Name: ARN de predicción de estructura secundaria Utilizando SHAPE de alto rendimiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Aprende a predecir la estructura secundaria del ARN con resolución de nucleótido único utilizando la tecnología SHAPE de alto rendimiento. Este método combina modificación química, transcripción inversa y electroforesis capilar para analizar secuencias de ARN de cientos a miles de nucleótidos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

S. Lusvarghi, J. Sztuba-Solinska, KJ Purzycka, JW Rausch y SFJ Le Grice son apoyados por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de Salud, EE.UU..

<ol><li>Scott, W. G., Martick, M., Chi, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+regulatory+RNA+elements%3A+ribozymes+that+regulate+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Structure and function of regulatory RNA elements: ribozymes that regulate gene expression.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1789, 634-641 (2009).</li>
<li>Moore, P. B., Steitz, T. A. The roles of RNA in the synthesis of protein. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoore%2C+PB+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22">Cold Spring Harb. Perspect. Biol</a>. 3, a003780(2011).</li>
<li>Wilkinson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+SHAPE+analysis+reveals+structures+in+HIV-1+genomic+RNA+strongly+conserved+across+distinct+biological+states%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput SHAPE analysis reveals structures in HIV-1 genomic RNA strongly conserved across distinct biological states.</a> Plos Biol. 6, 883-899 (2008).</li>
<li>Merino, E. J., Wilkinson, K. A., Coughlan, J. L., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution+by+selective+2+%27-hydroxyl+acylation+and+primer+extension+%28SHAPE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">RNA structure analysis at single nucleotide resolution by selective 2 '-hydroxyl acylation and primer extension (SHAPE).</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 4223-4231 (2005).</li>
<li>Watts, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+secondary+structure+of+an+entire+HIV-1+RNA+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture and secondary structure of an entire HIV-1 RNA genome.</a> Nature. 460, 711-716 (2009).</li>
<li>Xu, W., Bolduc, F., Hong, N., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+a+combination+of+computer-assisted+structure+prediction+and+SHAPE+probing+to+elucidate+the+secondary+structures+of+five+viroids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">The use of a combination of computer-assisted structure prediction and SHAPE probing to elucidate the secondary structures of five viroids.</a> Mol. Plant Pathol. , (2012).</li>
<li>Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+architecture+of+the+human+long+non-coding+RNA%2C+steroid+receptor+RNA+activator%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structural architecture of the human long non-coding RNA, steroid receptor RNA activator.</a> Nucleic Acids Res. 40, 5034-5051 (2012).</li>
<li>Leshin, J. A., Heselpoth, R., Belew, A. T., Dinman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+structural+analysis+of+yeast+ribosomes+using+hSHAPE%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput structural analysis of yeast ribosomes using hSHAPE.</a> RNA Biol. 8, 478-487 (2011).</li>
<li>Souliere, M. F., Haller, A., Rieder, R., Micura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+powerful+approach+for+the+selection+of+2-aminopurine+substitution+sites+to+investigate+RNA+folding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A powerful approach for the selection of 2-aminopurine substitution sites to investigate RNA folding.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, 16161-16167 (2011).</li>
<li>Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+2+%27-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+%28SHAPE%29%3A+quantitative+RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Selective 2 '-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution.</a> Nat. Protoc. 1, 1610-1616 (2006).</li>
<li>McGinnis, J. L., Duncan, C. D. S., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Shape+and+Hydroxyl+Radical+Analysis+of+Rna+Structure+and+Ribonucleoprotein+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Shape and Hydroxyl Radical Analysis of Rna Structure and Ribonucleoprotein Assembly.</a> Method Enzymol. 468, 67-89 (2009).</li>
<li>Low, J. T., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHAPE-directed+RNA+secondary+structure+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">SHAPE-directed RNA secondary structure prediction.</a> Methods. 52, 150-158 (2010).</li>
<li>Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. S. A. F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+footprinting+analysis+software+for+high-throughput+quantification+of+nucleic+acid+footprinting+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Rna-a+Publication+of+the+Rna+Society%22%5BJournal%5D)">Semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments.</a> Rna-a Publication of the Rna Society. 11, 344-354 (2005).</li>
<li>Kertesz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+measurement+of+RNA+secondary+structure+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast.</a> Nature. 467, 103-107 (2010).</li>
<li>Underwood, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FragSeq%3A+transcriptome-wide+RNA+structure+probing+using+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">FragSeq: transcriptome-wide RNA structure probing using high-throughput sequencing.</a> Nat. Methods. 7, 995-1001 (2010).</li>
<li>Mauger, D. M., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+global+RNA+structure+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Toward global RNA structure analysis.</a> Nat. Biotechnol. 28, 1178-1179 (2010).</li>
<li>Lucks, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+RNA+structure+characterization+with+selective+2%27-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+%28SHAPE-Seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Multiplexed RNA structure characterization with selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 11063-11068 (2011).</li>
<li>Vasa, S. M., Guex, N., Wilkinson, K. A., Weeks, K. M., Giddings, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ShapeFinder%3A+a+software+system+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+nucleic+acid+reactivity+information+resolved+by+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">ShapeFinder: a software system for high-throughput quantitative analysis of nucleic acid reactivity information resolved by capillary electrophoresis.</a> RNA. 14, 1979-1990 (2008).</li>
<li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAstructure%3A+software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11, 129(2010).</li>
<li>Pang, P. S., Elazar, M., Pham, E. A., Glenn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+RNA+secondary+structure+mapping+by+automation+of+SHAPE+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Simplified RNA secondary structure mapping by automation of SHAPE data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 39, e151(2011).</li>
<li>Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+SHAPE-directed+RNA+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Accurate SHAPE-directed RNA structure determination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 97-102 (2009).</li>
<li>Darty, K., Denise, A., Ponty, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VARNA%3A+Interactive+drawing+and+editing+of+the+RNA+secondary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">VARNA: Interactive drawing and editing of the RNA secondary structure.</a> Bioinformatics. 25, 1974-1975 (2009).</li>
<li>Byun, Y., Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PseudoViewer%3A+web+application+and+web+service+for+visualizing+RNA+pseudoknots+and+secondary+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PseudoViewer: web application and web service for visualizing RNA pseudoknots and secondary structures.</a> Nucleic Acids Res. 34, 416-422 (2006).</li>
<li>Brown, T., Brown, D. J. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrown%2C+T+%22Oligonucleotides+and+Analogues+-+A+Practical+Approach%22">Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach</a>. Eckstein, F. , IRL Press. 20(1990).</li>
<li>Legiewicz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+Transport+Element+of+the+Murine+musD+Retrotransposon+Requires+Long-range+Intramolecular+Interactions+for+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The RNA Transport Element of the Murine musD Retrotransposon Requires Long-range Intramolecular Interactions for Function.</a> J. Biol. Chem. 285, 42097-42104 (2010).</li>
<li>Steen, K., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntheis+of+1-methyl-8-nitroisatoic+anhydride+%281M7%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Syntheis of 1-methyl-8-nitroisatoic anhydride (1M7).</a> Protocol Exchange. , (2011).</li>
<li>Mortimer, S. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast-acting+reagent+for+accurate+analysis+of+RNA+secondary+and+tertiary+structure+by+SHAPE+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A fast-acting reagent for accurate analysis of RNA secondary and tertiary structure by SHAPE chemistry.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 4144-4145 (2007).</li>
<li>Mitra, S., Shcherbakova, I. V., Altman, R. B., Brenowitz, M., Laederach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-nucleotide+structural+mapping+by+capillary+automated+footprinting+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-nucleotide structural mapping by capillary automated footprinting analysis.</a> Nucleic Acids Res. 36, e63(2008).</li>
<li>Giddings, M. C., Severin, J., Westphall, M., Wu, J., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+software+system+for+data+analysis+in+automated+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A software system for data analysis in automated DNA sequencing.</a> Genome Res. 8, 644-665 (1998).</li>
<li>Aviran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+and+automation+of+sequencing-based+characterization+of+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Modeling and automation of sequencing-based characterization of RNA structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 11069-11074 (2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Se presenta aquí un protocolo detallado para la forma de alto rendimiento, una técnica que permite la determinación de la estructura secundaria de la resolución de un solo nucleótido de ARN de cualquier tamaño. Por otra parte, el acoplamiento de datos experimentales forma con algoritmos de predicción de estructura secundaria facilita la generación de modelos de ARN 2D con un mayor grado de precisión que es posible con cualquiera de los métodos solos. La combinación de cebadores marcados con fluorescencia y automatizado ...

Para comprender las funciones de los ARN catalíticos y no codificantes implicadas en la regulación del corte y empalme, traducción, replicación del virus y el cáncer, se requiere un conocimiento detallado de la estructura del ARN 1,2. Desafortunadamente, la predicción exacta de ARN plegado presenta un reto formidable. Agentes de sondeo clásicas sufren de muchas desventajas tales como la toxicidad, la cobertura incompleta de nucleótidos y / o un caudal limitado a 100-150 nucleótidos por experimento. Algoritmos de predicción de estructura secundaria sin ayuda son igualmente desventajoso, debido a las inexactitudes que resultan de su incapacidad para distinguir efectivamente entre estructuras energéticamente similares. Grandes de ARN, en particular, también son a menudo refractario a los métodos de determinación de la estructura 3D, tales como la cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear (RMN), debido a su flexibilidad conformacional y grandes cantidades de muestras muy puras requeridas para estas técnicas. HFORMA igh rendimiento resuelve muchos de estos problemas al proporcionar un enfoque eficaz, sencilla de sondeo de las grandes estructuras de ARN a una resolución de un solo nucleótido. Por otra parte, los reactivos utilizados para la forma son seguros, fáciles de manejar y, en contraste con la mayoría de otros productos químicos de sondeo reactivos, reaccionan con los cuatro ribonucleótidos. Estos reactivos también pueden penetrar en las membranas celulares, por lo que es posible para sondear RNAs en su contexto in vivo (s) 3. Originalmente desarrollado en las Semanas de laboratorio 4, la forma ha sido utilizado para analizar una amplia variedad de ARN, el ejemplo más notable es la determinación de la estructura secundaria completa del ~ 9 kb VIH-1 ARN del genoma 5. Otros logros notables incluyen SHAPE utilizando elucidación de las estructuras de los viroides infecciosas 6, ARNs no codificantes largas humanos 7, ribosomas de levadura 8 y 9 riboswitches así como para identificar los sitios de unión de proteínas de virión asociada a VIH-1 RNA 3. While las variaciones originales y de alto rendimiento del protocolo SHAPE se han publicado en otros lugares 10 a 12, el presente trabajo ofrece una descripción detallada de la determinación de la estructura secundaria del ARN por la forma de alto rendimiento utilizando oligonucleótidos fluorescentes, la Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analyzer y software SHAPEfinder y RNAStructure (v5.3). Detalles técnicos inéditas y consejos de solución de problemas también se incluyen. Las variaciones de la forma La esencia de la forma y sus variaciones es la exposición de ARN en solución acuosa a anhídridos electrófilos que acilar selectivamente grupos ribosa 2&#39;-hidroxilo (2&#39;-OH), produciendo aductos voluminosos en los sitios de modificación. Esta reacción química sirve como un medio de interrogar a la dinámica estructural de ARN locales, como los nucleótidos de cadena simple son más propensas a adoptar conformaciones favorables para ataque electrofílico por estos reactivos, mientras que la base emparejado o arquitectónicamente Constrnucleótidos objetivó son menos o no reactivo 10. Los sitios de formación de aductos se detectan mediante transcripción inversa a partir de la iniciación fluorescentemente o radiomarcado cebadores hibridados a un sitio específico en el ARN modificado (el &quot;(+)&quot; reacción de extensión del cebador). Cuando la transcriptasa inversa (RT) no atravesar los ribonucleótidos acilados, un grupo de productos de ADNc se produce cuyas longitudes coinciden con los sitios de modificación. Un control, &quot;(-)&quot; cebador de extensión reacción utilizando ARN que no ha sido expuestos a reactivo también se realiza de modo que la terminación prematura de la síntesis de ADN (es decir, &quot;se detiene&quot;) debido a la estructura del ARN, no específica de ARN de hebra rotura, etc, mayo. distinguirse de deteniéndose producido por modificación química. Por último, dos reacciones de secuenciación didesoxi-inician a partir de los mismos cebadores se utilizan como marcadores para correlacionar nucleótidos reactivos con la secuencia primaria de ARN después de la electroforesis. En la solicitud original de SHAPE, el mismo 32-P marcado en el extremo cebador se utiliza para los (+), -, y dos reacciones de secuenciación (). Los productos de estas reacciones se cargan en pocillos adyacentes en una placa de gel de poliacrilamida al 5-8%, y se fraccionó por electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida (PAGE; Figura 1). El análisis cuantitativo de las imágenes de gel producidas por la forma convencional se puede realizar utilizando SAFA, un software de análisis de la huella de semi-automatizado 13. Por el contrario, la forma de alto rendimiento emplea cebadores marcados con fluorescencia y electroforesis capilar automatizado. Específicamente, para cada región de ARN bajo investigación, un conjunto de cuatro cebadores de ADN que tienen una secuencia común pero diferentes 5 &#39;etiquetas fluorescentes deben ser sintetizados o comprados. Estos oligonucleótidos marcados de manera diferente-sirven para dos reacciones principales forma y dos reacciones de secuenciación, los productos de los cuales se agrupan y se fraccionó / ​​detectaron por electroforesis capilar automatizado (CE). WherEAS el perfil de reactividad de los nt 100-150 de ARN se puede obtener a partir de un conjunto de cuatro reacciones utilizando el enfoque original, la forma de alto rendimiento permite la resolución de 300-600 nt a partir de una sola muestra agrupada 3. Hasta 8 conjuntos de reacciones puede ser fraccionado simultáneamente, mientras que tanto como 96 muestras pueden preparado para el fraccionamiento en el transcurso de 12 ejecuciones consecutivas de la CE (Figura 2). Por otra parte, el software SHAPEfinder, desarrollado para procesar y analizar los datos que se desprenden del CEQ y otros analizadores genéticos, es más automatizado y requiere mucho menos intervención del usuario de SAFA 13 u otros paquetes de gel de análisis. Más avanzadas metodologías de alto rendimiento han surgido recientemente tales como PARS (análisis paralelo de la estructura del ARN) 14 y Frag-Seq (fragmento de secuenciación) 15, que utilizan enzimas específicos de la estructura en lugar de reactivos de alquilación en conjunción con técnicas de secuenciación de próxima generación para obtener information sobre la estructura del ARN. A pesar del atractivo de estas técnicas, las muchas limitaciones inherentes a la nucleasa de sondeo siguen siendo 16. Estos problemas pueden ser evitados en la secuenciación FORMA (SHAPE-Seq) 17 protocolo, donde la secuenciación de próxima generación está precedida por modificación química y la transcripción inversa del ARN de una manera similar a la realizada en la forma convencional. Si bien estos métodos pueden representar el futuro de la determinación de la estructura de ARN, es importante recordar que la secuenciación de próxima generación es muy caro, y sigue sin estar disponible para muchos laboratorios. Análisis de datos SHAPE Los datos producidos en el analizador genético se presentan en la forma de un electroferograma, en el que la intensidad de fluorescencia de la muestra (s) que fluye a través del detector capilar se representa en función de un índice de tiempo de migración. Esta parcela tiene la forma de las huellas superpuestas, según el canal cuatro de fluorescencias utiliza para detectar los diferentes fluoróforos, y donde cada traza se compone de los picos correspondientes a los productos de ADNc o secuenciación individuales. Datos electroferograma se exporta desde el analizador genético como un archivo de texto delimitado por tabuladores y se importan en la transformación ShapeFinder y software de análisis 18. ShapeFinder se utiliza inicialmente para llevar a cabo una serie de transformaciones matemáticas en los datos para asegurar que los tiempos de migración y volúmenes pico reflejan con precisión las identidades y cantidades de los productos de reacción, respectivamente. Los picos son entonces alineados e integrados, y los resultados se tabulan junto con la secuencia de ARN primario. Un &quot;perfil de reactividad&quot; para el segmento pertinente de ARN se obtiene restando los valores de control a partir de la (+) valores asociados con cada ARN de nucleótidos, y la normalización de los datos tal como se describe a continuación. Este perfil se importa en RNAstructure (v5.3) Software de 19,20, lo que convierte la val reactividad normalizadaUES en limitaciones pseudo-energía que se incorporan en el algoritmo de plegado estructura secundaria del ARN. La combinación química de sondeo y plegado algoritmos de esta manera mejora significativamente la exactitud de la predicción de la estructura en comparación con cualquiera de los métodos solos 12,21. La salida de RNAstructure (v5.3) incluye imágenes de la energía más baja ARN estructuras secundarias con código de colores con el perfil FORMA reactividad (s), así como las mismas estructuras en Pruebas notación de punto-soporte. Este último puede posteriormente ser exportado al software dedicado a la representación gráfica de la estructura secundaria del ARN tales como Varna PseudoViewer 22 y 23. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4.8in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig1.jpg" /> Figura 1. Organigrama de la estructura de la determinación de ARN a través de SHAPE 4,10. (A) RNA may se obtiene a partir de muestras biológicas o por transcripción in vitro. (B) Dependiendo de la fuente, el ARN se pliega o se procesa y se modificó con el reactivo FORMA lo contrario. (C) La transcripción inversa usando cebadores marcados radiactivamente o fluorescentemente. (D) son productos de ADNc fraccionado ya sea a través de electroforesis capilar a base de gel o de poca altura. (E) Análisis de fragmentos. (F) la predicción de estructura de ARN. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50243/50243fig1large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura.</a> <img alt="La figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig2.jpg" /> Figura 2. El carácter de alto rendimiento de FORMA basados ​​en CE permite el análisis rápido de múltiples ARN, y / o múltiples segmentos de los mismos ARN. (A) </strong&gt; Representa cómo una RNA puede ser dividido en secciones 300-600 nt (código de color en verde, azul y rojo) (B) Las secciones del ARN se probaron de forma independiente utilizando diferentes conjuntos de cebadores fluorescentes (flechas negras) (C) juegos de reacciones se combinaron y se cargaron en los pocillos A1, B1, C1, etc, respectivamente, proporcionando una cobertura completa para el ~ 3 kb ARN1. Productos de reacción de RNAs 2, 3, 4, etc pueden prepararse de forma similar para el fraccionamiento de carreras electroforéticas consecutivos. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50243/50243fig2large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura.</a>

<table><tbody><tr><td colspan="4"><REACTIVOS fuertes></anhídrido ></td></tr><tr><td>N-metilisatoico fuerte (NMIA)</td><td>Life technologies</td><td>M25</td><td>Disolver en</td></tr><tr><td>anhídrido DMSO 1-metil-t-nitroisatoico anhidro (1M7)</td><td>ver ref. 22</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superíndice III Transcriptasa inversa</td> Life <td>technologies</td><td>18080044</td><td>10.000 unidades</td></tr><tr><td>Kit de secuenciación de ciclo termosecuenciasa</td><td>Affymetrix</td><td>78500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materiales proporcionados por el usuario</ARN></td></tr><tr><td>fuerte de interés</td><td></td><td></td><td>6 pmol por reacción (el límite de detección será determinado por el instrumento)</td></tr><tr><td>Sets de cuatro cebadores marcados de 5' (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 y WellRed D1/Licor IR800)</td><td></td><td></td><td>Los cebadores son complementarios al ARN y se utilizan en reacciones de transcripción inversa y secuenciación. Los fluoróforos enumerados son óptimos para el Beckman Coulter 8000 CEQ. Los cebadores se pueden comprar o sintetizar en casa.</td></tr><tr><td>El ADN molde</td><td></td><td></td> se <td>utiliza para secuenciar las reacciones y debe contener la secuencia del ARN que se está estudiando, incluida cualquier extensión 3'terminal, si está presente. Cuando corresponda, a menudo es conveniente utilizar la plantilla de transcripción de ARN.</td></tr><tr><td colspan="4"><tampones fuertes>tampones</fuertes></td></tr><tr><td>10x tampón</td><td></td><td></td> de renaturalización de ARN <td>100 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 M KCl, 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>5X tampón</td><td></td><td></td> de plegamiento de ARN <td>200 mM Tris-HCl pH 8,0, 25 mM MgCl><2, 2,5 mM EDTA, 650 mM KCl. (Este tampón puede modificarse según el caso (p. ej. pH, EDTA, Mg, inhibidor de RNasa)</td></tr><tr><td>2.5X RT mix</td><td></td><td></td><td>4 &mu; l Tampón 5X, 1 &mu; l 100 mM TDT, 1,5 y mu; l agua,1 &mu; l 10 mM dNTPs, 0.5 &mu; l SuperScript III. Tenga en cuenta que el búfer 5X y el TDT de 100 mM se proporcionan con la compra de SuperScript III (Invitrogen).</td></tr><tr><td>Solución de carga de muestras de GenomeLab (Beckman Coulter)</td><td></td><td></td><td>Atención:</fuerte> Evite múltiples ciclos</td></tr><tr> de congelación-descongelación<td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Electroforesis capilar</td><td>Beckman</td><td>CEQ8000</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>varía</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

arn de predicción de estructura secundaria utilizando shape de alto rendimiento

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Comprender la función del ARN que participan en los procesos biológicos exige un conocimiento profundo de la estructura del ARN. Con este fin, la metodología denominada &quot;acilación hidroxilo de alto rendimiento 2 selectivo &#39;analizado mediante extensión de cebador&quot;, o forma, permite la predicción de la estructura secundaria de ARN con una sola resolución de nucleótidos. Este enfoque utiliza agentes químicos de sondeo que preferentemente acilato de regiones de cadena sencilla o flexible de ARN en solución acuosa. Sitios de modificación química se detectan mediante transcripción inversa del ARN modificado, y los productos de esta reacción son fraccionados por electroforesis capilar automatizado (CE). Dado que la transcriptasa inversa se detiene en esos nucleótidos de ARN modificados por los reactivos de la forma, la biblioteca de cDNA resultante asigna indirectamente estos ribonucleótidos que son de cadena sencilla en el contexto de los ARN plegadas. El uso de software ShapeFinder, los producidos por electroferogramas automatizado CE son procesados ​​y convertidos en nutablas de reactividad cleotide que se convierten ellos mismos en las limitaciones del pseudo-energía utilizadas en el RNAStructure (v5.3) algoritmo de predicción. Las estructuras de ARN de dos dimensiones obtenidos por combinación de una forma sondeo con ARN in silico de predicción de estructura secundaria se han encontrado para ser mucho más precisa que la estructuras obtenidas usando cualquier método solo.

ARN que contiene el VIH-1 elemento de respuesta rev (RRE) y un 3 &#39;casete estructura de la terminal 4 se preparó a partir de un plásmido linealizado por la transcripción in vitro, después de lo cual se pliega por calentamiento, enfriamiento, y la incubación a 37 ° C en la presencia de MgCl 2. ARN fue expuesto a NMIA y luego a transcripción inversa a partir de un cebador de ADN 5&#39;-marcado en el extremo hibridó con el casete de estructura de la terminal 3 &#39;. La forma bibl...

De alto rendimiento selectiva 2 &#39;acilación hidroxilo analizados por extensión del cebador (FORMA) utiliza un software de predicción de estructura secundaria de producto químico nuevo sondeo de la tecnología, la transcripción inversa, electroforesis capilar y para determinar las estructuras de ARN de varios cientos a varios miles de nucleótidos en una sola resolución de nucleótidos.

ARN de predicción de estructura secundaria Utilizando SHAPE de alto rendimiento

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

El objetivo general de este procedimiento es la predicción de la estructura secundaria del ARN con resolución de un solo nucleótido. Esto se logra primero mediante la modificación química del ARN plegado con un reactivo electrofílico que aísla regiones de cadena sencilla o flexibles del ARN. El segundo paso consiste en utilizar la transcripción inversa para detectar los sitios del ARN que han sido modificados químicamente.A continuación, los productos de ADN de la transcripción inversa se fraccionan mediante electroforesis capilar. El paso final es el procesamiento y la normalización de los datos. Finalmente, se utiliza un software de estructura de ARN para predecir la estructura secundaria del ARN empleando las restricciones de energía libre pseudo derivadas del análisis de forma.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología molecular, como cómo la estructura del ARN rige las funciones de los ARN catalíticos y no codificantes, y cómo los genomas de ARN virales regulan la multifuncionalidad de sus genomas. Las implicaciones de esta técnica se extienden al diagnóstico y tratamiento de enfermedades virales o del cáncer, ya que obtener información sob

rna-secondary-structure-prediction-using-high-throughput-shape

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Directrices para el ordenador basado en la caracterización estructural y funcional de la proteína mediante la canalización I-TASSER se describe. A partir de secuencias de proteínas de la consulta, los modelos 3D se generan con múltiples alineaciones threading e iterativo simulaciones estructurales de montaje. Inferencias funcionales a partir de entonces son elaborados sobre la base de los partidos a las proteínas de estructura conocida y funciones.

Un protocolo para la estructura de la proteína por computadora y la función de predicción

La base de datos ITS2 es un banco de trabajo para la secuencia de inferencia filogenética y al mismo tiempo teniendo en cuenta la estructura secundaria del espaciador transcrito interno 2. Esto incluye la recopilación de datos con la anotación precisa, predicción de estructura, la alineación de secuencias múltiples de estructura y cálculo árbol de rápido. En pocas palabras, esta mesa de trabajo simplifica primeros análisis filogenéticos para unos pocos clics.

La base de datos ITS2

El paquete de software 3DNA es un popular y versátil herramienta bioinformática con capacidades para analizar, construir y visualizar estructuras de ácidos nucleicos tridimensionales. En este artículo se presenta protocolos detallados para un subconjunto de nuevas y populares características disponibles en 3DNA, aplicables tanto a las estructuras individuales y conjuntos de estructuras relacionadas.

Análisis y construcción de estructuras de ácidos nucleicos con 3DNA

Desarrollamos métodos computacionales de diseño de proteínas de novo capaces de abordar varias áreas importantes del diseño de proteínas. Para difundir estos métodos presentamos Protein WISDOM, una herramienta en línea para el diseño de proteínas (http://www.proteinwisdom.org). A partir de un molde estructural, se puede realizar el diseño de proteínas monoméricas para aumentar la estabilidad y complejos para aumentar la afinidad de unión.

SABIDURÍA Proteína: Un banco de trabajo para<em&gt; En silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Diseño de biomoléculas

En este trabajo se describe la formación de estructuras a base de péptidos altamente ordenadas por el proceso espontáneo de auto-ensamblaje. El método utiliza péptidos disponibles comercialmente y equipo de laboratorio común. Esta técnica se puede aplicar a una gran variedad de péptidos y puede conducir al descubrimiento de nuevos conjuntos basados ​​en péptidos.

Formación de estructuras biomoleculares ordenada por el auto-ensamblaje de péptidos cortos

mosaico de ADN es un enfoque eficaz para crear nanoestructuras programables. Describimos los protocolos para construir formas bidimensionales complejas mediante el autoensamblaje de mosaicos de ADN monocatenario.

Autoensamblaje de formas bidimensionales complejas de una sola hebra de ADN Azulejos

Describimos un marco que incorpora análisis bioquímicos y computacionales sencillos para guiar la caracterización y cristalización de grandes dominios de bobinas enrolladas. Este marco puede adaptarse para proteínas globulares o ampliarse para incorporar una variedad de técnicas de alto rendimiento.

Combinando húmedo y Técnicas de laboratorio de simulación para guiar la cristalización de proteínas grandes que contengan espiral de la bobina

Estructuras de conjuntos supramoleculares proteína a resolución atómica son de alta relevancia debido a su papel crucial en una variedad de fenómenos biológicos. Adjunto, presentamos un protocolo para llevar a cabo estudios estructurales de alta resolución en asambleas de proteína macromolecular insoluble y no-cristalino magic-angle spinning estado sólido de resonancia magnética nuclear espectroscopia (MAS SSNMR).

Estudios estructurales de escala atómica de asambleas macromoleculares por espectroscopia de estado sólido de resonancia magnética Nuclear

Protocolos detallados para ambos acilación in vitro y en células selectivo 2'-hidroxilo por experimentos de extensión (forma) de cartilla para determinar la estructura secundaria de las secuencias de interés en presencia de una pequeña molécula de RNA-dirigido a pre-mRNA son presentados en este artículo.

Uso en Vitro y en las células la forma para investigar la molécula pequeña inducida por cambios estructurales Pre-mRNA

El protocolo proporciona instrucciones para modificar el ARN con sulfato de dimetilo para experimentos de perfiles mutacionales. Incluye sondeo in vitro e in vivo con dos métodos alternativos de preparación de bibliotecas.

Sondeo de la estructura del ARN con perfil mutacional de sulfato de dimetilo con secuenciación in vitro y en células

El diseño de proteínas implica la construcción de secuencias de aminoácidos y la incorporación de motivos específicos para crear variantes funcionales. Este enfoque es fundamental para el desarrollo de péptidos antimicrobianos (AMP) para combatir los patógenos resistentes a los antibióticos. En este artículo se presenta un procedimiento para la construcción de proteínas utilizando diversas herramientas bioinformáticas.

Aplicación de I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, servidor HADDOCK y HEX loria para el diseño de proteínas De Novo e In Silico

Aprende a predecir la estructura secundaria del ARN con resolución de nucleótido único utilizando la tecnología SHAPE de alto rendimiento. Este método combina modificación química, transcripción inversa y electroforesis capilar para analizar secuencias de ARN de cientos a miles de nucleótidos.

ARN de predicción de estructura secundaria Utilizando SHAPE de alto rendimiento

Explorar más videos