Revestimientos de grafeno para Implantes Biomédicos

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un método para recubrir nitinol de aleación con memoria de forma metálica con grafeno para mejorar la compatibilidad de la hemología en los materiales de implantes en contacto con la sangre. Esto se logra cultivando primero grafeno en láminas de cobre utilizando deposición química de vapor. El segundo paso es grabar las láminas de cobre y transferir el grafeno preparado a sustratos de nitinol.

A continuación, los sustratos de nitinol recubiertos de grafeno se utilizan para cultivar células endoteliales y células musculares lisas. Para cuantificar la compatibilidad de citos, otro ensayo consiste en comprobar la compatibilidad del hemo mediante la codificación de ambas proteínas, fibrinógeno y albúmina, en los sustratos de nitinol recubiertos de grafeno. En última instancia, la espectroscopia de micro ramina, los ensayos de citotoxicidad in vitro de microscopía confocal y el análisis de proteínas de página SDS se utilizan para mostrar un recubrimiento de grafeno exitoso, una morfología celular mejorada, una viabilidad celular mejorada y una mejor compatibilidad hemocompatible.

La principal ventaja de esta técnica o de las técnicas existentes como el recubrimiento de polímeros, es que los recubrimientos de grafeno son extremadamente duraderos y resistentes a la corrosión. Las implicaciones de esta técnica se extienden a la mejora del origen de las tecnologías de stents, ya que se espera que las propiedades inherentes de los grafenos reduzcan la absorción de proteínas y reduzcan la activación de los factores de coagulación debido al cambio de confirmación de proteínas. Aunque este método puede proporcionar información, los stents de nitinol recubiertos de grafeno también se pueden utilizar para otros sistemas, como válvulas cardíacas o catéteres.

Para comenzar, coloque láminas de cobre de un centímetro por un centímetro en un horno de tubo de cuarzo de una pulgada y caliente a 1000 grados Celsius en presencia de 50 SCCM de hidrógeno y 450 SCC CM de Argonne. A continuación, introduzca uno y cuatro SCCM de metano en el horno a 1000 grados Celsius a diferentes caudales durante 20 a 30 minutos. Enfríe las muestras a temperatura ambiente dentro del horno bajo un flujo de hidrógeno, argonano y metano.

Después de retirar las muestras del horno, córtelas en cuadrados de 4,5 milímetros y use PMMA diluido con 4% de anolis para recubrir las láminas de cobre a 4.000 RPM, seguido de un tratamiento térmico durante cinco minutos a 150 grados centígrados. Grabe la lámina de cobre con grabado CE 100 hasta que la lámina de cobre esté completamente grabada. Enjuague con ácido clorhídrico al 10% durante 10 minutos, luego en agua desionizada durante 10 minutos.

Para obtener la muestra de grafeno, PMMA, transfiera las muestras de grafeno a sustratos de nitinol de 4,5 milímetros cuadrados. A continuación, a 450 grados centígrados en 300 SCCM de argón y 700 SCCM de hidrógeno durante dos horas. Para eliminar el PMMA, finalmente lave los sustratos de nitinol con acetona para disolver el PMMA residual y obtener la muestra de grafeno, níquel y titanio.

Para comenzar las pruebas de toxicidad, agregue nitinol prístino un SCCM o cuatro sustratos de nitinol de grafeno SCCM a placas de 96 pocillos donde el SCCM indicado corresponde al flujo de metano utilizado en el crecimiento de la deposición química de vapor del grafeno. A continuación, siembra células endoteliales aórticas de rata de 10 a la quinta celda por pocillo en algunos de los pocillos que contienen nitinol prístino, un SCCM o cuatro SCCM. Sustratos de grafeno nitinol, semillas de células musculares lisas aórticas de rata de manera similar en un conjunto diferente de pocillos.

Cultive las células durante tres días o siete días en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono intercambiando medios cada dos días. En el punto de tiempo final, retire los medios de los pocillos que contienen células musculares lisas y agregue medios nuevos que contengan 0,5 miligramos por mililitro de MTT a cada uno. Incubar bien las células durante tres horas más.

A continuación, retire suavemente el medio y agregue 100 microlitros de dimetilsulfóxido a cada pocillo. Después de dejar 10 minutos para que los cristales de MTT se disuelvan, transfiera la solución a otra placa de pocillos. Para el ensayo MTS, retire los medios de los pocillos que contienen células endoteliales en el punto de tiempo final.

Reemplace con 120 microlitros de solución MTS e incube durante tres horas. Luego transfiera el contenido del pocillo a una nueva placa. Lea el absorbente a 490 nanómetros y determine el porcentaje de viabilidad normalizando la absorbencia a la absorbancia promedio de la muestra de nitinol prístino.

Repita este paso al menos cinco veces para cada muestra. Para obtener imágenes confocales de las células del músculo liso de la aorta de rata, coloque los sustratos en un portaobjetos de ocho cámaras, dejando una cámara vacía como control. A continuación, siembre las células en todas las cámaras a 25.000 células por cámara e incube durante tres días a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Después de retirar los medios de los portaobjetos, adhiera las células sobre el sustrato con 4% de formaldehído en tampón PBS durante 20 minutos. Lavar con PBS, luego permear con 0.1%Triton X durante un minuto. Después de lavar con PBS, añadir 100 microlitros de la solución LOR 4 88 PHIN a 1,9 mililitros de tampón PBS.

Para visualizar la acton, tiñe las células con 250 microlitros de LOR 4 88 Phin durante 45 minutos y luego lávalas dos veces con tampón PBS. A continuación, tiñe los núcleos con un medio de montaje fluorescente que contenga ppp. Recopile imágenes confocales con una Nikon confocal ti.

Antes de comenzar los experimentos de absorción de proteínas de albúmina y fibrinógeno, mida las dimensiones del sustrato con calibradores. Tome tres medidas para cada lado de las muestras aproximadamente cuadradas y el promedio. Para obtener la longitud y el ancho, coloque la muestra de nitinol prístino, la muestra de nitinol grafeno SCCM y la muestra de nitinol grafeno SCCM cuatro en dos 12.

Las placas de pocillos añaden tampón PBS que contiene un miligramo por mililitro de albúmina. Agregue temperatura ambiente a una de las placas e incube durante tres horas por separado. Incubar los tres tipos de muestras con tampón PBS que contenga un miligramo por mililitro.

Fibrinógeno a temperatura ambiente durante tres horas después de lavar las muestras con PBS, combine las muestras similares en un tubo de microcentrífuga con 200 microlitros de tampón de muestra reductor y hierva durante cinco minutos. Diluya las muestras en una proporción de uno a nueve volumen a volumen de tampón SDS de glicina T a agua desionizada y pase por un gel de electroforesis de poliacrilamida de cuatro a 15% a 90 voltios durante 100 minutos. Diluir la solución madre roja spro en una proporción de uno a 5.000 en ácido acético al 7,5%.

A continuación, tiñe los geles durante 60 minutos con la solución diluida de spro red. Envuélvalo en papel de aluminio para proteger el rojo spro de la luz, geles de imagen con un Fluor chem SP y cuantifique la intensidad fluorescente con el software Image J. A continuación, normalice la intensidad fluorescente de cada muestra por el área total del sustrato y compare la absorción de fibrinógeno con la absorción de albúmina.

El método de deposición química de vapor produjo muestras de grafeno policristalino que imitan los granos de cristal de cobre Se utilizó espectroscopía de ramen para confirmar la presencia de grafeno monocapa en una SCCM y cuatro muestras de SCCM. La única muestra de SCCM exhibe una banda GPR intensa que indica la naturaleza monocapa del grafeno preparado. En contraste, la muestra de cuatro SCCM muestra una banda GPR relativamente más débil, lo que confirma la presencia de algunas capas de grafeno en la imagen.

Las mediciones detalladas de la muestra arrojaron un valor de rugosidad superficial de aproximadamente cinco nanómetros. Mostrado. Aquí están las imágenes de microscopía óptica confocal para células de músculo liso cultivadas en un portaobjetos de vidrio controlado sobre sustratos de nitinol prístinos, en un sustrato de grafeno y nitinol de SCCM y en cuatro sustratos de nitinol de grafeno de SCCM. Las células son densas y esféricas en ambas superficies de nitinol grafeno, lo que demuestra una mejor morfología celular.

Los ensayos MTT y MTS muestran que uno y cuatro sustratos de nitinol de grafeno SCCM no exhiben una diferencia significativa en la viabilidad de las células musculares lisas en relación con el nitinol prístino. Los ensayos MTS muestran que la viabilidad celular a tres días para las células endoteliales no fue significativamente diferente a la de los controles. Las imágenes de microscopía electrónica de barrido muestran que las células endoteliales cultivadas en sustratos de nitinol prístinos son escasas y alargadas, mientras que son elipsoidales y densas en los sustratos de nitinol de grafeno de SCCM.

Estos resultados demuestran que los recubrimientos de grafeno conducen a una mejor morfología celular esférica de las células endoteliales, las muestras de nitinol de grafeno de SCCM y cuatro SCCM exhiben una baja proporción de albúmina de fibrinógeno en relación con la muestra de nitinol prístino, lo que sugiere una mejor compatibilidad hemológica derivada del grafeno. El equilibrio del nivel de Fermi se muestra mediante el diagrama de nivel de energía para el fibrinógeno y la densidad de los estados electrónicos para el grafeno. Una transferencia de electrones de fibrinógeno a nitinol de grafeno solo es posible desde los estados electrónicos ocupados de la molécula de fibrinógeno a estados electrónicos vacíos de nitinol de grafeno al mismo nivel de energía.

Tanto el grafeno monocapa como el grafeno de pocas capas son semimetales a temperatura ambiente con baja densidad de electrones a nivel de furia, lo que da como resultado una transferencia de carga débil de fibrinógeno a grafeno. El grafeno no presenta ningún cambio en la forma o frecuencia de la línea de banda GB, lo que indica una transferencia de carga débil de las proteínas plasmáticas. Los picos contorneados D obtenidos del ajuste de curvas se muestran en negro para demostrar la utilidad y viabilidad del grafeno como recubrimiento de implantes.

Un centavo de cobre recubierto de grafeno se expuso a peróxido de hidrógeno al 5%. La parte recubierta de grafeno del centavo permaneció sin cambios, mientras que la parte descubierta fue decolorada por la solución de peróxido de hidrógeno. Además, el grafeno nitinol sumergido en ácido nítrico al 70% no mostró cambios en la frecuencia de la banda GB, lo que confirma que el recubrimiento de grafeno es extremadamente duradero.

Además, el recubrimiento de grafeno en nitinol de grafeno se redujo a la tasa X del cobre subyacente, lo que indica la impermeabilidad de las membranas de grafeno. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo transferir grafeno e implantes biomédicos para mejorar su biocompatibilidad.