ARN de predicción de estructura secundaria Utilizando SHAPE de alto rendimiento

El objetivo general de este procedimiento es la predicción de la estructura secundaria del ARN con resolución de un solo nucleótido. Esto se logra modificando primero químicamente el ARN plegado con un reactivo electrofílico que S aísla regiones monocatenarias o flexibles del ARN. El segundo paso es utilizar la transcripción inversa para detectar sitios del ARN que han sido modificados químicamente.

A continuación, los productos de CD NA de la transcripción inversa se fraccionan mediante electroforesis capilar. El paso final es el procesamiento y la normalización de los datos. En última instancia, el software de estructura de ARN se utiliza para predecir la estructura secundaria del ARN utilizando las restricciones de pseudo energía libre derivadas del análisis de forma.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología molecular, como cómo la estructura del ARN gobierna las funciones de los ARN catalíticos y no actuales, y cómo los genomas de ARN viral regulan la multifuncionalidad de sus genomas. Las implicaciones de esta técnica se extienden a nuestra terapia y diagnóstico de enfermedades virales o cáncer, ya que obtener información sobre la estructura secundaria del ARN podría ayudar al diseño de fármacos basados en la estructura. Aunque este método proporciona información sobre la estructura de los ARN producidos por transcripción in vitro, también se puede aplicar in vivo, ya que los reactivos de forma son permeables a las células.

Antes de comenzar este procedimiento, prepare el ARN mediante transcripción in vitro. Usar un kit de transcripción comercial. Los ARN deben almacenarse en un tampón TE entre menos 20 y menos 80 grados Celsius en un tubo de microcentrífuga de 0,5 microlitros.

Diluya 12 picos moles de ARN a 18 microlitros con agua y agregue dos microlitros de mezcla tampón de 10 x re naturación golpeando el tubo, seguido con un breve centrifugado caliente la mezcla en el tubo a 85 grados Celsius durante un minuto, luego enfríe a cuatro grados Celsius a una velocidad de 0,1 grados Celsius por segundo. Agregue 100 microlitros de agua y 30 microlitros de tampón plegable cinco veces al tubo de microcentrífuga. Después de esto, incube el contenido del tubo a 37 grados centígrados durante 30 a 60 minutos, dependiendo del ARN que se esté plegando.

En general, el plegamiento dependiente del magnesio de ARN más largos y estructurados requiere tiempos de incubación más largos Transfiera una alícuota de 72 microlitros a cada uno de los dos tubos de microcentrífuga de 0,5 mililitros, que deben etiquetarse como modificados y control respectivamente. El siguiente paso es añadir ocho microlitros de dimetilsulfóxido anhidro a la mezcla de control y reservar. A continuación, añada ocho microlitros de 10 x y MIA a la mezcla modificada.

Incubar la mezcla modificada y de control a 37 grados centígrados durante 50 minutos. Agregue ocho microlitros de tres acetato de sodio, pH 5.28, microlitros de EDTA de 100 milimolares, 240 microlitros de etanol frío y un microlitro de 10 miligramos por mililitro. El glucógeno al tubo mezclado modificado para precipitar el ARN modificado refrigera el contenido del tubo durante dos horas a menos 20 grados centígrados y luego centrifuga a 14.000 g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.

A continuación, lave el pellet dos veces con centrifugación fría de etanol al 70% durante cinco minutos. Después de cada lavado, retire el sobrenadante con la micropipeta y seque al aire el pellet durante cinco minutos. A temperatura ambiente, prepare las muestras modificadas y de control para la transcripción inversa en tubos de microcentrífuga de 0,5 mililitros.

Para la reacción modificada, mezcle cinco microlitros de ARN modificado, seis microlitros de agua y un microlitro de una solución de cebador marcada con 10 micromolares sci five. Para la reacción de control, mezcle cinco microlitros de ARN de control, seis microlitros de agua y un microlitro de una solución de cebador marcada con sci 5.5 de 10 micromolares. Coloque los tubos en un termociclador y arrodille el cebador frente al ARN.

Durante arrodillarse, prepare 2.5 x RT mezcla. Para cada reacción RT, mezcle bien e incube a 37 grados centígrados durante cinco minutos antes de agregar a las reacciones de rodillas. Una vez que la temperatura de las reacciones de arrodillamiento alcance los 50 grados centígrados, agregue ocho microlitros de 2.5 XRT.

Mezclar e incubar durante 50 minutos a 50 grados centígrados. A continuación, hidrolizó el ARN añadiendo un microlitro de hidróxido de sodio de cuatro molares y calentándolo a 90 grados centígrados durante tres minutos. Enfriar las reacciones en hielo y luego neutralizarlas agregando dos microlitros de ácido clorhídrico de dos molares.

Ahora combine las reacciones modificadas y de control y agregue 0,1 de volumen o una décima parte del volumen total de reacción de tres molares de acetato de sodio y 100 milimolares de EDTA, 1,5 de volumen de etanol frío y un microlitro de 10 miligramos por mililitro. Glucógeno. Esto da como resultado que el CDNA se precipite fuera de la solución. Refrigere la solución durante dos horas, luego centrifugue a 14.000 G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.

Lave el pellet dos veces con resuspensión fría, 70% de etanol, el CD NA granulado en 40 microlitros de forma desionizada amida calentando a 65 grados Celsius durante 10 minutos, seguido de un vórtice vigoroso durante al menos 30 minutos para la preparación de la reacción de secuenciación en una mezcla de tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros 40 microlitros de la mezcla de terminación DDA. Cinco moles PICA de la plantilla de ADN, 4.6 microlitros de 10 x tampón de marse y 10 microlitros de imprimación D dos marcadas con buena lectura. A esta mezcla, agregue 4,6 microlitros de QUIN A y diluya con agua para llevar el volumen total a 82 microlitros.

Prepare una segunda reacción de secuenciación de la misma manera utilizando DDT y cebador marcado con lycor IR 800 en su lugar. A continuación, proceda a la amplificación por PCR utilizando las condiciones recomendadas por USB. Agregue 16 microlitros de acetato de sodio de tres molares pH 5.2, 16 microlitros de EDTA de 100 milimolares, un microlitro de 10 miligramos por mililitro de glucógeno y 480 microlitros de etanol al 95% para precipitar el ADN, luego incube a cuatro grados centígrados durante 30 minutos y centrifugue a 14, 000 G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.

Vuelva a suspender el CD NA granulado en 100 microlitros de amida en forma desionizada calentando a 65 grados centígrados durante 10 minutos, seguido de un vórtice vigoroso durante al menos 30 minutos. A continuación, mezcle 40 microlitros de las muestras de forma agrupada con 10 microlitros de las escaleras de secuenciación agrupadas y pipetee el volumen total de la muestra en placas de muestra de 96 pocillos, programe y prepare el instrumento de electroforesis capilar e inicie una ejecución según las instrucciones del fabricante. Las cuatro trazas codificadas por colores superpuestas se producen por la migración de los cuatro conjuntos de productos de reacción a través del capilar de la siguiente manera, la traza azul muestra productos de transcripción inversa generados a partir de la transcripción inversa de ARN modificados con NMIA.

El rastro verde muestra productos de transcripción inversa a partir de ARN plegados pero no modificados. El trazo negro muestra la escalera de secuenciación D-N-A-D-D-G y el trazo rojo muestra la escalera de secuenciación DDT. Las trazas de electroforesis capilar en bruto se separan, procesan, alinean e integran mediante el software de búsqueda de formas.

El análisis de datos comienza importando los electroferogramas del sistema de electroforesis capilar al buscador de formas. La ventana de vista de datos central proporciona información gráfica sobre cada paso de procesamiento de datos. La ventana del inspector de herramientas situada en la parte inferior izquierda de la pantalla muestra los parámetros de las herramientas seleccionadas en el inspector de secuencias de comandos.

El inspector de secuencias de comandos en la parte superior de la pantalla muestra las herramientas que se han aplicado a los datos, ajusta los electroferogramas para corregir el fondo fluorescente, la superposición espectral entre canales fluorescentes, los cambios de movilidad, impartidos por cebadores etiquetados de manera diferente, la decaimiento de la señal resultante de la terminación prematura de la transcripción inversa y las diferencias en la intensidad de fluorescencia de productos comunes marcados con diferentes fluoróforos en la herramienta de alineación e integración de buscadores de formas. Utilice la función de configuración para asignar automáticamente identidades a picos individuales y correlacionar esta información con la secuencia de ARN definida por la entrada del usuario y las dos escaleras de secuenciación para incorporar los perfiles de reactividad de nucleótidos en el algoritmo de estructura secundaria utilizado por el software de estructura de ARN 5.3 o para comparar perfiles de ARN estrechamente relacionados. Normalice los datos de forma de forma estandarizada.

Para ello, excluya los valores atípicos de los cálculos posteriores. Determine la reactividad máxima efectiva y normalice dividiendo todos los valores de reactividad por el máximo efectivo. El software de estructura de ARN se utiliza para predecir estructuras secundarias de ARN apoyadas experimentalmente utilizando las restricciones de energía pseudo libre del análisis de forma.

El software proporciona representaciones gráficas de la energía más baja a las estructuras de DRNA, así como una representación textual de estas estructuras. En la notación de corchetes, la secuencia y la anotación entre corchetes deben importarse en el visor de estructuras de ARN, aquí se muestra la estructura 2D del bucle de tallo del elemento de respuesta al VIH rev dos regiones generadas en la estructura de ARN 5.3 utilizando los perfiles de reactividad derivados de la forma y visualizados utilizando un applet ligero de Java. Los nucleótidos de color azul tienen una baja reactividad, mientras que los nucleótidos de color rojo tienen una mayor reactividad Una vez dominada, la técnica se puede realizar en dos días si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el modelo de ARN resultante debe interpretarse cuidadosamente antes de llegar a conclusiones finales sobre la estructura secundaria del ARN después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como el uso de sondeo de radicales hidroxi a través de métodos de escisión espacial, con el fin de dilucidar interacciones terciarias complejas y, finalmente, permitir a los investigadores determinar las estructuras de estos ARN en tres dimensiones.