Rapid ensayos colorimétricos para distinguir cualitativamente ARN y ADN en muestras Biomolecular

El objetivo general del siguiente experimento es determinar si una muestra potencialmente heterogénea de biomoléculas contiene ácido nucleico y/o azúcares reductores. Y si es así, distinga entre ARN y ADN en función de la diferente reactividad de sus fracciones de azúcar. Esto se logra aplicando primero el ensayo Benedict para determinar si la mezcla biomolecular contiene azúcares reductores libres.

Como segundo paso se utilizan los archivos, el arsen o ensayo, que establece si algún componente del azúcar contiene o no anillos pento. El reactivo de difenil amina se utiliza para determinar si el azúcar pento es una desoxirribosa como en el ADN o no como en el ARN. Los resultados muestran el tipo de biopolímero basado en productos de color fácilmente distinguibles formados por las reactividades diferenciales de los componentes a base de azúcar en la muestra, que se pueden analizar contra curvas estándar utilizando mediciones espectrofotométricas.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes como la electroforesis con colorantes fluorescentes, pico verde, o cyber gold, es que no hay limitación basada en el tamaño, la carga o el componente del azúcar, y es eficiente en tiempo y costo para el ensayo reductor de azúcares. Prepare un volumen adecuado de seis x reactivo de Benedict compuesto por 940 milimolares anhidros, carbonato de sodio 588 milimolares, citrato de sodio dihidratado y 68 milimolares de cobre. Dos sulfatos penta hidratados.

Para cada muestra que se va a analizar, agregue 100 microlitros del reactivo Benedict de seis x al tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Agregue entre 10 y 500 microlitros de muestra a cada tubo y agregue agua destilada doble para llevar el volumen final a 600 microlitros de vórtice o pipeta. Para mezclar la solución.

Incubar las muestras en un baño de agua hirviendo durante 20 minutos y luego dejar que se enfríen durante 10 minutos antes de la centrifusión a alrededor de 10.000 RPM durante cinco minutos. Para sedimentar cualquier material particulado, transfiera el supinato a un veta limpio después de borrar el UV frente al espectrofotómetro con agua a 475 nanómetros.

Mida la absorbencia de la muestra para determinar los azúcares pento. Prepare un reactivo fresco de dos x BALs con cloruro de hidrógeno de 24,2 milimolares, seis molares y cloruro férrico de 0,025 pesos por volumen hexahidratado de acuerdo con el protocolo de texto. Para cada muestra, agregue 500 microlitros de reactivo de bilis a un tubo de microcentrífuga.

Añadir entre 10 y 500 microlitros de muestra a cada tubo y añadir agua bidestilada para llevar el volumen final a un mililitro. Una mezcla. Hervir las muestras durante 20 minutos, luego enfriarlas a temperatura ambiente durante 10 minutos después de girar la muestra para sedimentar el material particulado, mida la absorbancia a 660 nanómetros usando agua en blanco.

Prepare dos platos de reactivo de difenil amina compuesto por 60 milimolares de difenil amina, siete molares de ácido acético glacial, 179 milimolares de ácido azufrado y 62% de volumen por volumen. Etanol. Para cada reacción, combine 500 microlitros de reactivo, la muestra y el agua destilada doble para llevar el volumen total a un mililitro. Después de hervir las muestras durante 20 minutos, enfriarlas a temperatura ambiente y centrifugarlas, mida la absorbancia a 600 nanómetros.

Aquí se muestran sus datos cualitativos representativos para el arsenal y las placas de Benedicts Biles, ensayos de difenil amina para compuestos de referencia conocidos. Los paneles izquierdos muestran los controles positivos y negativos, y los paneles derechos muestran el rango de detección visible de los ensayos. Este panel ilustra la solidez de los ensayos al mostrar la reacción de la placa con muestras de diversa heterogeneidad.

Por ejemplo, ADN con ARN o ADN con proteína. Tenga en cuenta que los resultados positivos del ensayo de la placa se conservan para muestras que contienen ADN, incluso en presencia de ARN o proteínas contaminantes. Los rangos de dilución en las muestras anteriores varían porque cada reacción tiene un límite de detección visual distinto.

Dependiendo del tipo de azúcar que se esté ensayando, se pueden utilizar espectros fotométricos en lugar de la detección visual para mejorar los rangos de medición, como se muestra en esta curva estándar. Para el ensayo de Benedict, una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de 30 minutos si se realiza correctamente.