Simultánea pre-y post-sináptica de registro electrofisiológico

El objetivo general de este procedimiento es obtener cultivos primarios de neuronas espinales y células musculares acopladas sinápticamente a partir de embriones de Xenopus. Esto se logra primero induciendo la reproducción en Xenopus mediante la inyección de gonadotropina coriónica humana en ranas macho y hembra, y recolectando los huevos fertilizados. El segundo paso consiste en eliminar la capa de gelatina, el vitelo y las membranas de embriones en la etapa 22.

A continuación, se aíslan las neuronas espinales y los músculos de los embriones y se elimina y descarta la piel. El último paso consiste en sembrar las células aisladas en placas de cultivo y permitir la formación de uniones neuromusculares funcionales. En última instancia, se pueden demostrar conexiones sinápticas funcionales mediante grabaciones simultáneas por duplicado con parche en configuración de bloqueo desde neuronas y células musculares en cultivo.

La belleza de esta técnica radica en que proporciona una preparación sináptica vertebrada fácilmente accesible. Puede utilizarse para monitorear la liberación de neurotransmisores mediante grabaciones electrofisiológicas postsinápticas mientras simultáneamente se mide la presencia de iones presinápticos. Además, los métodos son claros y sencillos, y no requieren equipo especial más allá de un microscopio de disección, por lo que las culturas pueden almacenarse a temperatura ambiente en un medio de cultivo simple.

Esta preparación puede ser útil para responder preguntas clave en el campo de la fisiología sináptica, incluyendo cómo los eventos bioquímicos y biofísicos presinápticos se acoplan con la liberación de neurotransmisores. Además, también es útil para el estudio de la neuromodulación, la sinaptogénesis y la plasticidad sináptica. Para comenzar este procedimiento, prepare las soluciones necesarias según el manuscrito adjunto. Luego, fabrique al menos dos herramientas de microdisección pegando un alfiler minuchin al extremo de una pipeta de Pasteur de vidrio.

Con pegamento acrílico Sano, deje que el extremo afilado del alfiler sobresalga aproximadamente 0,5 centímetros más allá del extremo de la pipeta. Dos días antes de preparar los cultivos, identifique una pareja de XUS lista para reproducirse observando una garra rojiza prominente aika en la hembra y una pigmentación oscura en la superficie plana de las patas delanteras del macho. A continuación, atrape cada rana con una red y sosténgala con la cara ventral hacia abajo en un fregadero, utilizando la red, de modo que pueda escapar.

Inyecte un mililitro de HCG a través de la red y de forma subcutánea en una de las bolsas linfáticas dorsales para asegurar que los animales no pisoteen los huevos recién puestos y fertilizados. Instale un piso con malla de media pulgada ajustado a una o dos pulgadas en la parte inferior del tanque. Luego, coloque al par reproductor juntos en un tanque cubierto de 10 galones de agua.

Deje las ranas sin molestias durante 12 a 48 horas hasta que se observen huevos fertilizados en el fondo debajo de la pantalla. Luego retire los animales del tanque, pero deje los huevos sin molestias durante al menos 24 horas más. Este par de ranas puede volver a reproducirse después de seis semanas.

A continuación, suelte los embriones del fondo del recipiente y transfiéralos a cuatro o cinco placas de cultivo de 60 por 15 milímetros que contengan salina al 10%. Ordene los embriones según la etapa, de acuerdo con el esquema de New-coupe y Faber; los embriones ideales tienen un aspecto liso con modelado ligero de color marrón y blanco, como los de la izquierda. Por otro lado, los embriones que presentan grandes manchas negras o blancas, como los de la derecha, generalmente son poco saludables e inutilizables.

Dentro de una campana de flujo laminar, etiquete y llene hasta aproximadamente la mitad 360 placas de cultivo estériles de 15 milímetros con solución salina al 10% y una con CMF. Utilizando una pipeta de vidrio estéril, transfiera de cinco a diez embriones en estadio 22 a 24 a uno de los recipientes que contienen solución salina al 10%. Con ayuda de un microscopio estereoscópico de zoom dentro de la campana, retire la capa de gelatina y la membrana vitelina de cada embrión usando dos pares de pinzas estériles. Lave los embriones desnudos pasándolos uno por uno a través de los otros dos recipientes con solución salina al 10%, y finalmente introdúzcalos en el recipiente que contiene CMF.

A continuación, sostenga cada embrión suave pero firmemente con un par de pinzas y utilice la herramienta de disección microscópica para eliminar el tubo neural y los miótomos asociados, que se encuentran en la parte más dorsal del animal. Haga esto realizando tres cortes: uno en cada extremo de la ubicación del tubo neural y un tercero justo ventral a este. Luego, traslade cada miótomo con tubo neural diseccionado a una zona limpia del recipiente, lejos de los gránulos de yema y otros residuos.

Después de aproximadamente 15 minutos en CMF, use la pinza para levantar la piel pigmentada libre del tejido diseccionado y deseche la piel. Después de un tiempo adicional de 30 a 60 minutos, las células formarán un montículo similar al de un montón de arena a medida que se disocien entre sí. En este procedimiento, descongele un tubo de 10 mililitros de medio de cultivo, luego agregue 70 microlitros de ITS en 35 nanogramos por mililitro, etiqueta BDNF y llene las placas de cultivo estériles de 35 milímetros aproximadamente hasta la mitad con medio de cultivo L 15.

Utilice un plato de cultivo para cada embrión que haya diseccionado. Para fabricar una pipeta de siembra, sostenga ambos extremos de una pipeta de Pasteur de vidrio y coloque la porción cónica sobre una llama. Luego, estire los extremos hasta aproximadamente 10 centímetros.

Posteriormente, rompa el extremo para obtener una punta de aproximadamente 0,2 milímetros. A continuación, utilice la pipeta de siembra para aspirar el montículo de arena de un embrión. Tenga cuidado de minimizar la cantidad de solución aspirada.

A continuación, expulse las células hacia el fondo de una placa de cultivo y siembrelas en varias líneas. Luego, deje las placas con las células sembradas sin perturbar durante al menos 15 minutos para permitir que las células tengan tiempo de adherirse a la placa. Después de 12 a 24 horas en cultivo, las células sembradas desarrollarán características morfológicas distintivas.

Por ejemplo, las células musculares adquieren una forma fusiforme y las neuronas espinales desarrollan prolongaciones largas. El contacto sináptico funcional entre las varicosidades, el ácido úrico y las células musculares puede confirmarse mediante grabaciones electrofisiológicas simultáneas y apareadas. Para ello, prepare dos electrodos de registro, uno para la varicosidad presináptica y otro para la célula muscular.

Luego, llene el electrodo presináptico con la solución interna que contiene amfotericina y el electrodo postsináptico con la solución interna de potasio. A continuación, reemplace el medio en la placa de cultivo por NFR. Después, transfiera la muestra a un microscopio invertido equipado con óptica de contraste de fases, realice un parche sobre la varicosidad presináptica con el electrodo que contiene amfotericina y sobre la célula muscular postsináptica con el otro electrodo para confirmar la funcionalidad de la sinapsis, despolarice la varicosidad mediante un amplificador de parche, y observe las corrientes presináptica y postsináptica simultáneas.

Esta figura muestra una vista con aumento de cinco veces de las células y el cultivo inmediatamente después de la siembra, y este es el mismo cultivo con aumento de 40 veces. Aquí se observa la unión neuromuscular en cultivo, que muestra el soma neuronal, la terminación presináptica, la varicosidad y la célula muscular postsináptica. Se muestran aquí las corrientes presinápticas y postsinápticas.

En respuesta a la aplicación de pasos incrementales de voltaje de 10 milivoltios presentados a la varicosidad presináptica desde menos 30 milivoltios hasta más 40 milivoltios, el potencial de sostenimiento para ambas células fue de menos 70 milivoltios. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en aproximadamente dos horas. Luego, se pueden obtener cultivos celulares viables en tan solo 24 horas y pueden mantenerse durante varios días. Esta preparación ya ha estado en uso durante varios años, ayudando a explicar algunas de las propiedades fundamentales de la transmisión neuromuscular.

Es nuestro deseo que este video permita la continuación del descubrimiento al ayudar a los investigadores a familiarizarse más con esta técnica poderosa y sencilla.