Ratón de corto y largo plazo la actividad locomotriz analizados por el software de seguimiento de vídeo

El objetivo general del siguiente experimento es detectar diferencias en la actividad locomotora a corto y/o largo plazo entre diferentes grupos de ratones tratados experimentalmente. Esto se logra mediante la grabación en video de la actividad en la jaula domicilio de los ratones en tiempo real. Como segundo paso, la actividad locomotora del animal se analiza en tiempo real o a partir de una grabación utilizando software de seguimiento de video.

A continuación, los parámetros locomotores puntuados se importan en un software secundario para el análisis estadístico. Por lo tanto, el procedimiento puede esclarecer los efectos de tratamientos o condiciones sobre la actividad locomotora a corto y largo plazo, basándose en parámetros evaluados como la distancia recorrida, la velocidad de movimiento y la duración del movimiento. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como el cruce de líneas y la implantación de emisores, es que permite un examen más exhaustivo de la actividad locomotora del ratón sin necesidad de un procedimiento quirúrgico invasivo y potencialmente confundente.

Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque configurar jaulas y equipos de manera que permita una calidad óptima de imagen para el seguimiento por video posterior puede ser tedioso y requiere tiempo para aprenderlo. La actividad locomotora a corto plazo se evalúa en las jaulas de alojamiento de ratones aislados, con material de enriquecimiento que contraste fuertemente con el color del código del animal. Antes del experimento, los animales deben aclimatarse al material de enriquecimiento durante al menos 24 horas.

Para preparar la sala de pruebas, comience montando una cámara de video con capacidad de visión nocturna y al menos 120 gigabytes de memoria por encima del área de grabación. La sala no debe tener ningún sonido ambiental superior a 70 decibeles. Si el ruido de fondo intermitente es inevitable, utilice un generador de ruido blanco para enmascarar esos sonidos.

También es importante que las condiciones ambientales de la sala de pruebas sean similares a las condiciones normales de alojamiento del animal. Antes de preparar nuevos sujetos, limpie el área de grabación y luego cubra la superficie con papel de carnicero o papel para banco de laboratorio de un color similar al del lecho del terrario. A continuación, coloque divisores opacos para terrarios hechos de plástico de media pulgada. En la superficie de prueba, los divisores deben tener un color similar al del lecho y estar limpios.

Ahora lleve los ratones al área de pruebas y coloque sus jaulas entre los divisores. Para facilitar el análisis, coloque siempre las jaulas de la misma manera. Para la prueba, cubra las jaulas con plexiglás transparente de un cuarto de pulgada de espesor.

El plexiglás necesita al menos 11 orificios de un cuarto de pulgada para proporcionar una ventilación adecuada. A continuación, configure luces de brooder con abrazaderas y bombillas rojas para iluminar las jaulas. Ahora centre la vista de la cámara en las jaulas de prueba sin exceder la capacidad del sistema de seguimiento de video.

Este sistema está limitado para rastrear ocho ratones en tiempo real. Ahora, al observar la pantalla de la cámara de video, ajuste el ángulo y la posición de las luces para eliminar reflejos o destellos provenientes de las tapas de plexiglás de las jaulas. Obtener una vista limpia de los ratones, libre de cualquier artefacto visual, es el paso más crítico para obtener buenos resultados.

Siempre incluya sujetos experimentales y de control en cada grupo para asegurar que se minimicen los posibles efectos de las diferencias temporales en la LMA. Justo antes de la prueba, retire cualquier material de anidación y enriquecimiento de las jaulas, ya que podrían obstruir la vista del ratón. En el video, comience la grabación con una pizarra que identifique la información experimental pertinente.

Para asegurar la correcta identificación del video, utilice el temporizador en la pantalla de la cámara para registrar la duración de la prueba y manténgase fuera del campo visual del animal durante el tiempo de grabación. Cuando la prueba haya finalizado, devuelva todos los materiales a cada jaula.

Si los animales deben volver a ser evaluados, restablezca su acceso a alimento y agua entre las pruebas. Almacene las grabaciones de video de la sesión de pruebas en un soporte de archivo compatible con el sistema de seguimiento de video, como un disco duro. En el sistema de seguimiento de video, analice los videos en tiempo real. Inicialmente, seleccione toda la superficie del piso de la jaula como la región de interés o ROI para el seguimiento.

Para análisis avanzados, como la evaluación de impuestos Figma, cree múltiples ROI intra-jaula para estudios de alto rendimiento. Analice todas las jaulas dentro del video simultáneamente con ROI individuales para el piso de cada jaula. Configure el VTS para calcular la distancia total recorrida, la velocidad de los movimientos y la duración de los movimientos; tras realizar los cálculos, exporte los datos a un archivo de hoja de cálculo para su almacenamiento y análisis adicional.

La prueba a largo plazo se realiza de la misma manera que la prueba a corto plazo. Sin embargo, requiere una jaula modificada con un nuevo punto de acceso para alimento y agua. En primer lugar, corte un orificio de 5,5 centímetros de diámetro en la pared lateral corta de una jaula estándar.

A continuación, corte aberturas de media pulgada en una malla de acero galvanizado de un cuarto de pulgada y alise la malla para eliminar los bordes afilados utilizando la misma malla; construya un embudo externo para las perlas de alimento que pueda conectarse a la malla sobre la abertura. A continuación, agregue orificios para remaches. Luego, cubra el orificio en la jaula con la malla y el embudo adjunto utilizando remaches de aluminio y arandelas de acero inoxidable.

Para proporcionar hidratación, construya una botella de agua a partir de un tubo cónico estándar de 50 mililitros y un tapón de goma de un orificio que haya sido agrandado mediante perforación. Para permitir la inserción de un tubo bebedero sin goteo. Sujete esta botella de agua a la jaula.

Utilizando cinta de velcro, el tubo dispensador debe insertarse a través de la abertura cubierta con malla. Ahora, mientras la jaula está cubierta con la tapa de plexiglás, los ratones mantienen acceso a alimento y agua siguiendo los mismos procedimientos descritos para el ensayo de locomoción a corto plazo. El ensayo a largo plazo suele durar 12 horas o el tiempo total de la fase actual del ciclo luz-oscuridad.

La prueba de actividad locomotora a largo plazo generalmente se analiza en tiempo real sin realizar una grabación en video. Sin embargo, se puede realizar una grabación utilizando una cámara secundaria o mediante un grabador de DVD conectado a la cámara principal. Los ratones pueden evaluarse durante el tiempo que el sistema de seguimiento de video sea capaz de manejar, y al igual que en las pruebas a corto plazo, solo se retira del jaulón el material de enriquecimiento iluminado, no el relleno de mazorca de maíz o aserrín.

En el VTS, configure el sistema de rastreo de video para el análisis en tiempo real. Establezca la ROI de rastreo para que abarque todo el piso de cada jaula que se esté grabando. Como en el ensayo a corto plazo, configure el sistema para que calcule la distancia total recorrida, la velocidad de movimiento y la duración del movimiento.

Luego de realizar el análisis, exporte los datos a una hoja de cálculo para su almacenamiento y análisis mediante ensayos locomotores a corto plazo repetidos. Se encontró que después de la inyección de lipopolisacárido, los ratones alojados en jaulas individualmente ventiladas o IVC se recuperaron más rápidamente de la pérdida del LMA a corto plazo provocada por la inyección, en comparación con los ratones alojados en jaulas con entorno ambiental o EC. Aunque la pérdida inicial de la actividad locomotora es similar entre los grupos inyectados con LPS, la recuperación de la actividad locomotora basal es más rápida en los ratones alojados en IVC, al igual que la velocidad y la duración de los movimientos.

En este análisis, la detección de un movimiento de dos centímetros por segundo inició el seguimiento y un movimiento de 1,75 centímetros por segundo detuvo el seguimiento, utilizando las variables de detección. Se realizó una prueba breve de la locomoción durante dos ciclos de actividad consecutivos de 12 horas. En ratones normales, no se encontró una diferencia significativa en la distancia recorrida, ni en la velocidad de los movimientos ni en la duración de los mismos.

Si la tendencia no muestra una diferencia medible y se repite con un tamaño de muestra grande, los datos sugerirían que el ensayo podría utilizarse para reemplazar los transmisores implantados empleados en ensayos locomotores a largo plazo. Al intentar este procedimiento, es fundamental tener especial cuidado con las condiciones de alojamiento previas al experimento. Todos los animales experimentales y de control deben mantenerse en condiciones ambientales similares, especialmente en cuanto al ciclo de luz, temperatura ambiente y humedad relativa.

Además, se debe minimizar su exposición a estímulos de ruido y olor tras seguir este procedimiento. Otros métodos, como la prueba de natación forzada, pueden utilizarse para responder preguntas adicionales, como si el tratamiento de un experimento determinado provoca un comportamiento similar a la depresión sin afectar la actividad locomotora general.