Ex utero electroporación y explantes enteros hemisferio: un método simple Experimental de Estudios del Desarrollo Cortical Temprana

El objetivo general de este procedimiento es preparar un explante del hemisferio cerebral completo para el estudio del desarrollo cortical temprano. Esto se logra primero obteniendo embriones de ratón en el día embrionario 13. A continuación, se inyecta la mezcla de ADN plasmídico en el ventrículo cerebral y se realiza una electroporación ex utero.

Luego, prepare una explanta de hemisferio completo a partir del embrión electroporado. El paso final consiste en fijar y seccionar la explanta de hemisferio completo para realizar análisis histológicos. En última instancia, la consecuencia de una mutación o la exposición a una toxina en el desarrollo de neuronas corticales puede evaluarse mediante análisis inmunohistológicos de neuronas que expresan GFP.

Me llamo Eric Olson. Estoy en el Departamento de Neurociencia y Fisiología aquí en la Universidad Médica de SUNY Upstate en Syracuse, y hoy les mostraremos un método que desarrollamos llamado el hemisferio entero X explante. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el explante de corteza, es que los explantes de hemisferio entero son sencillos de preparar y proporcionan dos días de crecimiento organotípico.

El método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del neurodesarrollo, como cómo una mutación o toxina específica interrumpe el desarrollo cortical temprano. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque preparar el hemisferio completo como explante sin dañar las meninges puede requerir cierta práctica. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de disección y transferencia del explante son difíciles de aprender debido a la sensibilidad del tejido frente a la perturbación mecánica.

La Dra. Theresa Ozzi, investigadora posdoctoral en mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Para este protocolo, utilice un kit comercialmente disponible para purificar los plásmidos. Prepare el ADN plasmídico a 0,33 miligramos por mililitro en agua y añada colorante azul de metileno como trazador de inyección al 0,02% peso por volumen. Desinfecte siempre las herramientas quirúrgicas, el área de trabajo y el microscopio.

Con etanol al 70 %, sacrifica un número requerido de hembras Swiss Webster en el día E13 mediante inhalación de dióxido de carbono. Cuando se extraen los embriones, colóquelos en una placa de 10 centímetros con HBSS frío con hielo, manteniendo la placa sobre hielo. Diseccione cuidadosamente cada embrión de las membranas extraembrionarias que lo rodean.

Ahora transfiera cada embrión individualmente a un recipiente limpio con HBSS frío con hielo. Utilizando una jeringa Hamilton, inyecte de dos a tres microlitros del ADN preparado en el ventrículo del hemisferio cerebral izquierdo. No inyecte en el área cortical destinada al análisis futuro ni cerca de ella.

Para electrooporar el ADN, sostenga suavemente el embrión con pinzas y coloque ligeramente la paleta positiva de los electrodos en forma de pinzas sobre la línea media dorsal de la cabeza. Coloque ligeramente la paleta negativa debajo del mentón del embrión. Ejecute un programa de cinco pulsos de 30 voltios, cada uno de 50 milisegundos con intervalos de un segundo, utilizando un modelo BTX 830 u otros sistemas que pueden ajustarse según las instrucciones del fabricante.

Devuelva cada embrión al HBSS frío con hielo y continúe con la preparación del hemisferio completo bajo un microscopio de disección, utilizando dos pinzas de joyero número cinco. Retire la piel y el cráneo cartilaginoso de la cabeza del embrión. A continuación, deslice las pinzas por debajo del cerebro.

Para extraer el cerebro intacto del cráneo, disecar el hemisferio electroporado, incluyendo el tejido del mesencéfalo adyacente. Tener cuidado de no dañar las meninges que recubren el hemisferio cortical disecado. Hemos encontrado que el paso más difícil de dominar es la disección y la eliminación del hemisferio electroporado sin dañar las meninges.

Una vez diseccionado, transfiera cada hemisferio a cinco mililitros de HBSS frío con hielo utilizando una punta de pipeta de un mililitro ensanchada. Si es necesario, los embriones pueden mantenerse en pozos separados de una placa de cultivo tisular de 12 pozos. A continuación, transfiera suavemente hasta seis hemisferios a una placa de cultivo recubierta con colágeno de 24 milímetros.

Inserte y coloque con el lado medial hacia abajo. Ahora llene un pocillo de 35 milímetros de una placa de seis pocillos con 2,7 mililitros de medio suplementado. Retire cualquier exceso de HBSS del inserto y coloque el inserto en el pocillo; con una pipeta, añada unas gotas del medio del pocillo sobre la parte superior de cada x explan.

No aumente el volumen del medio. Descubrimos que es fundamental colocar unas cuantas gotas de medio de cultivo encima del explante X, de manera que los explantes X no queden completamente cubiertos con el medio. Esto puede significar añadir hasta 400 microlitros a los 2,7 mililitros de medio que ya hay encima del explante X.

Coloque la placa en una cámara billus rothenberg que contenga un recipiente humidificador con agua y que haya sido infundida con oxígeno al 95 % durante al menos un minuto. Cierre herméticamente la cámara y desconecte el tubo de suministro de gas. Coloque la cámara en un incubador a 37 grados Celsius durante dos días, tiempo en el cual ya habrá ocurrido la división de prepl.

En preparación. Prepare los almohadillas para incrustar el explante. Prepare una solución de gelatina de piel de ternera al 10 % a 60 grados Celsius.

Una vez solubilizado, vierta aproximadamente 10 mililitros de la solución en una placa de 10 centímetros. Mantenga la solución restante a 60 grados Celsius para su uso posterior. Deje que las almohadillas se solidifiquen durante media hora, si es necesario.

Se pueden almacenar a cuatro grados Celsius durante varios días, pero deben calentarse a temperatura ambiente antes de usarlos. El día de la fijación en una campana extractora, prepare la solución Pagano con fijador y la solución Pagano sin fijador. Caliente la solución de fijación a 37 grados Celsius.

Retire los explantes del incubador sin perturbar cuidadosamente y rápidamente los tejidos. Retire la mayor parte del medio y sustitúyalo con cinco mililitros de fijador calentado. Asegúrese de que cada explante quede completamente sumergido.

Fije los tejidos durante una hora a temperatura ambiente. Luego elimine el fijador y sustitúyalo por solución de Pagano. Sin fijador.

Agregue unas gotas de azida de sodio al 10 % a cada pocillo. Los tejidos ahora pueden almacenarse a cuatro grados Celsius hasta que se incluyan en una placa de inclusión. Dibuje una cuadrícula en el fondo del recipiente con la ayuda de una regla.

Prepare cuadrados de dos a tres centímetros. Transfiera los explantes individuales sobre la almohadilla de inclusión. Elimine cualquier solución residual y cubra cada explante con una solución tibia de gelatina al 10 %.

Deje que solidifique. Una vez solidificado lentamente, agregue más solución de gelatina hasta que cada explante quede completamente rodeado. Evite derretir la almohadilla, lo cual puede ocurrir si se agrega demasiada gelatina a la vez.

Ahora, deje que la gelatina se endurezca durante aproximadamente una hora. Una vez endurecida, el explante individual se puede cortar en pequeños bloques de gelatina antes del corte. Es importante fijar posteriormente los bloques en fijador Pagano durante uno o dos días.

Al realizar cortes, coloque los explantes con el bulbo olfatorio hacia arriba y efectúe cortes en el plano coronal con un grosor de 100 micrómetros. Recolecte los cortes en PBS frío con azida sódica al 0,1 %.

Guarde las secciones a cuatro grados Celsius hasta que puedan teñirse utilizando la técnica descrita. Los explantes completos de hemisferio se prepararon en E 13 antes de la separación preliminar. En la neocorteza dorsal.

El tejido albergaba un transgén que reporta neuronas inmaduras de la línea cortical excitatoria. Los explantes corticales del mismo camada se fijaron por goteo secuencialmente durante un período de dos días in vitro y se procesaron para análisis histológico posterior. En el punto inicial de análisis, DIV cero, la división previa no había ocurrido aún en el campo uno por uno.DIV.

El CP se hizo evidente y continuó creciendo hasta el 2D IV. De este modo, los explantes de hemisferio completo cultivados inicialmente en el E 13 sostuvieron durante dos días la maduración de la corteza cerebral y capturaron la división del prelate en la neocorteza dorsal para confirmar el desarrollo histológico normal en la neocorteza dorsal. Los explantes del 2D IV fueron sometidos a tinción inmunológica para sulfato de condroitina, proteoglicanos y componentes de la matriz extracelular. Dos bandas de inmunorreactividad en la corteza dorsal indicaron la división adecuada del PPP en la ZM y la SP durante el período de cultivo in vitro.

El PP se dividió mediante L seis neuronas corticales que expresan CTIP dos y TBR R uno. El patrón de inmunotinción de estos marcadores confirma la expresión adecuada de estos factores de transcripción en el cp recién formado. Conjuntamente, estos análisis confirman el desarrollo cortical temprano ORGANOTÍPICO en el hemisferio completo mediante el empleo de todo el protocolo descrito, en el que se inyectó la ventrícula izquierda de embriones E 13 intactos.

Pudo observarse la expresión de GFP electro porada y procesada a partir de precursores neuronales en la vz. Aunque se observaron células intensamente expresantes de GFP en la ZI y la pc, es importante destacar que numerosas neuronas positivas para GFP, marcadas con cabezales de flecha, se observaron en la parte superior de la cp en formación, con dendritas y axones emergentes. La capa definida en la interfaz entre la pc y la MZ indica una migración, detención y laminación adecuadas.

Las dendritas se extendieron hacia la ZM, mientras que los axones corticougales se extendieron por debajo de la PC y hacia la ZI. Las células en diferenciación eran células GFP positivas en distintos estados de madurez, incluyendo neuronas con una morfología bipolar adyacentes a fibras gliales radiales y, por debajo de ellas, neuronas multipolares en la ZI. Las dendritas también se extendieron hacia la ZM, donde la proteína de la MEC denominada reelin se encuentra adecuadamente inmuno localizada.

Por lo tanto, las condiciones de electrotransferencia y de explante permiten el desarrollo normal de neuronas corticales. Como era de esperar, las neuronas posmitóticas positivas para GFP colonizaron el cp en formación. Así, el protocolo puede dirigirse de manera confiable a neuronas corticales L6 para estudios de su migración y maduración.

El uso extenso de este procedimiento ha resultado en una tasa de éxito del 79 %. De 248 intentos, 195 fueron adecuados para la obtención de imágenes y el análisis. La mitad de los fracasos se debieron a la falta de expresión de GFP o a que se omitió el GFP dirigido. Una vez dominado.

Esta técnica puede realizarse en 90 minutos si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar practicar las disecciones para que los hemisferios electroporados puedan cultivarse con meninges intactas tras seguir este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la microscopía de lapso de tiempo, con el fin de responder preguntas adicionales, como cómo las mutaciones de interés alteran la migración neuronal o la agénesis dendrítica.