Name: Aislamiento, cultivo y caracterización funcional de ratón adulto Cardiomyoctyes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-24T18:10:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Aprenda a aislar cardiomiocitos de ratón adulto mediante perfusión Langendorff para estudios de contracción y manejo de calcio. Este método permite el cultivo y análisis funcional de células cardíacas viables.

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<ol><li>Chlopcikova, S., Psotová, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+rat+cardiomyocytes-a+model+for+the+study+of+morphological%2C+biochemical+and+electrophysiological+characteristics+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Papers%22%5BJournal%5D)">Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart.</a> Biomedical Papers. , (2001).</li>
<li>Rosenthal, N., Brown, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+ascending%3A+perspectives+for+human-disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mouse ascending: perspectives for human-disease models.</a> Nat. Cell Biol. 9, 993-999 (2007).</li>
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<li>Lieu, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+Transverse+Tubules+Contributes+to+Non-Uniform+Ca+2%2BWavefronts+in+Mouse+and+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Absence of Transverse Tubules Contributes to Non-Uniform Ca 2+Wavefronts in Mouse and Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Stem Cells and Development. 18, 1493-1500 (2009).</li>
<li>Lim, H., De Windt, L., Mante, J., Kimball, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+cardiac+hypertrophy+in+transgenic+disease+models+by+calcineurin+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Reversal of cardiac hypertrophy in transgenic disease models by calcineurin inhibition.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 32 (4), 697-709 (2000).</li>
<li>Muthuchamy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+a+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+mutation+in+alpha-tropomyosin+manifests+cardiac+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse model of a familial hypertrophic cardiomyopathy mutation in alpha-tropomyosin manifests cardiac dysfunction.</a> Circ. Res. 85, 47-56 (1999).</li>
<li>Müller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+the+cardiac+sodium+calcium+exchanger+promoter+in+adult+and+neonatal+cardiomyocytes+by+Nkx2.5+and+serum+response+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 34, 807-821 (2002).</li>
<li>Epstein, F., Hunter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+for+cardiac+hypertrophy+and+failure%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure.</a> New England Journal of Medicine. 341 (17), 1276-1283 (1999).</li>
<li>Snopko, R., Aromolaran, A., Karko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+modifies+Ca+2%2B+signaling+during+excitation-contraction+coupling+in+neonate+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Cell culture modifies Ca 2+ signaling during excitation-contraction coupling in neonate cardiac myocytes.</a> Cell Calcium. , (2007).</li>
<li>Ranu, H., Terracciano, C., Davia, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Na%2B%2FCa2%2B-exchanger+overexpression+on+excitation-contraction+coupling+in+adult+rabbit+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effects of Na+/Ca2+-exchanger overexpression on excitation-contraction coupling in adult rabbit ventricular myocytes.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 34 (4), 389-400 (2002).</li>
<li>Kaab, S., Nuss, H. B., Chiamvimonvat, N., O'Rourke, B., Pak, P. H., Kass, D. A., Marban, E., Tomaselli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+mechanism+of+action+potential+prolongation+in+ventricular+myocytes+from+dogs+with+pacing-induced+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs with pacing-induced heart failure.</a> Circ. Res. 78 (2), (1996).</li>
<li>Splawski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+of+SCN5A+sodium+channel+implicated+in+risk+of+cardiac+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Variant of SCN5A sodium channel implicated in risk of cardiac arrhythmia.</a> Science. 297, 1333-1336 (2002).</li>
<li>Zhou, Y., Wang, S., Zhu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+adenoviral+infection+of+adult+mouse+cardiac+myocytes%3A+methods+for+cellular+genetic+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279 (1), 429-436 (2000).</li>
<li>Sussman, M., Lim, H., Gude, N., Taigen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+cardiac+hypertrophy+in+mice+by+calcineurin+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition.</a> Science. , (1998).</li>
<li>Heinzel, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+diazoxide-induced+formation+of+reactive+oxygen+species+and+loss+of+cardioprotection+in+connexin+43+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Impairment of diazoxide-induced formation of reactive oxygen species and loss of cardioprotection in connexin 43 deficient mice.</a> Circ. Res. 97, 583-586 (2005).</li>
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<li>Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J., Chein, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+atrial-specific+and+inducible+expression+of+an+atrial+natriuretic+factor+transgene+in+an+in+vivo+murine+model+of+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).</li>
<li>Nakamura, A., Rokosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LV+systolic+performance+improves+with+development+of+hypertrophy+after+transverse+aortic+constriction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">LV systolic performance improves with development of hypertrophy after transverse aortic constriction in mice.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281 (3), 1104-1112 (2001).</li>
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<li>Liao, R., Jain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+analysis+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional analysis of adult mouse cardiomyocytes.</a> Methods Mol. Med. 139, 251-262 (2007).</li>
<li>Volz, A., Piper, H. M., Siegmund, B., Schwartz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+of+adult+ventricular+rat+heart+muscle+cells+in+serum-free+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Longevity of adult ventricular rat heart muscle cells in serum-free primary culture.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 161-173 (1991).</li>
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<li>Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+Clamp+and+Perfusion+Techniques+for+Studying+Ion+Channels+Expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes.</a> J. Vis. Exp. (47), e2269(2011).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+Clamp+Recording+of+Ion+Channels+Expressed+in+Xenopus+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes.</a> J. Vis. Exp. (20), e936(2008).</li>
<li>Arman, A. C., Sampath, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+Clamp+Recordings+from+Mouse+Retinal+Neurons+in+a+Dark-adapted+Slice+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation.</a> J. Vis. Exp. (43), e2107(2010).</li>
<li>Wen, H., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+patch+clamp+recordings+from+motor-neuron+and+target+skeletal+muscle+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Paired patch clamp recordings from motor-neuron and target skeletal muscle in zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (45), e2351(2010).</li>
<li>Maier, S., Westenbroek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpected+role+for+brain-type+sodium+channels+in+coupling+of+cell+surface+depolarization+to+contraction+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An unexpected role for brain-type sodium channels in coupling of cell surface depolarization to contraction in the heart.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (6), 4073-4078 (2002).</li>
<li>Shroff, S. G., Saner, D. R., Lal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+micromechanical+properties+of+cultured+rat+atrial+myocytes+measured+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic micromechanical properties of cultured rat atrial myocytes measured by atomic force microscopy.</a> Am. J. Physiol. 269, 286-292 (1995).</li>
<li>Domke, J., Parak, W. J., George, M., Gaub, H. E., Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+mechanical+pulse+of+single+cardiomyocytes+with+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope.</a> European Biophysics Journal. 28, 179-186 (1999).</li>
<li>Smith, B. A., Tolloczko, B., Martin, J. G., Grütter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+Viscoelastic+Behavior+of+Cultured+Airway+Smooth+Muscle+Cells+with+Atomic+Force+Microscopy%3A+Stiffening+Induced+by+Contractile+Agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Probing the Viscoelastic Behavior of Cultured Airway Smooth Muscle Cells with Atomic Force Microscopy: Stiffening Induced by Contractile Agonist.</a> Biophysical Journal. 88, 2994-3007 (2005).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

En este informe, hemos descrito las técnicas necesarias para el éxito en el aislamiento y la cultura de los adultos los CM del corazón de ratón. Nuestra técnica permite para el estudio posterior de la función de CM y la excitabilidad usando los métodos descritos anteriormente. El parámetro crítico para el estudio de la funcionalidad de adultos CM es la salud y la calidad de los CM aislado. Como se describió anteriormente, nuestras técnicas permiten un alto rendimiento de células funcionales que son susceptibles a la man...

Los modelos murinos de enfermedad cardiovascular han servido como herramientas eficaces para la aclaración de los mecanismos fundamentales de la enfermedad 1,2, así como para la identificación de dianas terapéuticas potenciales 1,3. En particular, el uso de ambos modelos murinos de enfermedad cardíaca adquirida (tales como presión de la sobrecarga) 4,5 y modelos de ratones transgénicos han avanzado nuestra comprensión de la enfermedad cardíaca 6-8. El uso de técnicas de cultivo celular para estudiar las cascadas de señalización 3,9,10 y alteraciones en las proteínas individuales que subyacen en la excitabilidad celular y el acoplamiento excitación-contracción en el corazón 11-13 en el nivel de la célula individual han complementado los in vivo en modelos de ratón. Sin embargo, la falta de líneas celulares adecuadas que reflejan la estructura y función CM adultos ha sido una limitación significativa. Los investigadores han intentado superar esta mediante el estudio de proteínas individuales, tales como canales de iones, en sistemas de expresión heterólogos <sup&gt; 14, y si bien estos estudios nos han proporcionado información útil en términos de la biofísica de los canales iónicos o el tráfico de proteínas, la representación inadecuada del microambiente natural de los CM es una limitación importante. En segundo lugar, ya que la mayoría de estas células heterólogas no tienen un aparato contráctil madura, no ha sido posible estudiar la función contráctil y la compleja interacción entre la excitabilidad celular y la contracción. Por esta razón, los investigadores han recurrido a los cultivos de células cardíacas primarias para muchos de sus estudios funcionales in vitro. Por último, los estudios de cardiomiocitos aislados permiten la evaluación de la función contráctil sin los factores de confusión de preparación multicelular, incluyendo el efecto de la cicatriz o fibrosis y orientación de la fibra. Cardiomiocitos ventriculares de rata neonatales primarios (NRVMs) son relativamente fáciles de cultivar, pueden ser infectados con adenovirus y lentivirus de manipular la expresión génica 15, unapor lo tanto, ND se han utilizado con éxito 1, pero tienen limitaciones de su propia. A pesar de que proporcionan un microambiente fisiológico 1 y han sido el caballo de batalla del campo de la señalización, las diferencias sustanciales entre la morfología y la organización subcelular de NRVMs y cardiomyoctyes adultos les hacen un modelo inadecuado para la investigación de los flujos iónicos y acoplamiento excitación-contracción en el corazón adulto . Más notablemente NRVMs carecen de un-t tubular subsistema definitiva 4. Desde Ca 2 + flujo y la dinámica son críticamente dependientes madura t-tubular y retículo sarcoplásmico (SR) Estructura 6, Ca 2 + y la dinámica de los estudios funcionales de la contractilidad cardíaca en NRVMs no son un reflejo exacto de estos procesos críticos en cardiomiocitos adultos. Además, algunos componentes de las vías de señalización diferentes entre ratones recién nacidos y adultos 9, proporcionando así otra limitación para el estudio de los procesos de enfermedad y de su impact en la excitabilidad celular y la contractilidad en NRVMs. Finalmente, la distribución de la maquinaria contráctil conduce a multidireccional y no uniforme acortamiento celular limitar la exactitud de las mediciones contráctiles. El uso de aislados cardiomiocitos adultos ofrece, por tanto, un sistema de modelado más preciso in vitro. El extraordinario crecimiento del conocimiento posible gracias a la manipulación genética de los ratones subraya la importancia de la obtención de cardiomiocitos aislados funcionales de los ratones. De hecho, la caracterización de los CM adultas aisladas de modelos de ratón ha arrojado luz sobre muchos eventos biológicos y patológicos. CM aisladas de modelos de ratones transgénicos han permitido estudios de la ganancia o pérdida de la función de las proteínas en las propiedades contráctiles de las células individuales 2,16, y la viabilidad de modelos de enfermedades, como la isquemia / reperfusión 17,18, complementando así la información obtenida a partir de Estudios in vivo sobre lalos ratones se. El uso de aislados adultos CM de modelos murinos de enfermedad cardiaca adquirida 3,19,20 (como transversal sobrecarga de presión inducida por la constricción aórtica, que imita la hipertensión o estenosis de la válvula aórtica) o el ejercicio 5,21 (para el modelado de la hipertrofia fisiológica) permite un examen de la interacción de las cascadas de señalización implicadas en estos procesos con la excitabilidad celular y el acoplamiento excitación-contracción en el nivel de la célula individual. Además, la capacidad de manipular la expresión génica utilizando la expresión génica adenoviral impulsada en adultos CM nos proporciona la oportunidad de diseccionar los componentes de las vías de señalización complejos. Desde una perspectiva electrofisiológico, voltaje de células enteras y los experimentos de fijación actuales en aislados adulto CM han sido fundamentales en el esclarecimiento de la naturaleza de los flujos iónicos al inicio del estudio y en varios estados de la enfermedad. Debido a la compleja estructura de la membrana celular y la protección de bi diferencialen las estructuras de andamiaje entre el adulto y los CM NRVMs o líneas celulares heterólogos, la capacidad para reparar las células adultas da una mejor representación de los efectos de ciertas proteínas de membrana, proteínas estructurales, y socios de canales iónicos que interactúan sobre los componentes electrofisiológicas del corazón adulto. A pesar de estas ventajas importantes en el estudio de adultos cardiomiocitos murinos, aislamiento y cultivo de cardiomiocitos ratones adultos ha sido un reto, instando a la necesidad de una descripción sistemática y precisa de la metodología para aislar cardiomiocitos viables de ratón y de mantenerlas en cultivo para permitir su posterior manipulación genética utilizando viral vectores. Estudios previos han utilizado ya sea de forma aguda aislada de ratón adulto CM o cultivados de rata adulta CM. Estos últimos son más fáciles de cultivar que los CM ratón adulto, y la mayoría de los experimentos de manipulación de la expresión génica in vitro han utilizado ratas adultas CM. Pocos estudios se han alterado con éxito e investigado functila expresión de genes onal en ratón adulto CM, presentando una gran limitación en el alcance de los experimentos. Por lo tanto, aquí presentamos en detalle tales metodologías, modificado a partir de investigaciones anteriores, para el aislamiento 7,8,22, cultura 3,10,15,23, infección adenoviral 11-13,15, y el análisis funcional de cardiomyoctyes ventriculares de ratón adulto. Este protocolo de aislamiento resultados en Ca 2 +, cardiomiocitos excitables tolerantes que tenemos cultivadas con éxito durante un máximo de 72 horas y transitoriamente transfectadas con adenovirus. La funcionalidad de estas células aisladas se puede evaluar utilizando el sistema de imágenes MMSYS 14,24 y de patch clamp, que también será discutido.

<table><tbody><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa mínima</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Monóxido de 2,3-butanediona</td><td>Sigma</td><td>B0752</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa B</td><td>Roche Ciencia Aplicada</td><td>11088807001</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa D</td><td>Roche Ciencias Aplicadas</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Proteasa XIV de Streptomyces griseus</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de Suero Bovino</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Medios esenciales mínimos</td><td>Sigma</td><td>51411C</td><td></td></tr><tr><td>Solución de albúmina de suero bovino</td><td></td><td>Sigma A8412</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Medios de insulina-transferrina-selenito de sodio suplemento</td><td>Sigma</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de cesio</td><td>Sigma</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/289329?lang=en&amp; region=US" target="_blank">289329</a></td><td></td></tr><tr><td>Glutamato</td><td>Sigma</td><td>G3291</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5'-trifosfato sal de magnesio</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Etilenglicol-bis(2-amin&#8211; thylether)-N,N,N',N'-ácido tetraacético</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Solución de hidróxido de cesio</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>solución de hidróxido de tetraetilamonio</td><td>Sigma</td><td>86643</td><td></td></tr><tr><td>OptiVisor visera binocular de vidrio óptico</td><td>Dohegan Optical Company Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de tejido, 5.5", 1x2 dientes</td><td>Pinza Roboz Scientific</td><td>RS-8164</td><td></td></tr><tr><td>Moloney - 4.5" (11.5 cm) de largo ligera curva, dentada </td><td>Pinzas Roboz Scientific</td><td>RS-8254</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3, Dumostar, tamaño de la punta 0.17 x 0.10mm</td> Pinza para mosquitos <td>Roboz Scientific</td><td>RS-4966</td><td></td></tr><tr><td>Packer 5" recta plana</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-7114</td><td></td></tr><tr><td>Micro tijeras de disección 4.5" curvadas afiladas/afiladas </td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-5917</td><td></td></tr><tr><td>Micro tijeras de disección 3.5" rectas afiladas/afiladas20mm</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-5907</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento, cultivo y caracterización funcional de ratón adulto cardiomyoctyes

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

El uso de los cardiomiocitos primarios (CM) en la cultura ha proporcionado un poderoso complemento de los modelos murinos de enfermedad cardíaca en el avance de nuestra comprensión de las enfermedades del corazón. En particular, la capacidad para estudiar la homeostasis de iones, la función del canal de iones, la excitabilidad celular y el acoplamiento excitación-contracción y sus alteraciones en condiciones de enfermedad y por mutaciones causantes de enfermedades han conducido a una mejor aproximación a las enfermedades cardíacas. Por otra parte, la falta de una línea celular inmortalizada adecuada para imitar adultos CM, y las limitaciones de los CM neonatal (que carecen de muchas de las biomecánica característica estructural y funcional de los adultos CM) en la cultura han dificultado la comprensión de la compleja interacción entre las vías de señalización, canales iónicos y las propiedades contráctiles del corazón adulto fortalecer la importancia del estudio de cardiomiocitos adultos aislados. A continuación, presentamos los métodos para el aislamiento, cultivo, manipulación de la expresión génica mediante adenovirus-expreproteínas ssed, y posterior análisis funcional de los cardiomiocitos de ratón adulto. El uso de estas técnicas ayudará a desarrollar una visión mecanicista en las vías de señalización que regulan la excitabilidad celular, Ca 2 + dinámica y la contractilidad y ofrecer una caracterización mucho más fisiológicamente relevantes de la enfermedad cardiovascular.

El aislamiento de los adultos cardiomyoctyes resultados en las células en forma de barra, estriados y de reposo (no de forma espontánea de latir) (Figura 5A). Las células muertas se verá redondeado y sin estrías estarán presentes. Las células quiescentes pueden ser cultivadas y transfectadas con adenovirus para manipular la expresión génica (figuras 5B y 5C). Después de 24 horas de cultivo, la morfología de las células vivas no cambia, siguen siendo Ca 2 +-tolerant...

Aquí se describe el aislamiento de cardiomyoctyes adultas de ratón utilizando un sistema de perfusión Langendorff. Las células resultantes son de Ca2 +-tolerante, eléctricamente en reposo y pueden ser cultivadas y transfectadas con adeno-o lentivirus para manipular la expresión génica. Su funcionalidad también puede ser analizado usando el sistema de MMSYS y técnicas de patch clamp.

Aislamiento, cultivo y caracterización funcional de ratón adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar, cultivar y visualizar la contracción y el manejo del calcio en cardiomiocitos adultos. Esto se logra primero extrayendo el corazón murino y colocándolo en tampón salino fosfato (PBS) a temperatura ambiente. El corazón puede ser canulado en el recipiente como se muestra en el dibujo, o directamente sobre la aguja conectada al sistema de perfusión, como se observa en la película.El tercer paso consiste en lavar y digerir el corazón mediante la perfusión de tampón y luego tampón enzimático a través del sistema. El paso final es cortar los ventrículos en un recipiente con tampón de transferencia y picar suavemente el tejido con pinzas. En última instancia, los resultados pueden mostrar la contracción celular y el manejo del calcio en cardiomiocitos individuales mediante mediciones de toda la célula y/o de la longitud del sarcómero y mediciones ratiométricas.Indicadores de calcio como RO 2:00 AM con el sistema óptico iónico. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque puede ser complicado colgar rápidamente el corazón a través de la aorta sin dañar el vaso o el propio corazón. Inyecte ratones adultos de aproximadamente 12 semanas de edad con 150 USP de heparina sódica en el espacio abdominal.Si el ratón está deshidratado, inyecte un cc de solución salina. Anestesie al ratón con una inyección de la mezcla de ketamina y xilacina a una dosis dependiente del peso; se verifica que los ratones estén profundamente anestesiados mediante la pérdida del reflejo de pellizco en los dedos de las patas traseras y la disminución de la frecuencia respiratoria. Sujete firmemente al ratón sedado sobre la almohadilla quirúrgica, luego extirpe el corazón y colóquelo en un recipiente con solución salina fisiológica.Utilizando gafas de disección de visión óptima, identifique y exponga la aorta. No es necesario eliminar el tejido alrededor de la aorta para el aislamiento celular. Mientras la raíz aórtica sea claramente visible, purgue la bomba con tampón de perfusión.Comience a bombear a alta velocidad para llenar las líneas y verifique la ausencia de burbujas. Luego, bombee a baja velocidad para establecer el caudal para la perfusión cardíaca. Utilice un baño de agua circulante para mantener la temperatura del tampón de perfusión a 37 grados Celsius.Utilice pinzas de disección microquirúrgicas para colocar la aorta sobre la aguja como si fuera un calcetín. Asegúrese de que el extremo de la aguja quede en la aorta ascendente, idealmente en la raíz aórtica distal a la arteria innominada derecha. A continuación, sujete el corazón a la aguja atando un trozo de seda quirúrgica de 10 centímetros alrededor de la parte superior de la aorta.Asegúrese de que el nudo esté al nivel de la aorta ascendente por debajo de la arteria braquiocefálica derecha, pero también por encima del extremo de la aguja y por encima de la válvula aórtica. Ahora baje el corazón al interior del cono. Esto ayuda a mantener la temperatura ambiente.Perfunda el corazón con tampón de perfusión durante cinco minutos a una velocidad de un mililitro por minuto, y cierre la salida de la cámara de vidrio para permitir que el PERFU ocho se acumule en el recipiente cónico de vidrio y envuelva el corazón. En este momento, debería observar un aumento en el volumen del corazón. Además, la sangre en el tejido cardíaco será reemplazada por el PERFU ocho, lo que provocará palidez del tejido.Detenga la bomba para mover el tubo desde el recipiente del tampón de perfusión hasta el recipiente del tampón enzimático. Suelte la pinza de salida para drenar el PERFU ocho. Reinicie la bomba para comenzar a perfundir el corazón.Con el tampón enzimático a un mililitro por minuto, cierre nuevamente el flujo de salida para permitir que el tampón enzimático envuelva el corazón. A medida que la enzima perfunde el corazón y digiere el tejido conectivo, el corazón se volverá más pálido y su integridad estructural disminuirá. Para el principiante, es útil conectar la línea de perfusión a un manómetro.El manómetro también puede utilizarse para asegurar que la posición de la aguja esté por encima de la válvula aórtica y no en el ventrículo. Una presión baja indica que la aguja se encuentra en la cámara ventricular, y una presión alta indica que la aguja está tocando la válvula. Cuando el corazón se esté digiriendo, la presión disminuirá rápidamente, ya que el tejido conectivo no mantiene la resistencia.Para determinar cuándo cortar los ventrículos del corazón digerido, saque el corazón del vaso cónico, presiónelo suavemente con pinzas y recoga unas gotas de PERFU ocho en una pequeña placa de Petri para verificarlo. Si aparecen células individuales en ocho a diez minutos, la presión ventricular habrá disminuido y debería poder observar cómo las células individuales entran en el Perfu. Ocho tan pronto como se observe cualquiera de estos signos, corte los ventrículos del corazón y colóquelos en un recipiente lleno de tampón de transferencia A para una preparación más uniforme.Recorte y retire el ventrículo derecho, dejando el ventrículo izquierdo para picarlo y estudiarlo. Si se desea analizar el ventrículo derecho, este puede picarse tras su separación. Utilice pinzas de disección microscópicas para picar cada ventrículo por separado. Una digestión exitosa dejará casi sin trozos sólidos de tejido tras el picado, con la mayor parte del tejido volviéndose amorfo tras la disociación.Para disociar aún más el tejido, páselo a través de una pipeta Pasteur de plástico de la cual se ha cortado la punta. En un ángulo de 45 grados, sujete un trozo de malla cuadriculada a un embudo pequeño utilizando pinzas y coloque este aparato de filtración en un tubo de 15 mililitros. Utilice la pipeta Pasteur modificada para retirar la solución celular del recipiente y filtre la solución hacia el tubo de 15 mililitros.Deje que las células vivas se sedimenten en el fondo del tubo, lo cual tomará unos minutos. Dividir el volumen en dos tubos proporciona una sedimentación más rápida. Precipitación después de Ali.Coloque 2,5 mililitros de cada una de cuatro soluciones de calcio en cuatro tubos separados de 15 mililitros. Utilice la pipeta estándar para transferir cuidadosamente el sedimento celular al primer tubo con solución de calcio. Permita que las células sedimenten en el fondo del tubo y repita el proceso.Transferir las células sedimentadas a través de cada una de las soluciones de calcio. Cuando las células se transfieran a la cuarta solución de calcio, tape el tubo y colóquelo de lado. Encender el sistema MM SIS asegurándose de que la lámpara de arco se inicie primero.Luego, prepare el sistema con tampón de calcio B. Conecte los tubos de la bomba a las entradas y salidas correspondientes de la cámara cis MM. Fije un cubreobjetos de vidrio de tamaño adecuado, típicamente de 20 por 25 milímetros, en la cámara. Transfiera 500 microlitros de la solución celular a un tubo pequeño de extremo redondo.Añada 0,5 microlitros de PHE 2:00 AM a las células y permita que incuben a temperatura ambiente y en la oscuridad durante cinco a siete minutos, tras oscurecer la habitación. Ahora, comience cuidadosamente a hacer fluir el tampón de calcio B a través de la cámara. Una vez iniciado el flujo, y no antes, comience a aumentar la temperatura de la cámara hasta 37 grados Celsius.Utilice una pipeta modificada para cargar una o dos gotas de solución celular sobre el cubreobjetos, dependiendo de la concentración celular, y permita que las células sedimenten. La densidad de las células en la cámara debe ser tal que se puedan observar fácilmente células individuales no superpuestas en la plataforma de adquisición de datos del sistema.Asegúrese de que la cámara esté conectada al myo Pacer mediante los cables de conexión e inicie el ajuste del voltaje y la frecuencia para el experimento. Elija una célula que esté latiendo a la frecuencia correcta y colóquela dentro de la abertura de encuadre. Ajuste las dimensiones de la cámara y de la abertura de encuadre para que toda la célula quede en el centro de la ventana, orientada horizontalmente, con los sarcómeros claramente visibles.A continuación, coloque la caja en una zona de la célula que contenga sarcomeros bien definidos y ajuste el enfoque para optimizar el pico del espectro de potencia. Ajuste también el brillo del microscopio para optimizar la ventana de suavizado azul y la información de contraste negro. Encienda el fotomultiplicador e inicie la grabación.Después de que se hayan registrado suficientes datos, haga clic en pausa para detener temporalmente la grabación. No haga clic en detener. Esto finalizará la grabación y no se podrá registrar ningún fondo para esa celda.Ahora, sin alterar el enfoque ni las dimensiones de la ventana de visualización, mueva la platina del microscopio a un área de la cubierta en la que no se puedan ver células ni material celular. Luego, haga clic en continuar para registrar una medición de fondo. Después de que se haya registrado suficiente fondo, haga clic en detener para finalizar la grabación.Luego, haga clic en guardar archivo para guardar todos los trazos de esa célula en un solo archivo ZPT. El aislamiento de cardiomiocitos adultos da como resultado células alargadas, estriadas y quiescentes que no laten espontáneamente; la punta de flecha muestra células muertas redondeadas sin estriaciones. Las células quiescentes pueden cultivarse y transfectarse con adenovirus para manipular la expresión génica. Después de 24 horas de cultivo, la morfología de las células vivas no cambia.Todavía son tolerantes al calcio y pueden ser estimulados mediante estimulación eléctrica. Es factible obtener un rendimiento de 85 a 90 % de células viables. Se utilizó el sistema MM SIS para medir la contractilidad y el transitorio de calcio de los miocitos obtenidos de un ratón C57 negro seis de tipo silvestre, simultáneamente.La medición de la contractilidad y el manejo del calcio se realizó midiendo la relación entre las formas unidas y no unidas de fura 2: las mediciones de la relación a las 2:00 AM pueden variar ligeramente entre diferentes configuraciones, pero las células sanas suelen obtener puntuaciones entre 1,5 y 2,5. Para analizar los datos de los rastros de contractilidad y calcio, los rastros se promediaron para crear un rastro característico para cada célula. Utilizando un algoritmo de análisis de transitorios mono, disponible en los parámetros del software sys, se generaron los parámetros de función sistólica y diastólica a partir de los rastros característicos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar cardiomiocitos marinos adultos individuales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

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