Introducción a Solid membrana compatibles Basada Electrofisiología

Por lo tanto, la electrofisiología basada en membranas respaldada se abrevia como electrofisiología basada en SSM. Es un nuevo enfoque electrofisiológico. Ofrece para una serie de aplicaciones una mejora significativa en comparación con los métodos convencionales.

La herramienta principal de la electrofisiología convencional es el electrodo de micropartículas lleno de electrolito, mientras que la electrofisiología basada en M detecta la translocación de carga a través de un electrodo de membrana sólido soportado. Es extremadamente útil en casos en los que no se puede utilizar la electrofisiología convencional, como en el caso de los transportadores bacterianos, que, aparte de algunas raras excepciones, no se pueden investigar mediante métodos de pinza de voltaje o leva de parche. En tales casos, la electrofisiología basada en SSM ha demostrado ser muy exitosa.

También se puede emplear para investigar transportadores eucariotas fisiológicamente relevantes en membranas intracelulares. Hay muchas formas de llevar a cabo experimentos de electrofisiología basados en SSM. En investigación básica, se puede aplicar para determinar parámetros cinéticos y clarificar el mecanismo de transporte, pero su robustez y potencial de automatización lo hacen ideal para aplicaciones de cribado en el descubrimiento de pistas.

El electrodo SSM lleva un sistema de membrana compuesto que consiste en el SSM subyacente y los proteasomas o fragmentos de membrana que contienen la proteína de transporte de interés. Las propiedades eléctricas de la membrana compuesta se pueden describir mediante un circuito equivalente en el que las membranas forman un sistema acoplado capacitivamente. Tenga en cuenta que el comportamiento eléctrico del sistema es esencialmente el mismo ya sea que se utilicen fragmentos de membrana o liposomas de protea.

El desplazamiento de carga en la proteína transportadora se transmite al circuito de medición a través de la capacitancia de la membrana vesical. Un principio de detección llamado acoplamiento capacitivo. En un experimento típico, el intercambio rápido de soluciones en VSSM proporciona el sustrato para la proteína de transporte V, lo que resulta de la actividad de transporte electrogénico de la proteína que genera una corriente, que se acopla al sistema de medición a través de la capacitancia del SSM.

Al mismo tiempo, la actividad electrogénica de la proteína carga gradualmente la membrana liposomal que conduce a una inhibición de la proteína de transporte y la disminución de la corriente en el circuito de registro, la corriente medida es el resultado de reacciones de transporte simultáneas de millones de liposomas protea absorbidos por el Enzo. Cada uno contiene alrededor de 100 transportadores. La configuración consta de una jaula de Faraday con una vía de solución, circuitos externos para el control de válvulas, amplificación de señales, además de adquisición y análisis de datos.

La jaula EC incluye contenedores, válvulas y tubos necesarios para el control del flujo de la solución, así como un codo con un chip XOR. El chip XOR transporta el electrodo SSM y los liposomas prot absorbidos. El vete está conectado al amplificador y al generador de funciones del circuito eléctrico externo.

Mediciones de SSM, provocan fuego, dos soluciones, una activadora y otra no activante, aparte del sustrato, que está presente solo en la solución activadora. Ambas soluciones tienen la misma composición en la configuración de intercambio único. Dos válvulas de dos vías controlan el flujo de las soluciones no reactivadoras y activadoras.

La válvula terminal, una válvula de tres vías tres veces acoplada mecánicamente, se utiliza para cambiar entre las soluciones no activadoras y activadoras, dirigiendo una de las soluciones al contenedor de residuos y la otra solución al qve. Cuando se conmuta la válvula terminal, el flujo de la solución no activadora se redirige a los residuos y la solución activadora fluye al qve. Esta configuración permite un flujo continuo simultáneo de ambas soluciones.

En cualquier momento durante el protocolo de flujo, la ruta de flujo se puede optimizar según sea necesario. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la distancia entre el MUS y la unión de las soluciones activadoras y no activadoras debe ser lo más corta posible. Ya que determina la solución del temporizador del intercambio de soluciones.

El amplificador de corriente fuera de la caja de la plataforma de alimentación está conectado a un chip sensor. Por lo general, esto se establece en una amplificación de 10 a la potencia de ocho a 10, a la potencia de nueve voltios por amperio y un tiempo de reposo de uno a 10 milisegundos. Un generador de funciones está conectado al electrodo de referencia y un ordenador con software de control de válvulas y adquisición de datos y una caja de interfaz completan el sistema.

La caja de interfaz contiene la adquisición de datos de los controladores de válvulas y el flujo de la solución de hardware de salida digital se mantiene mediante aire presurizado de oh 0.22. La presión de un bar se controla mediante un milímetro digital. Se puede mantener llenando un contenedor de acero instalado entre el suministro de aire y los recipientes de solución en la jaula EC a través de una válvula de aguja.

El CVIC consta de cuatro partes. El chip zen se intercala entre la base veterinaria y la cabeza veterinaria. Un conector de salida cilíndrico se atornilla al cabezal veterinario y lleva el conjunto de electrodos de referencia.

El electrodo de referencia consiste en un alambre de plata clorada con un conector SMC en miniatura y está aislado de la vía de flujo por un puente de sal en gel de poliacry. El conjunto de puente de gel no está en uso, se almacena en una solución de fosfato de potasio de pH siete de 100 milimolares que contiene cloruro de potasio de 100 milimolares. En primer lugar, el electrodo de referencia debe montarse en el conjunto de electrodos de referencia que contiene el geopuente.

Es importante evitar las burbujas de aire durante la instalación del electrodo de referencia. Ahora, esta parte de la veta está conectada al conector de salida, que se ha llenado previamente con solución tampón. Todas las conexiones deben estar selladas con juntas tóricas.

Este SM se forma en un chip zor, una luz de vidrio estructurada recubierta de cabra. Esta carretera semimática tiene un milímetro y un diámetro y está conectada a la almohadilla de contacto a través de una tira de contacto blanca de 0,2 milímetros. Un pin de contacto de resorte crea un contacto con el amplificador.

El chip zen se almacena en la oscuridad en una solución de etanol tiol Okta Deccan de 10 LAR. Para mantener su capa arcana para eliminar las moléculas virales de Okta deccan, que no han sido absorbidas, el electrodo se enjuaga con etanol puro y el electrodo se seca en gas nitrógeno. Ahora se puede ensamblar la monocapa de fosfocolina.

La solución lipídica contiene 15 miligramos por mililitro de colina DFI y 250 microgramos por mililitro. La mina Okta dos A está en descomposición y se almacena a menos 20 grados. El electrodo ahora se coloca con precisión en la base de un codo SA.

Se añade un microlitro de la solución al electrodo SSM sin tocar la capa de oro. Inmediatamente después de agregar la solución lipídica, se puede ensamblar el vete. El volumen vete sellado por una junta tórica es cilíndrico con un volumen interno de 17 microlitros cuando está montado.

El SSM debe estar centrado debajo del orificio de entrada. Antes de conectar al veterinario, el sistema de fluidos debe llenarse previamente con una solución tampón de fosfato de potasio de 100 milimolares. Es importante asegurarse de que no haya burbujas de aire en la tubería y las válvulas.

Ahora el veterinario se puede montar en la jaula de día de la tiroides, conectar el amplificador, la entrada y salida de la vía de flujo de solución y el generador de funciones. Finalmente, el codo se puede enjuagar con un tampón de fosfato de potasio de 100 milímetros. Esto conduce a la formación espontánea del MUS para comprobar la calidad del MUS.

La capacitancia y la conductancia se miden utilizando el generador de funciones, para medir la conductancia se utiliza un voltaje de CC de 100 milivoltios. El decaimiento de corriente muestra la carga del condensador de membrana después de que el condensador está completamente cargado. La corriente medida produce la conductancia de la membrana utilizando la ley M.

Aquí observamos una conductancia de oh 0,17 nano Siemens. La capacitancia se puede medir utilizando un voltaje de CA triangular de 50 milivoltios de amplitud pico a pico y una frecuencia de 0,5 hercios. La amplitud de la corriente de onda cuadrada resultante representa la corriente de juicio del condensador.

La capacitancia es igual a la carga transferida dividida por el voltaje impuesto. Esta membrana muestra una capacitancia de 2.3 nano, una alta conductancia y una baja capacitancia indican que el SSM no está formado correctamente. En estos casos, se debe desechar la membrana y preparar otro SSM utilizando un nuevo chip de electrodo.

Por lo general, los liposomas prot se almacenan congelados a menos 80. La sonicación de la muestra en hielo es esencial porque una muestra agregada absorbe la polea hasta el SSM para obtener una suspensión homogénea de liposomas prot. Se alternan tres ciclos de sonicación de diez segundos con intervalos de enfriamiento de diez segundos en hielo.

Enjuague su SSM con una solución no activante. A continuación, desatornille el conector de salida junto con la muestra de electrodo de referencia. Con una pipeta, inyecte 30 microlitros de la muestra de proteína a través de la salida de la veta en el volumen de la ette.

En primer lugar, monte la punta de la pipeta en el orificio de salida. A continuación, abra el manual de arriba en la vía no activadora e inyecte los liposomas protea. Antes de degradar la punta de la pipeta.

Cierre el manual anterior para evitar que la solución siga fluyendo. Deje que los liposomas de protea se absorban en el SSM durante un tiempo de incubación de una a dos horas. Utilice la ventana de protocolo de flujo del software de control y adquisición de datos de válvulas para definir su protocolo de flujo.

Si desea medir en condiciones simétricas, como para determinar la especificidad del sustrato, el valor de KM o la dependencia del pH, elija el protocolo de intercambio de solución única. Establezca la duración del flujo para cada solución entre 0,5 y un segundo. La corriente se registra a lo largo de todo el protocolo de flujo.

La amplificación normalmente se establece en 10 a la potencia de nueve, y para la frecuencia de muestreo, elegimos 2000 puntos de datos por segundo. Por último, guarde el nuevo protocolo con el título NA a y a. En el segundo toque de la ventana del protocolo de flujo, puede definir el estado abierto o cerrado de válvulas específicas para controlar el flujo de la solución no activadora o activadora a través de qubit.

Aquí demostramos la medición de liposomas de protea, el azúcar protón importado como Y de E. coli. La solución activadora contiene el sustrato transportado lactosa, mientras que la solución no activadora contiene la misma cantidad de glucosa no transportada como compuesto compensatorio. Además de los azúcares, las soluciones contienen 100 milimolares de fosfato de potasio a pH 7,6 y un milimolar de DTT.

Después de cambiar las soluciones, use la válvula manual para asegurarse de que se eliminen las burbujas de aire. Antes de iniciar un protocolo de flujo, ajuste la presión justo antes de iniciar la medición. Utilizamos habitualmente la presión de Ø 0,6 bar, que en nuestra configuración específica de válvulas y tubos produce un caudal de aproximadamente un mililitro por segundo.

A continuación, seleccione aquí un protocolo de flujo seguro, el protocolo NAA, y pulse el botón de inicio para iniciar cada medición. Durante las primeras mediciones, los liposomas de protea se eliminan y, por lo tanto, la corriente máxima puede disminuir. Repita la medición hasta que la corriente máxima permanezca constante.

Durante la primera fase del flujo de solución no activadora, la corriente es cero. El cambio de la solución no activadora a la activadora, que contiene lactosa, induce la actividad de transporte electrogénico de la membrana. La carga positiva de la proteína se acumula dentro de los liposomas prote y el amplificador detecta una corriente transitoria positiva debido al acoplamiento positivo a través del SSM.

Esta corriente positiva acoplada positivamente se denomina intercambio V de señal de encendido de la solución activadora. Volviendo a la solución no activadora, induce el transporte del código de azúcar protón fuera de los liposomas. En este caso, se muestra una corriente acoplada LY negativa, la llamada señal de apagado para el análisis cinético de proteínas.

Solo se utiliza la señal de encendido, ya que la señal de apagado está mal definida debido al estado de carga de la válvula de membrana, la conmutación crea artefactos mecánicos y eléctricos. Afortunadamente, estos están restringidos a un rango de tiempo antes de que se observen las señales inducidas por la proteína. Tenga en cuenta que el retraso de 50 milisegundos entre los artefactos de conmutación de la válvula y las señales del transportador es el tiempo que la solución necesita para propagarse desde la válvula terminal hasta la superficie del SSM. El intercambio rápido de soluciones, como el realizado en el SSM, representa un experimento de relajación típico.

En tales experimentos, la corriente se relaja a través de una fase de estado preestacionario dependiente del tiempo a un estado estacionario constante. Los detalles cinéticos actuales del ciclo de reacción se pueden derivar de la forma y magnitud de la corriente de estado preestacionario. Mientras que la corriente de estado estacionario proporciona información sobre el recambio continuo de proteínas de membrana.

En el sistema acoplado en el que los liposomas de protea son absorbidos por su SSM, las corrientes de estado preestacionario son prácticamente inalteradas. Si bien nunca se obtiene una corriente de estado estacionario constante, debido a la carga de los liposomas, la corriente medida disminuye gradualmente. La corriente del transportador se puede calcular a partir de la corriente acoplada medida mediante el análisis de circuitos.

Aquí demostramos resultados representativos utilizando el cotransportador de azúcar y protón, como Y en el rango de PA entre 8.5 y 7.6. La corriente del transportador está dominada por una reacción electrogénica al final del ciclo de reacción. En estas condiciones, la cara de estado preestacionario consiste en un aumento de corriente simple hasta su valor de estado estacionario.

A continuación, decae debido al acoplamiento capacitivo. Estamos interesados en la corriente de transporte de estado estacionario. En ausencia de un potencial de membrana, éste se representa con una buena aproximación por la corriente máxima.

Por lo tanto, la cinética de Ali Mein se puede analizar mediante la transferencia de las corrientes máximas para diferentes concentraciones de sustrato, pero tenga en cuenta que las amplitudes de las corrientes máximas solo se pueden comparar rigurosamente si se obtienen de un solo sensor en un solo experimento. Una de las razones es la variabilidad de la eficiencia de absorción. Cuando el pH se reduce aún más, la señal monofásica se vuelve bifásica.

Y, por último, se mantiene un transitorio rápido para el transporte deficiente del mutante Y de retraso. El transitorio rápido es seguido por un componente negativo pequeño y más lento. El componente negativo es característico de las corrientes transitorias rápidas medidas en sistemas acoplados y es causado por la descarga de capacitancia de la membrana.

Aquí, el pico de corriente no representa el transporte en estado estacionario, sino más bien una confirmación electrogénica de la transición al principio del ciclo iónico, que se hace evidente porque el mutante a la y no muestra transporte en estado estacionario, y para el retraso de tipo salvaje, el transporte en estado estacionario y es inhibido por un pH bajo. La evidencia experimental proporciona una interpretación mecanicista de la translocación de carga en el ciclo de reacción de retraso y, que se muestra en el modelo cinético. El rápido transitorio observado para el mutante de transporte deficiente, o en el caso del retraso de tipo salvaje Y en condiciones ácidas, se debe a una rápida reacción electrogénica semanal después de la unión de lactosa a valores de pH más altos, la señal está dominada por la reacción electrogénica principal al final del ciclo de reacción, que se propuso que representaba la liberación de protones pseudoplasmáticos en el sistema acoplado capacitivamente.

Esto conduce a corrientes transitorias que representan el transporte en estado estacionario de Lag y debido a la fuerte interacción de los Utes. Con el SSM, se generan artefactos eléctricos cuando se intercambian soluciones de diferente composición. Asegúrese de que las soluciones activadoras y no activadoras sean lo más similares posible, especialmente en lo que respecta a su pH y fuerzas iónicas.

Se debe llevar a cabo un control porque los sustratos también pueden producir artefactos. Pruebe siempre su sistema tampón específico y su protocolo de flujo en busca de artefactos utilizando el SSM desnudo antes de agregar la muestra de proteína. Después de agregar la muestra de proteína, las mediciones de control se pueden realizar con soluciones que no contienen sustratos, que son estructuralmente similares al sustrato.

Además, existe la posibilidad de analizar el sustrato en busca de artefactos utilizando liposomas o fragmentos de membrana sin la proteína de interés. También puede agregar inhibidores a sus soluciones o pipetearlas. Después del experimento directamente a la salida del vete para medir la inhibición de la señal del transportador, las señales específicas de la proteína desaparecerán, dejando solo artefactos de intercambio de solución.

De este modo, la señal de la proteína puede corregirse fácilmente. Asegúrese de que la pérdida de prot absorbido, liposomas o degradación de proteínas no afecte a su medición. Al realizar mediciones de control repetidas en condiciones idénticas, es aceptable una reducción de la señal de hasta el 20% y puede corregirse suponiendo una dependencia del tiempo lineal de la ejecución.

Esta configuración es el resultado de 20 años de desarrollo técnico en nuestro laboratorio. Además, están disponibles sistemas especializados con una solución de temporizador más alto para el análisis cinético y un menor consumo de solución para sustratos costosos. Para el cribado de fármacos, utilizamos configuraciones totalmente automáticas con un mayor rendimiento.

Hasta la fecha, se han caracterizado más de 20 transportadores utilizando este método. Estos incluyen APA de transporte, complejos de cadenas respiratorias, transportadores de refrigeración, intercambiadores e incluso canales de hierro. Por lo tanto, cuando no pueda resolver su problema mediante la electrofisiología estándar, considere usar la electrofisiología SS Mase en su lugar.