, tienen una morfología alargada. Siga las imágenes en serie para determinar cuándo se adhiere la primera célula epitelial a la placa. En este paso, las células epiteliales se pueden identificar y diferenciar de los fibroblastos por su morfología más cuboidal.Siga a esta célula epitelial única a través de imágenes en serie y siga su destino durante las 24 horas siguientes. Tenga en cuenta que si la célula se rodea de células epiteliales adicionales, se somete a división celular o sufre apoptosis Si está rodeada de células epiteliales, el mecanismo de formación de colonias se puede determinar a partir de la agregación de células circundantes o de la división celular. Registre el número de colonias formadas por agregación celular frente a la división celular durante las primeras 24 horas para determinar el número de células inicialmente adheridas que se someten a apoptosis durante un período de tiempo específico.Siga las imágenes seriadas para la aparición de características clásicas de apoptosis que se desarrollan en una célula que ha sido adherente a lo largo del tiempo. Las células epiteliales en cultivo alteran su morfología desde una forma cuboidal inicial hasta una apariencia más alargada. De acuerdo con EMT.Siga las imágenes en serie para determinar el día y la hora después del enchapado Cuando esto ocurra, comience iniciando el programa TTT. Seleccione las iniciales del usuario y haga clic en continuar. Presione establecer NAS, seleccione la carpeta de exportación TTT creada por el usuario y haga clic en Aceptar.En el navegador, seleccione una carpeta de experimentos. Seleccione una carpeta de posición y, a continuación, presione el botón de posición de carga. Envía el factor ocular a 10 veces.Cargue el número de imágenes necesarias, que suele ser todas las imágenes. Al utilizar este análisis. Por primera vez en la ventana del editor de celdas, seleccione nueva colonia en el menú de archivos de la ventana de la película.Presione el botón de celda de pista o presione F dos. Para comenzar a rastrear una celda. Identifique una celda en la ventana de la película y coloque el cursor sobre la celda.Debe aparecer un círculo con el número de la celda después de hacer clic en F dos. Use la tecla cero en el teclado numérico para rastrear la ubicación de la celda y avanzar a la siguiente imagen. Mueva el cursor para seguir la ubicación de cada celda a través de cada fotograma.Para eliminar una pista y volver a la imagen anterior, presione eliminar en el teclado numérico para avanzar fotogramas sin rastrear la celda, presione tres. Y para retroceder sin seguimiento, presione uno. Para marcar una división de celda en la ventana de la película, haga clic en el botón de división para marcar la muerte de la celda en la ventana de la película, haga clic en la muerte de la celda.Una vez que se ha producido una división, las células hijas se pueden rastrear en el mismo mapa de destino de celdas. Para hacer esto, vaya a la ventana del editor de celdas y haga clic derecho en el símbolo del círculo de la celda de puntos designada. Esto inicia el modo de seguimiento automáticamente, ahora presione F 10 para guardar el árbol.Cada árbol se guardará en la carpeta de salida designada. Para iniciar un nuevo mapa de sulfato en la ventana del editor de celdas, seleccione el menú abierto, haga clic en archivo y haga clic. Las nuevas células de la colonia fueron redondeadas y flotantes al inicio de la toma de imágenes.El tamaño de las barras es igual a 200 micras Después de la fijación a la placa, se volvieron planas y demostraron una apariencia de tipo cuboidal. A los cuatro días de cultivo, la mayoría de las células epiteliales se alargaron en una morfología similar a la EMT. Este cambio se produjo con la misma cronología en todos los genotipos estudiados: las células flotantes se desarrollaron en colonias de células epiteliales individuales definidas.A las 24 horas después de la siembra, el análisis de imágenes en serie reveló que estas colonias se generaron por agregación celular en lugar de división celular. Si bien la interrupción de BRCA, una por sí sola no alteró el número de colonias formadas. La adición de la insuficiencia del haplo TP 53 redujo significativamente el número de colonias formadas.Del mismo modo, la adición de ER alfa sobre la expresión aumentó significativamente el número de colonias formadas siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos que emplean el uso de imágenes de lapso de tiempo combinadas con el seguimiento de una sola célula para responder preguntas adicionales, como cómo los enfoques terapéuticos específicos o las lesiones genéticas adicionales alteran el comportamiento celular y pueden influir en la respuesta terapéutica o la progresión del cáncer.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Fuente:Marina Arantes Radicchi1, Victor Carlos Mello1,Victória Paz Machado1, Márcia Cristina Oliveira da Rocha1, Jaqueline Vaz de Oliveira1, Luana Cristina Camargo1,2, Luís Alexandre Muehlmann1, Ricardo Bentes Azevedo1, Sônia Nair Bao1, João Paulo Figueiró Longo11Instituto de Ciencias Biológicas, Universidad de Brasilia, 2Departamento de Procesos Psicológicos Básicos, Instituto de Psicología, Universidad de BrasiliaEste video demuestra el procedimiento para rastrear la progresión tumoral in...

Imágenes bioluminiscentes de la progresión del tumor de mama en un modelo de ratón hembra

Se describe un método para la formación de imágenes respuesta a tratamiento contra el...

Imágenes en directo de las respuestas de drogas en el microambiente tumoral en modelos de ratón de cáncer de mama

La activación de mutaciones latentes con adenovirus Cre en los resultados del sistema ductal de mama en un cáncer de mama metastásico clínicamente relevante. La incorporación de un promotor YFP permite el seguimiento de las células tumorales metastásicas distales. Este modelo es útil para estudiar la metástasis latentes, la inmunidad anti-tumoral, y para el diseño de nuevas inmunoterapias para tratar el cáncer de mama.

Inicio de la metástasis de carcinoma de mama mediante la Focalización del epitelio ductal con adenovirus Cre: Un modelo de ratón transgénico de Novela del Cáncer de Mama

Cultivo de células primarias de tejido intacto utilizando organoides proporciona un sistema modelo que imita el microambiente multi-celular in vivo. Desarrollamos un modelo de cultivo libre de suero primaria tejido epitelio de mama que perpetúa los linajes de cultivo de células mixtas y exposiciones morfología diferenciados, sin interrupción tejido enzimática. Organoides mamarios permanecen viables durante&gt; 6 meses.

No enzimática, libre de suero Cultivo de Tejidos de lesiones de mama pre-invasivas para la generación espontánea de mammospheres

Un modelo de tumor primario de cáncer de mama ortotópico y la extirpación quirúrgica del tumor primario para extender la vida del ratón para generar metástasis espontánea se describen. El crecimiento del tumor y la progresión se supervisan y se cuantificaron por imágenes de fluorescencia de la luciferasa.

Un modelo de ratón ortotópico de cáncer de mama metástasis espontánea

El objetivo de este protocolo es describir un nuevo enfoque de modelado de cáncer de mama basado en la inyección intraductal de adenovirus Cre-expressing en las glándulas mamarias del ratón. Este enfoque permite la manipulación específica del tipo de célula y del órgano de los eventos oncogénicos de una manera controlada temporalmente.

Modelar el cáncer de mama a través de una inyección intraductal de Adenovirus C-expreso en la Glándula Mamaria del Ratón

Este trabajo preestablece un protocolo avanzado para evaluar con precisión la carga del tumor mediante la detección de señales de proteína fluorescente verde y bioluminiscencia, así como la integración de la técnica de detección molecular cuantitativa.

Estudio del triple cáncer de mama negativo con el modelo de cáncer de mama ortotópico

Este protocolo describe una nueva ventana de imágenes mamarias con una tapa reemplazable (R.MIW). La microscopía intravital después de la implantación del R.MIW permite obtener imágenes longitudinales y de varios días de la glándula mamaria sana y enferma con una resolución celular durante las diferentes etapas del desarrollo.

Microscopía intravital longitudinal con una ventana de imágenes mamarias con tapa reemplazable

El método de imágenes intravitales descrito aquí utiliza la segunda generación armónica de colágeno y la fluorescencia endógena del cofactor metabólico NAD(P)H para segmentar de forma no invasiva un microambiente tumoral no etiquetado en compartimentos tumorales, estromales y vasculares para un análisis en profundidad de imágenes intravitales 4D.

Un enfoque de segmentación sin etiquetas para imágenes intravitales del microambiente tumoral mamario

El presente protocolo describe una técnica sencilla para la obtención de imágenes intravitales de la glándula mamaria de ratón lactante mediante microscopía confocal y multifotónica de barrido láser.

Microscopía subcelular intravital de la glándula mamaria

El manuscrito describe una metodología para el establecimiento y seguimiento longitudinal del crecimiento de las metástasis pulmonares espontáneas de tumores de mama inyectados ortotópicamente, susceptibles de intervención en todas las etapas de la cascada metastásica.

In vivo Diagnóstico por imágenes para medir la metástasis pulmonar espontánea de células tumorales de mama inyectadas ortotópicamente

Aprenda a utilizar la imagen de lapso de tiempo para analizar células epiteliales mamarias preneoplásicas de ratones modificados genéticamente. Este método permite cuantificar comportamientos celulares y estudiar el desarrollo temprano del cáncer de mama.

Time-lapse de imágenes de Primaria preneoplásicas células epiteliales mamarias derivadas de los modelos de ratones genéticamente modificados del cáncer de mama (Video) | JoVE Journal

Time-lapse de imágenes de Primaria preneoplásicas células epiteliales mamarias derivadas de los modelos de ratones genéticamente modificados del cáncer de mama

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