Teléfono directo Análisis de Ciclo de

El objetivo general de este procedimiento es medir la fase relativa del ciclo celular y el tamaño celular de los tejidos con poblaciones celulares manipuladas genéticamente y marcadas con GFP o RFP en Drosophila. En primer lugar, establecer cruces genéticos para generar células que contengan progenie marcadas con las proteínas fluorescentes deseadas y con las manipulaciones genéticas deseadas en un tejido o población específica de células. Bajo estudio, aísle limpiamente el tejido deseado de la progenie de la etapa de desarrollo adecuada, luego disocie el tejido a una suspensión de una sola célula y tiña con un tinte de ADN viable para medir el contenido de ADN.

Analice las muestras disociadas teñidas mediante citometría de flujo. En última instancia, los resultados in vivo miden los cambios en el tamaño de las células y la fase del ciclo celular causados por las manipulaciones genéticas en estudio. La principal ventaja de esta técnica sobre el método existente de citometría de flujo en tejidos vivos de Drosophila que utiliza colorantes ultravioleta es que el ciclo de tinte violeta es compatible con citómetros de sobremesa menos costosos que contienen un láser violeta 4 0 5, que se puede comprar con un presupuesto pequeño y mantener en una sola escala de laboratorio.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del ciclo celular al proporcionar información sobre la fase del ciclo celular y el tamaño de la célula que es más detallada que solo medir el tamaño general del tejido y la tasa de proliferación. Los que demuestren el procedimiento serán Kagel y Dan Sun, estudiantes graduados de mi laboratorio, y Olga Guko. Nuestro técnico recoge las larvas maduras en el tercer estadio larvario aproximadamente 110 a 120 horas después de la puesta de huevos para las disecciones de larvas.

La estadificación precisa de la pupila es esencial para los estudios durante la metamorfosis para esta cosecha pre pupa blanca al comienzo de la metamorfosis si es necesario, me mesa sellada placa de Petri de pupi o un vial de larvas en un baño de agua a 37 grados centígrados para activar el calor. Base abatible de mandril para clones de trazado de linaje. Después de abrir la placa de Petri, colóquela en una incubadora para que envejezca hasta la etapa de desarrollo deseada para la disección de la pupila.

Agarre suavemente una pupa por la punta anterior de la caja de la pupila donde hay una burbuja de aire para evitar dañar la pupa en el interior, coloque la pupa flotante para un agarre adecuado. Luego, con micro tijeras, corte limpiamente la punta posterior de la pupa en un ligero ángulo hacia la parte dorsal del animal para liberar la presión interna sin forzar la grasa hist en los tejidos deseados en el tórax y la cabeza, corte cuidadosamente a lo largo de la mediana dorsal, evitando dañar las alas y el complejo cerebral del ojo anterior para eliminar su grasa. A continuación, retire la pupila del estuche de la pupila agarrando el borde posterior de la epidermis de la pupila con fórceps y tirando de ella fuera del estuche de la pupila.

Transfiere la pupa diseccionada a un plato de disección limpio. Perfora un pequeño orificio en la cutícula anterior al complejo cerebral del ojo con fórceps. Usando una pipeta de pasta de vidrio con una pera de goma.

Lave suavemente la solución de disección de PBS a través de la pupa parcialmente diseccionada para eliminar cualquier resto de grasa y tejido intestinal. Para obtener las alas de la pupila, sostenga la pupa por la cabeza con una pinza usando una segunda pinza. Agarra la punta más posterior de la cutícula del ala, tira y desemájala del costado de la canal.

Luego corte o tire del ala en la bisagra para sacarla del cuerpo y colóquela en una pila lejos de los cadáveres y otros materiales para obtener la pupila, los ojos o el cerebro. Lave la pupa hasta que el complejo cerebral del ojo se desprenda y se libere de la pupa. Con una pinza, separe suavemente el ojo pupilar del cerebro y guarde el tejido deseado Con una pipeta pasada lubricada, transfiera con cuidado los tejidos disecados.

Incubar los tubos agitando a 23 grados centígrados a 500 RPM durante 70 minutos. A continuación, haga un vórtice suavemente durante cinco segundos a velocidad media y devuelva las muestras al agitador durante 15 a 20 minutos adicionales. Vortex toma muestras una vez más durante cinco segundos a velocidad media para el cerebro y los ojos de la pupila.

Antigüedad superior a 36 horas. Un PF disocia tejidos en una solución de tinción de ADN a 23 grados Celsius a 500 RPM durante 45 a 60 minutos. A continuación, disocie manualmente uno por uno grandes trozos de tejido transfiriéndolos a una placa de disección junto con unos 50 microlitros de solución de tinción de ADN.

Pipetea rápidamente hacia arriba y hacia abajo con un paso manual por la pipeta de aproximadamente 100 a 150 micrómetros de apertura. Agrupe los especímenes disociados en un tubo de cinco mililitros. Incubar 30 minutos adicionales a 23 grados centígrados con agitación a 500 RPM.

Verifique visualmente que las muestras estén completamente disociadas. Tenga en cuenta que la cutícula del ala de la pupila transparente acelular no se asociará. Comience el análisis por fax cargando la muestra en el citómetro.

A continuación, seleccione los canales para detectar la dispersión directa y la dispersión lateral, lo que indica el tamaño de la célula y la complejidad de la membrana. Para detectar la tinción violeta del ciclo D del ADN, deberá medir la altura, el ancho y el área de VL uno a partir de la excitación con láser violeta. También seleccione el canal láser azul en un área para medir la fluorescencia GFP.

Para el análisis de RFP, utilizamos el canal láser azul tres. Este canal en sintonía está optimizado para la detección de RFP. Establezca las compuertas para restringir el análisis a la población seleccionada y para limitar los escombros y vender grupos del análisis que genera gráficos de parada con la puerta uno, excluya los escombros y los grupos en el gráfico de SSC frente a FSC en el gráfico de VL un área frente a VL uno con el uso de GA dos para excluir las células no teñidas sub G uno, las células apoptóticas y los grupos de células en función de la identificación de singletes.

GA tres abarca las células dentro de las puertas uno y dos que son GFP negativas en el gráfico de fluorescencia frente al contenido de ADN basado en VE L una altura. A continuación, la marcha cuatro abarca las células dentro de las puertas uno y dos que son GFP positivas en el gráfico de fluorescencia frente al contenido de ADN. También se pueden generar las puertas cinco y seis a partir de diagramas de puntos del tamaño de la celda medido por GFP frente a la dispersión directa.

Para examinar las fases del ciclo celular, utilice los dos histogramas que representan el contenido de ADN en el eje x y el recuento de células en el eje Y ais para las poblaciones definidas por la puerta tres y la puerta cuatro. Para el tamaño de celda, los histogramas establecen las poblaciones en las puertas cinco y seis y trazan FSC en el eje x y los recuentos en el eje Y cuando se ejecutan muestras establecen la grabación para que se detenga en 10, 000. Los eventos positivos de GFP también establecen el volumen de adquisición para 300 microlitros.

Los ajustes de umbral y voltaje apropiados se encuentran dentro de las plantillas proporcionadas. Ejecute las muestras a 100 microlitros por minuto de sensibilidad estándar o alta y registre. Los archivos de datos registrados generados por el software Attune están en formato FCS, que es compatible con la mayoría de los programas de modelado de ciclos celulares.

Este espacio de trabajo representativo que contiene cuatro diagramas de puntos y dos histogramas muestra una muestra de ala de larva que expresa GFP y ciclina D en el ala posterior, impulsada por un transgén gal 4 Grial. El primer diagrama de puntos del tamaño de la celda con la marcha uno excluye los escombros y los grupos. El segundo diagrama de puntos discrimina los singletes con marcha dos para excluir las células no teñidas, el contenido de NA sub G 1D y los grupos en el gráfico de GFP frente al contenido de ADN.

Las celdas negativas y positivas de GFP se pueden distinguir y el contenido de dos N y cuatro NDNA es evidente en función de la posición a lo largo del eje x. Este gráfico del tamaño de la celda, medido por GFP frente a la dispersión directa, se utiliza para generar las puertas cinco y seis. Los análisis resultantes conducen a histogramas del contenido de ADN en comparación con los recuentos de la población negativa para GFP o RFP, así como para las células positivas para GFP o RFP.

Usando la plantilla de RFP proporcionada. Se obtienen resultados similares con el mismo tipo de tejido y patrón de expresión. Para RFP, las plantillas y los voltajes proporcionados son adecuados para el análisis de ojos, cerebros y alas de larvas, así como de ojos, cerebros y alas de pupilas.

En el software sintonizado. El uso de la función de escalado automático para los histogramas de ciclo de celda o tamaño de celda permite determinar el máximo global para cada población. Estos perfiles del ciclo celular representan células positivas y negativas de GFP en los ojos de las larvas que expresan GFP en la parte posterior.

Utilizando los cuatro transgenes U-A-S-G-F-P G-F de GMR, la superposición revela las diferencias en la fase del ciclo celular de las células que expresan GFP posterior. También se puede representar el cambio relativo en el tamaño de la celda entre las celdas positivas y negativas de GFP. Este perfil del ciclo celular se derivó de los cerebros de las pupilas a las 46 horas A PF. Las células GFP positivas son clones de rastreo de linaje que expresan el regulador G uno S, ciclina D y E dos F, que interrumpen la quiescencia y conducen a la entrada en la fase S.

Esto contrasta con las células negativas de GFP que no expresan, que en esta etapa normalmente se detienen. En G one, el software de sintonía genera regiones definidas por el usuario en los histogramas, delineando G una s y G dos fases. Una tabla de estadísticas para cada ejecución determina los recuentos absolutos de celdas dentro de las regiones y porcentajes definidos por el usuario.

Alternativamente, se puede utilizar software de modelado como mod fit para estimar porcentajes en cada fase, así como células apoptóticas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y etiquetar varios tejidos de Drosophila para el análisis del ciclo celular.