Simultánea pre-y post-sináptica de registro electrofisiológico Xenopus Músculo Nervio-Co-culturas

El objetivo general de este procedimiento es obtener cultivos primarios de neuronas espinales acopladas sinápticamente y células musculares a partir de embriones de xenopus. Esto se logra induciendo primero la reproducción en xenopus mediante la inyección de coriónico humano en atropina en ranas macho y hembra y recolectando huevos fertilizados. El segundo paso es eliminar la capa de gelatina, el fatel y las membranas de los embriones en etapa 22.

A continuación, se aíslan las neuronas y los músculos espinales de los embriones y se extrae la piel y se desecha. El paso final es colocar las células aisladas en placas de cultivo y permitir la formación de uniones neuromusculares funcionales. En última instancia, las conexiones sinápticas funcionales se pueden demostrar con grabaciones simultáneas de pinzas de parche emparejadas de neuronas y células musculares en cultivo.

La belleza de esta técnica es que produce una preparación sináptica de vertebrados fácilmente accesible. Se puede utilizar para monitorear la liberación de neurotransmisores con registros electrofisiológicos postsinápticos mientras se mide simultáneamente la ocurrencia de iones presinápticos. Además, los métodos son claros y sencillos, no requieren ningún equipo especial más allá de un microscopio de disección, por lo que los cultivos pueden almacenarse a temperatura ambiente en un medio de cultivo sencillo.

Esta preparación puede ser útil para responder preguntas clave en el campo de la fisiología sináptica, incluida la forma en que los eventos presinápticos, bioquímicos y biofísicos se acoplan con la liberación de neurotransmisores. Además, también es útil para el estudio de la sinaptogénesis y la plasticidad sináptica de la neuromodulación Para comenzar este procedimiento, prepare las soluciones requeridas de acuerdo con el manuscrito adjunto. A continuación, fabrique al menos dos herramientas de microdisección pegando un alfiler de minuchin en el extremo de una pipeta de pasta de vidrio.

Con el pegamento acrílico Sano, deje que el extremo afilado del pin se extienda más allá del extremo de la pipeta aproximadamente 0,5 centímetros. Dos días antes de preparar los cultivos, identifique una pareja de XUS lista para la reproducción observando un aika de garra rojiza prominente en la hembra y una pigmentación oscura en la superficie plana de las patas delanteras del macho. A continuación, atrapa cada rana con el lado ventral hacia abajo en un fregadero con la red para que pueda escapar.

Inyecte un mililitro de HCG a través de la red y por vía subcutánea en uno de los sacos linfáticos dorsales para asegurarse de que los animales no pisoteen los huevos recién puestos y fertilizados. Instale un piso con mosquitero con un tamaño de malla de media pulgada ajustado de una a dos pulgadas en el fondo del tanque. Luego coloque a la pareja reproductora junta en un tanque cubierto de 10 galones de agua.

Deje a las ranas intactas durante 12 a 48 horas hasta que se observen huevos fertilizados en el piso debajo de la pantalla. A continuación, retire los animales del tanque, pero deje los huevos intactos durante al menos 24 horas más. Este par de ranas se puede volver a criar después de seis semanas.

A continuación, afloje los embriones del fondo del tanque y transfiéralos a cuatro o cinco placas de cultivo de 60 por 15 milímetros que contengan un 10% de solución salina. Clasifique los embriones por etapa de acuerdo con el esquema de los nuevos embriones coupé y Faber que son lisos en apariencia con modelado claro, marrón y blanco como los de la izquierda son ideales. Por otro lado, los embriones que tienen grandes manchas negras o blancas como las de la derecha son generalmente poco saludables e inutilizables.

Dentro de una campana de flujo laminar, etiquete y llene aproximadamente la mitad de las placas de cultivo estériles de 360 por 15 milímetros con solución salina al 10% y una con CMF. Usando una pipeta pastosa de vidrio estéril, transfiera de cinco a 10 embriones, de la etapa 22 a 24, a una de las placas que contienen solución salina al 10% con el ocho de un microscopio de disección con zoom estéreo dentro de la campana, retire la capa de gelatina y la membrana de viel de cada embrión usando dos pares de pinzas estériles. Lave los embriones desnudos pasándolos uno a la vez a través de los dos platos restantes de solución salina al 10% y, finalmente, en el plato que contiene CMF.

A continuación, sujete cada embrión de forma suave pero firme con un par de pinzas y utilice la herramienta de microdisección para extraer el tubo neural y los miotomas asociados, que se encuentran en la cara más dorsal del animal. Para ello, haz tres cortes, uno en cada extremo de la ubicación del tubo neural y un tercero justo ventral a él. A continuación, mueva cada miotoma del tubo neural diseccionado a una parte limpia de la placa, lejos de los gránulos de yema y otros residuos.

Después de unos 15 minutos en CMF, use las pinzas para levantar la piel pigmentada y liberarla del tejido disecado y desechar la piel. Después de 30 a 60 minutos adicionales, las células formarán una pila de arena a medida que se disocien entre sí. En este procedimiento, descongele un tubo de 10 mililitros de medio de cultivo, luego a 70 microlitros de ITS en 35 nanogramos por mililitro, etiqueta BDNF y llene las placas de cultivo estériles de 35 milímetros aproximadamente hasta la mitad con medio de cultivo L 15.

Use una placa de cultivo para cada embrión que haya diseccionado. Para fabricar una pipeta de enchapado, sostenga ambos extremos de una pipeta de pasta de vidrio y coloque la parte cónica sobre una llama. A continuación, separa los extremos hasta unos 10 centímetros.

Posteriormente se rompe el extremo para ceder a la punta de aproximadamente 0,2 milímetros. Después, utilice la pipeta de placas para succionar la pila de arena de un embrión. Tenga cuidado de minimizar la cantidad de solución extraída.

A continuación, expulse las células al fondo de una placa de cultivo y colóquelas en varias líneas. A continuación, deje las placas de las células enchapadas sin tocar durante al menos 15 minutos para permitir que las células tengan tiempo de adherirse a la placa. Después de 12 a 24 horas en cultivo, las células en placa desarrollarán características morfológicas distintas.

Por ejemplo, las células musculares adquieren forma de huso y las neuronas espinales desarrollan procesos largos. El contacto sináptico funcional entre el urato, las varices y las células musculares puede confirmarse con registros electrofisiológicos emparejados simultáneos. Para ello, prepare dos electrodos de parche para el registro, uno para la varicosa presináptica y otro para la célula muscular.

A continuación, llene el electrodo presináptico con una solución que contenga información y el electrodo postsináptico con una solución interna de potasio. Después de eso, reemplace los medios en el plato de cultivo con NFR. A continuación, transfiéralo a un microscopio invertido equipado con óptica de contraste facial, parchee la varicosidad presináptica con el electrodo que contiene anfotericina y la célula muscular postsináptica con el otro electrodo para confirmar la funcionalidad de la sinapsis, despolarize la varicosidad con un amplificador de pinza de parche y observe las corrientes presinápticas y postsinápticas simultáneas.

Esta figura muestra una vista de potencia de cinco veces de las células y el cultivo inmediatamente después de la siembra, y este es el mismo cultivo a 40 veces. Aquí está la unión neuromuscular en cultivo, que muestra el soma neuronal, la célula muscular presináptica, la varicosidad y la postsináptica. Aquí se muestran las corrientes presinápticas y postsinápticas.

En respuesta a la aplicación de pasos de voltaje incremental de 10 milivoltios presentados a la varicosidad presináptica de menos 30 milivoltios a más 40 milivoltios, el potencial de retención para ambas celdas fue de menos 70 milivoltios. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en aproximadamente dos horas. Los cultivos celulares viables se pueden obtener en tan solo 24 horas y se pueden mantener durante varios días. Este preparado ya se ha utilizado durante varios años, ayudando a explicar algunas de las propiedades fundamentales de la transmisión neuromuscular.

Esperamos que este video permita la continuación del descubrimiento al ayudar a los investigadores a familiarizarse más con esta técnica poderosa y simple.