Ratón de corto y largo plazo la actividad locomotriz analizados por el software de seguimiento de vídeo

El objetivo general del siguiente experimento es detectar diferencias en la actividad locomotora a corto y/o largo plazo entre diferentes grupos de ratones tratados experimentalmente. Esto se logra grabando en video la actividad de la jaula doméstica del ratón en tiempo real. Como segundo paso, se analiza la actividad locomotora del animal en tiempo real o a partir de una grabación mediante un software de seguimiento de vídeo.

A continuación, los parámetros locomotores puntuados se importan a un software secundario para su análisis estadístico. Por lo tanto, el procedimiento puede dilucidar los efectos de los tratamientos o las condiciones sobre la actividad locomotora a corto y largo plazo en función de parámetros evaluados como la distancia recorrida, la velocidad del movimiento y la duración del movimiento. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el cruce de líneas y la implantación de emisores, es que proporciona un examen más exhaustivo de la actividad locomotora del ratón sin la necesidad de un procedimiento quirúrgico invasivo y potencialmente confuso.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque configurar las jaulas y el equipo de una manera que permita una calidad de imagen óptima para el seguimiento de video posterior puede ser tedioso y llevar tiempo aprender. La actividad locomotora a corto plazo se prueba en las jaulas domésticas de ratones aislados con ropa de cama que tiene un alto contraste con el color del código del animal. Antes del experimento, los animales deben aclimatarse a su cama durante al menos 24 horas.

Para preparar la sala de pruebas, comience por montar una cámara de video con capacidad de visión nocturna con al menos 120 gigabytes de memoria sobre el área de grabación. La habitación no debe tener ningún sonido ambiental superior a 70 decibelios. Si el ruido de fondo intermitente es inevitable, use un generador de ruido blanco para ahogar esos ruidos.

También es importante que las condiciones ambientales de la sala de pruebas sean similares a las condiciones normales de alojamiento del animal. Antes de configurar nuevos sujetos, limpie el área de grabación, luego cubra la superficie con papel de carnicero o de banco de laboratorio de color similar a la ropa de cama de la jaula Siguiente posición, divisores de jaula opacos hechos de plástico de media pulgada. En la superficie de prueba, los divisores deben tener un color similar al de la ropa de cama y estar limpios.

Ahora lleve los ratones al área de prueba y coloque sus jaulas entre los divisores. Para facilitar el análisis, coloque siempre las jaulas de la misma manera. Para la prueba, cubra las jaulas con plexiglás transparente de un cuarto de pulgada de grosor.

El plexiglás necesita al menos 11 orificios de un cuarto de pulgada para proporcionar una ventilación adecuada. A continuación, configure las luces de la abrazadera de la incubadora con bombillas rojas para iluminar las jaulas. Ahora centre la vista de la cámara en las jaulas de prueba y no exceda la capacidad del sistema de seguimiento de video.

Este sistema se limita a rastrear ocho ratones en tiempo real. Ahora, al ver la pantalla de la cámara de video, ajuste el ángulo y la posición de las luces para eliminar el deslumbramiento o los reflejos de la parte superior de la jaula de plexiglás. Obtener una vista limpia de los ratones, libre de cualquier artefacto visual, es el paso más crítico para obtener buenos resultados.

Incluya siempre sujetos experimentales y de control en cada grupo para asegurarse de que se minimicen los efectos potenciales de las diferencias temporales en la LMA. Justo antes de la prueba, retire cualquier material de anidación y enriquecimiento de las jaulas, ya que pueden obstruir la vista del ratón. En el video, comience la grabación con una pizarra que identifique la información experimental relevante.

Para garantizar la identificación adecuada del video, use el temporizador en la pantalla de la cámara para rastrear la duración de la prueba y manténgase fuera de la línea de visión del animal. Durante el tiempo de grabación. Cuando termine la prueba, devuelva todos los materiales a cada jaula.

Si los animales van a ser examinados de nuevo, devuélvanles el acceso a la comida y al agua entre las pruebas. Almacene las grabaciones de vídeo de la sesión de prueba en un medio de archivo compatible con el sistema de seguimiento de vídeo, como una unidad de disco duro En el sistema de seguimiento de vídeo, analice los vídeos en tiempo real. Inicialmente, elija todo el piso de la jaula como la región de interés o el retorno de la inversión para el seguimiento.

Para análisis avanzados, como la evaluación de los impuestos de Figma, cree múltiples ROI dentro de la jaula para estudios de alto rendimiento. Analice todas las jaulas dentro del video simultáneamente con los ROI individuales de todos los pisos de jaulas. Configure el VTS para calcular la distancia total, movió la velocidad de los movimientos y la duración de los movimientos después de realizar los cálculos, exporte los datos a un archivo de hoja de cálculo para su almacenamiento y análisis adicional.

Las pruebas a largo plazo se ejecutan igual que las pruebas a corto plazo. Sin embargo, requiere una jaula modificada con un nuevo punto de acceso para comida y agua. Primero, corte un agujero de 5,5 centímetros de diámetro en la pared del extremo corto de una jaula estándar.

A continuación, corte las aberturas de media pulgada en una malla de acero galvanizado de un cuarto de pulgada y puña la malla para eliminar los bordes afilados con la misma malla, construya una tolva externa para pellets de alimentos que pueda conectarse a la malla sobre la abertura. A continuación, agregue agujeros para remaches. Luego cubra el orificio en la jaula con la malla y la tolva adjunta con remaches de aluminio y arandelas de acero inoxidable.

Para proporcionar hidratación, construya una botella de agua con una cónica estándar de 50 mililitros y un tapón de goma de un orificio que esté sobreperforado. Para permitir la inserción de un tubo sorbedor sin goteo. Asegura esta botella de agua a la jaula.

Con cinta de velcro, el tubo sorbedor debe insertarse a través de la abertura cubierta de malla. Ahora, mientras la jaula está cubierta por la tapa de plexiglás, los ratones conservan el acceso a la comida y al agua siguiendo los mismos procedimientos descritos para el ensayo locomotor a corto plazo. El ensayo a largo plazo suele durar 12 horas o durante la duración de la fase actual del ciclo de luz y oscuridad.

Las pruebas de actividad locomotora a largo plazo generalmente se analizan en tiempo real sin hacer una grabación de video. Sin embargo, una grabación se puede realizar utilizando una cámara secundaria o mediante una grabadora de DVD vinculada a la cámara principal. Los ratones se pueden probar siempre que las capacidades del sistema de seguimiento de video lo permitan, y al igual que con las pruebas a corto plazo, solo se retira de la jaula el material de enriquecimiento iluminado por el nido, no la mazorca de maíz o el lecho de aserrín.

En el VTS, configure el sistema de seguimiento de video para el análisis en tiempo real. Establezca el ROI de seguimiento para que abarque todo el piso de cada jaula que se esté registrando. Al igual que con el ensayo a corto plazo, configure el sistema para calcular la distancia total, la velocidad del movimiento y la duración del movimiento.

Luego, después del análisis, exporte los datos a una hoja de cálculo para almacenarlos y analizarlos utilizando ensayos locomotores repetidos a corto plazo. Se encontró que después de la inyección de lipopolisacárido, los ratones alojados en jaulas con ventilación individual o IVC se recuperaron de la pérdida de LMA a corto plazo de la inyección más rápidamente que los ratones alojados en jaulas ambientales o una CE. Si bien la pérdida inicial de la actividad locomotora es similar entre los grupos inyectados con LPS, la recuperación de la actividad locomotora basal es más rápida. En IVC se alojaban ratones, al igual que la velocidad de los movimientos y la duración de los mismos.

En este análisis, la detección de dos centímetros por segundo de movimiento inició el seguimiento y 1,75 centímetros por segundo detuvo el seguimiento utilizando las variables de detección. Se realizó una pequeña prueba de locomoción durante dos ciclos de actividad consecutivos de 12 horas. En ratones normales, no se encontraron diferencias significativas en la distancia recorrida ni en la velocidad de los movimientos ni en la duración de los movimientos.

En caso de que la tendencia a no haber diferencias mensurables, se repita con un tamaño de muestra grande, los datos sugerirían que el ensayo podría usarse para reemplazar los transmisores implantados utilizados para los ensayos locomotores a largo plazo. Al intentar este procedimiento, es importante tener especialmente en cuenta las condiciones de vivienda pre-ex experimentales. Todos los animales de experimentación y control deben estar en condiciones ambientales similares, especialmente con respecto al ciclo de luz, la temperatura ambiente y la humedad relativa.

Además, su exposición a estímulos de ruido y olor debe minimizarse siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como la prueba de los cuatro nados, se pueden usar para responder preguntas adicionales, como si el tratamiento de un experimento en particular da como resultado un comportamiento depresivo sin afectar la actividad locomotora general.