Introducción a Solid membrana compatibles Basada Electrofisiología

Electrofisiología basada en membranas soportadas, abreviada como electrofisiología basada en SSM. Es un nuevo enfoque electrofisiológico. Ofrece, para diversas aplicaciones, una mejora significativa en comparación con los métodos convencionales.

La herramienta principal de la electrofisiología convencional es el electrodo de micropartículas lleno de electrolito, mientras que la electrofisiología basada en M detecta la translocación de carga mediante un electrodo de membrana soportada sólida. Es extremadamente útil en casos donde no puede emplearse la electrofisiología convencional, como en el caso de transportadores bacterianos, que, aparte de algunas pocas excepciones raras, no pueden estudiarse mediante métodos de bloqueo de voltaje o de parche. En tales casos, la electrofisiología basada en SSM ha demostrado ser muy exitosa.

También puede emplearse para investigar transportadores eucariotas fisiológicamente relevantes en membranas intracelulares. Existen muchas formas de realizar experimentos de electrofisiología basados en SSM. En investigación básica, puede aplicarse para determinar parámetros cinéticos y aclarar el mecanismo de transporte, pero su robustez y potencial para la automatización lo hacen ideal para aplicaciones de cribado en el descubrimiento de fármacos.

El electrodo SSM lleva un sistema de membrana compuesta formado por la SSM subyacente y los proteasomas incorporados o fragmentos de membrana que contienen la proteína de transporte de interés. Las propiedades eléctricas de la membrana compuesta pueden describirse mediante un circuito equivalente en el que las membranas forman un sistema acoplado capacitivamente. Téngase en cuenta que el comportamiento eléctrico del sistema es esencialmente el mismo independientemente de que se utilicen fragmentos de membrana o liposomas proteicos.

El desplazamiento de carga en la proteína de transporte se transmite al circuito de medición mediante la capacitancia de la membrana de la vejiga. Un principio de detección denominado acoplamiento capacitivo. En un experimento típico, el intercambio rápido de solución en el VSSM proporciona el sustrato para la proteína de transporte V, y la actividad de transporte electrogeno de la proteína genera una corriente, que se acopla directamente al sistema de medición mediante la capacitancia del SSM.

Al mismo tiempo, la actividad electrogénica de la proteína carga progresivamente la membrana liposomal, lo que conduce a la inhibición de la proteína de transporte y a la disminución de la corriente en el circuito de registro; la corriente medida es el resultado de reacciones de transporte simultáneas de millones de liposomas proteicos adsorbidos al Enzo, cada uno conteniendo aproximadamente 100 transportadores. El montaje consta de una jaula de Faraday con un recorrido para la solución, circuitos externos para el control de válvulas, amplificación de señal, así como adquisición y análisis de datos.

La jaula EC incluye contenedores, válvulas y tubos necesarios para el control del flujo de solución, así como un cubit con un chip XOR. El chip XOR lleva el electrodo SSM y los liposomas prot absorbidos. El vete está conectado al amplificador y al generador de funciones del circuito eléctrico externo.

Las mediciones de SSM, provocan fuego, dos soluciones, una activadora y otra no activadora, aparte del sustrato, que está presente solo en la solución activadora. Ambas soluciones tienen la misma composición en la configuración de intercambio simple. Dos válvulas de dos vías controlan el flujo de las soluciones no activadora y activadora.

La válvula terminal, una válvula tres por tres acoplada mecánicamente, se utiliza para cambiar entre las soluciones no activadoras y las soluciones activadoras, dirigiendo una de las soluciones al recipiente de desecho y la otra solución al qve. Cuando se cambia la válvula terminal, el flujo de la solución no activadora se redirige al desecho y la solución activadora fluye hacia el qve. Esta configuración permite un flujo continuo simultáneo de ambas soluciones.

En cualquier momento durante el protocolo de flujo, la trayectoria del flujo puede optimizarse según sea necesario. Sin embargo, se debe tener en cuenta que la distancia entre la SSM y la unión de las soluciones no activadoras y activadoras debe mantenerse lo más corta posible, ya que determina el tiempo de solución del intercambio de soluciones.

El amplificador de corriente ubicado fuera de la jaula del módulo de alimentación está conectado a un chip sensor. Por lo general, se configura una amplificación de 10 a la potencia de ocho a 10, a la potencia de nueve voltios por amperio y un tiempo de reposo de uno a 10 milisegundos. Un generador de funciones está conectado al electrodo de referencia, y un ordenador con software de control de válvulas y adquisición de datos, junto con una caja de interfaz, completan el sistema.

El caja de interfaz contiene los controladores de válvula, la adquisición de datos y la solución de hardware para la salida digital; el flujo se mantiene mediante aire presurizado de oh 0,22. Se monitorea una presión de una bar mediante un manómetro digital. Esta presión puede mantenerse llenando un recipiente de acero instalado entre la fuente de aire y los contenedores de solución en la jaula EC a través de una válvula de aguja.

El CVIC consta de cuatro partes. El chip zen está colocado entre la base vet y la cabeza vet. Un conector de salida cilíndrico se atornilla a la cabeza vet y sostiene el ensamblaje del electrodo de referencia.

El electrodo de referencia consiste en un alambre de plata clorurada con un conector SMC miniatura y está aislado del camino de flujo mediante un puente salino de gel de acrilato polimérico. Cuando no se utiliza, el conjunto del puente de gel se almacena en una solución de fosfato de potasio 100 milimolar a pH siete que contiene 100 milimolar de cloruro de potasio. Primero, el electrodo de referencia debe montarse en el conjunto del electrodo de referencia que contiene el puente geo.

Es importante evitar burbujas de aire al instalar el electrodo de referencia. Ahora esta parte del vete se conecta al conector de salida, que ha sido previamente llenado con solución tampón. Todas las conexiones deben sellarse con anillos O.

Este SM se forma sobre un chip zor, un vidrio con recubrimiento estructurado de cabra. Esta vía semática tiene un milímetro de largo y de diámetro, y está conectada a la almohadilla de contacto mediante una franja conductora blanca de 0,2 milímetros. Un pasador de contacto de resorte establece la conexión con el amplificador.

El chip zen se almacena en la oscuridad en una solución de etanol tiol de 10 LAR Okta Deccan. Para mantener su capa de ti arcana y eliminar las moléculas virales de Okta Deccan que no han sido absorbidas, el electrodo se enjuaga con etanol puro y se seca con gas nitrógeno. Ahora se puede ensamblar la monocapa de fosfocolina.

La solución lipídica contiene 15 miligramos por mililitro de colina DFI y 250 microgramos por mililitro. Okta dos A amina en descomposición y se almacena a menos 20 grados. El electrodo se coloca ahora con precisión sobre la base del cúbito SA.

Se añade un microlitro de la solución al electrodo SSM sin tocar la capa de oro. Inmediatamente después de añadir la solución lipídica, se puede ensamblar el vete. El volumen del vete sellado por una junta tórica tiene forma cilíndrica y un volumen interno de 17 microlitros cuando está montado.

El SSM debe estar centrado bajo el orificio de entrada. Antes de conectar el vet, el sistema de fluidos debe llenarse previamente con una solución tampón de fosfato de potasio 100 milimolar. Es importante asegurarse de que no haya burbujas de aire en los tubos ni en las válvulas.

Ahora el vet puede montarse en la jaula de tiroides, conectar el amplificador, la entrada y salida del recorrido de flujo de la solución y el generador de funciones. Finalmente, el cubito puede enjuagarse con un tampón de fosfato de potasio de 100 milimolar. Esto conduce a la formación espontánea de SSM para verificar la calidad del SSM.

La capacitancia y la conductancia se miden utilizando el generador de funciones para medir la conductancia; se emplea un voltaje continuo de 100 milivoltios. La disminución de la corriente muestra la carga del capacitor de la membrana después de que el capacitor se ha cargado completamente. La corriente medida proporciona la conductancia de la membrana utilizando la ley de M'S.

Aquí observamos una conductancia de 0,17 nano Siemens. La capacitancia se puede medir utilizando un voltaje alterno triangular de 50 milivoltios de amplitud pico a pico y una frecuencia de 0,5 hercios. La amplitud de la corriente de onda cuadrada resultante representa la corriente de juicio del capacitor.

La capacitancia es igual a la carga transferida dividida por el voltaje impuesto. Esta membrana muestra una capacitancia de 2,3 nano; una alta conductancia y una baja capacitancia indican que el SSM no se ha formado correctamente. En estos casos, la membrana debe descartarse y debe prepararse otro SSM utilizando un nuevo chip de electrodo.

Por lo general, los liposomas con proteínas se almacenan congelados a menos 80. ES ESENCIAL mantener la muestra en hielo durante la sonicación, ya que una muestra agregada absorbe mal al SSM para obtener una suspensión homogénea de liposomas con proteínas. Se alternan tres ciclos de sonicación de diez segundos con intervalos de enfriamiento de diez segundos en hielo.

Lave su SSM con solución no activadora. A continuación, desenrosque el conector de salida junto con la muestra del electrodo de referencia. Mediante una pipeta, inyecte 30 microlitros de la muestra de proteína a través de la salida del vete dentro del volumen de la ette.

Primero monte la punta de la pipeta en el orificio de salida. Luego abra el manual anterior en la vía no activadora e inyecte los liposomas de proteasa. Antes de desechar la punta de la pipeta.

Cierre el manual anterior para evitar el flujo adicional de solución. Deje que los liposomas de protea se absorban a la SSM durante un tiempo de incubación de una a dos horas. Utilice la ventana de protocolo de flujo del software de control de válvulas y adquisición de datos para definir su protocolo de flujo.

Si desea medir bajo condiciones simétricas, como para la determinación de la especificidad del sustrato, el valor de KM o la dependencia del pH, elija el protocolo de intercambio de solución única. Establezca la duración del flujo para cada solución entre 0,5 y un segundo. La corriente se registra durante todo el protocolo de flujo.

La amplificación se establece normalmente en 10 elevado a nueve, y para la tasa de muestreo, se eligen 2000 puntos de datos por segundo. Finalmente, guarde su nuevo protocolo bajo el título NA a y a. En la segunda pestaña de la ventana del protocolo de flujo, puede definir el estado abierto o cerrado de válvulas específicas para controlar el flujo de soluciones no activadoras o activadoras a través de qubit.

Aquí demostramos la medición de proteasomas liposomales, la importación de protones de azúcar tipo Y proveniente de E. coli. La solución activadora contiene el sustrato transportado, lactosa, mientras que la solución no activadora contiene la misma cantidad de glucosa no transportada como compuesto compensatorio. Además de los azúcares, las soluciones contienen fosfato de potasio 100 milimolar a pH 7,6 y un milimolar de DTT.

Después de cambiar las soluciones, utilice la válvula manual para asegurarse de que se eliminen las burbujas de aire. Antes de iniciar un protocolo de flujo, ajuste la presión justo antes de comenzar la medición. Habitualmente utilizamos una presión de 0,6 bar, que, con nuestra configuración específica de válvula y tubo, produce un caudal de aproximadamente un mililitro por segundo.

Luego, seleccione aquí un protocolo de flujo seguro, el protocolo NAA, y presione el botón de inicio para comenzar cada medición. Durante las primeras mediciones, los liposomas de protea adsorbidos débilmente se eliminan y, por lo tanto, la corriente máxima puede disminuir. Repita la medición hasta que la corriente máxima permanezca constante.

Durante la primera fase del flujo de solución no activadora, la corriente es cero. El intercambio de la solución no activadora a la solución activadora, que contiene lactosa, induce la actividad de transporte electrogénico de la membrana. Las cargas positivas de la proteína se acumulan en el interior de los proteoliposomas y el amplificador detecta una corriente transitoria positiva debido al acoplamiento positivo a través del SSM.

Esta corriente positiva acoplada positivamente se denomina señal de encendido V intercambio desde la solución activadora. El retorno a la solución no activadora induce el transporte de protones y azúcares fuera de los liposomas. En este caso, se muestra una corriente acoplada negativa LY, la llamada señal de apagado para el análisis cinético de proteínas.

Solo se utiliza la señal de encendido, ya que la señal de apagado está mal definida debido a que el estado de carga generado por el conmutador de la válvula de membrana crea artefactos mecánicos y eléctricos. Afortunadamente, estos artefactos se restringen a un intervalo de tiempo anterior a la observación de las señales inducidas por la proteína. Téngase en cuenta que el retraso de 50 milisegundos entre los artefactos de conmutación de la válvula y las señales del transportador corresponde al tiempo que necesita la solución para propagarse desde la válvula terminal hasta la superficie del intercambio rápido de solución en matriz de soporte de membrana (SSM). Una manipulación como esta realizada sobre el SSM representa un experimento típico de relajación.

En tales experimentos, la corriente se relaja a través de una fase dependiente del tiempo previa al estado estacionario hacia un estado estacionario constante. Los detalles cinéticos de la corriente del ciclo de reacción pueden derivarse de la forma y magnitud de la corriente previa al estado estacionario. Mientras que la corriente en estado estacionario proporciona información sobre el recambio continuo de la proteína de membrana.

En el sistema acoplado lípidos donde los liposomas de proteasa se absorben a su SSM, las corrientes en estado preestacionario están prácticamente inalteradas. Aunque nunca se obtiene una corriente constante en estado estacionario, debido a la carga de los liposomas, la corriente medida disminuye gradualmente. La corriente del transportador puede calcularse a partir de la corriente acoplada lípido medida mediante análisis de circuitos.

Aquí demostramos resultados representativos utilizando el cotransportador de protones de azúcar, como Y en el rango de PA entre 8,5 y 7,6. La corriente del transportador está dominada por una reacción electrogénica tardía en el ciclo de reacción. Bajo estas condiciones, la fase preestacionaria consiste en un aumento simple de la corriente hasta su valor estacionario.

Esto luego decae debido al acoplamiento capacitivo. Estamos interesados en la corriente de transporte en estado estacionario. En ausencia de un potencial de membrana, esto se representa mediante una buena aproximación por la corriente pico.

Por lo tanto, la cinética de Ali Mein puede analizarse mediante la representación de las corrientes máximas para diferentes concentraciones de sustrato, pero considérese que las amplitudes de corriente máxima solo pueden compararse rigurosamente si se obtienen de un solo sensor en un único experimento. Una razón es la variabilidad de la eficiencia de absorción. Cuando el pH se reduce aún más, la señal monofásica se vuelve bifásica.

Y finalmente, permanece un transitorio rápido para el mutante deficiente en transporte lag Y. El transitorio rápido va seguido por un componente negativo pequeño y más lento. El componente negativo es característico de las corrientes transitorias rápidas medidas en sistemas acoplados ly y es causado por la descarga de la capacitancia de la membrana.

Aquí, la corriente máxima no representa un transporte en estado estacionario, sino más bien una confirmación electrogena de una transición temprana en el ciclo iónico, lo cual se hace evidente porque un mutante de tipo y no muestra transporte en estado estacionario, y en el caso del tipo silvestre lag, el transporte en estado estacionario de y se inhibe por un pH bajo. La evidencia experimental proporciona una interpretación mecanicista de la translocación de carga en el ciclo de reacción de lag y, que se muestra en el modelo cinético. El transitorio rápido observado en el mutante deficiente en transporte, o en el caso del tipo silvestre lag Y en condiciones ácidas, se debe a una reacción electrogena rápida y periódica posterior a la unión de lactosa a valores de pH más altos; la señal está dominada por la reacción electrogena principal al final del ciclo de reacción, la cual se ha propuesto que representa la liberación de protones pseudoplásmica en el sistema acoplado capacitivamente.

Esto conduce a corrientes transitorias que representan el transporte en estado estacionario de Lag y debido a la fuerte interacción de los Utes. Con el SSM, se generan artefactos eléctricos cuando se intercambian soluciones de diferente composición. Asegúrese de que las soluciones no activadoras y activadoras sean lo más similares posible, especialmente con respecto a su pH y fuerzas iónicas.

Se debe realizar un control porque los sustratos también pueden producir artefactos. Siempre pruebe su sistema de tampón y protocolo de flujo específicos en busca de artefactos utilizando el SSM desnudo antes de añadir la muestra de proteína. Después de añadir la muestra de proteína, se pueden realizar mediciones de control con soluciones que contienen compuestos no sustratos, estructuralmente similares al sustrato.

Además, existe la posibilidad de probar el sustrato para detectar artefactos utilizando liposomas o fragmentos de membrana sin la proteína de interés. También puede añadir inhibidores a sus soluciones o pipetearlos. Después del experimento, directamente al extremo de salida del vete, para medir la inhibición de la señal del transportador; las señales específicas de la proteína desaparecerán entonces, dejando únicamente los artefactos del intercambio de solución.

La señal de la proteína luego puede corregirse fácilmente. Asegúrese de que la pérdida de proteína absorbida, liposomas o degradación de la proteína no afecte su medición. Al realizar mediciones de control repetidas en condiciones idénticas, una disminución de la señal de hasta el 20 % es aceptable y puede corregirse asumiendo una dependencia temporal lineal de dicha disminución.

Este montaje es el resultado de 20 años de desarrollo técnico en nuestro laboratorio. Asimismo, existen sistemas especializados con mayor solución temporizadora para análisis cinéticos y menor consumo de solución para sustratos costosos. Para la selección de fármacos, utilizamos montajes completamente automáticos con mayor rendimiento.

Hasta la fecha, se han caracterizado más de 20 transportadores utilizando este método. Estos incluyen transportadores de APAs, complejos de la cadena respiratoria, transportadores de tipo cool, intercambiadores e incluso canales de hierro. Por lo tanto, cuando no pueda resolver su problema mediante electrofisiología estándar, considere utilizar en su lugar la electrofisiología SS Mase.