Name: Aislamiento, cultivo y caracterización funcional de ratón adulto Cardiomyoctyes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-24T18:10:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Aprenda a aislar cardiomiocitos de ratón adulto mediante perfusión Langendorff para estudios de contracción y manejo de calcio. Este método permite el cultivo y análisis funcional de células cardíacas viables.

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<ol><li>Chlopcikova, S., Psotová, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+rat+cardiomyocytes-a+model+for+the+study+of+morphological%2C+biochemical+and+electrophysiological+characteristics+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Papers%22%5BJournal%5D)">Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart.</a> Biomedical Papers. , (2001).</li>
<li>Rosenthal, N., Brown, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+ascending%3A+perspectives+for+human-disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mouse ascending: perspectives for human-disease models.</a> Nat. Cell Biol. 9, 993-999 (2007).</li>
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<li>Lieu, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+Transverse+Tubules+Contributes+to+Non-Uniform+Ca+2%2BWavefronts+in+Mouse+and+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Absence of Transverse Tubules Contributes to Non-Uniform Ca 2+Wavefronts in Mouse and Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Stem Cells and Development. 18, 1493-1500 (2009).</li>
<li>Lim, H., De Windt, L., Mante, J., Kimball, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+cardiac+hypertrophy+in+transgenic+disease+models+by+calcineurin+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Reversal of cardiac hypertrophy in transgenic disease models by calcineurin inhibition.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 32 (4), 697-709 (2000).</li>
<li>Muthuchamy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+a+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+mutation+in+alpha-tropomyosin+manifests+cardiac+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse model of a familial hypertrophic cardiomyopathy mutation in alpha-tropomyosin manifests cardiac dysfunction.</a> Circ. Res. 85, 47-56 (1999).</li>
<li>Müller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+the+cardiac+sodium+calcium+exchanger+promoter+in+adult+and+neonatal+cardiomyocytes+by+Nkx2.5+and+serum+response+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 34, 807-821 (2002).</li>
<li>Epstein, F., Hunter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+for+cardiac+hypertrophy+and+failure%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure.</a> New England Journal of Medicine. 341 (17), 1276-1283 (1999).</li>
<li>Snopko, R., Aromolaran, A., Karko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+modifies+Ca+2%2B+signaling+during+excitation-contraction+coupling+in+neonate+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Cell culture modifies Ca 2+ signaling during excitation-contraction coupling in neonate cardiac myocytes.</a> Cell Calcium. , (2007).</li>
<li>Ranu, H., Terracciano, C., Davia, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Na%2B%2FCa2%2B-exchanger+overexpression+on+excitation-contraction+coupling+in+adult+rabbit+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effects of Na+/Ca2+-exchanger overexpression on excitation-contraction coupling in adult rabbit ventricular myocytes.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 34 (4), 389-400 (2002).</li>
<li>Kaab, S., Nuss, H. B., Chiamvimonvat, N., O'Rourke, B., Pak, P. H., Kass, D. A., Marban, E., Tomaselli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+mechanism+of+action+potential+prolongation+in+ventricular+myocytes+from+dogs+with+pacing-induced+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs with pacing-induced heart failure.</a> Circ. Res. 78 (2), (1996).</li>
<li>Splawski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+of+SCN5A+sodium+channel+implicated+in+risk+of+cardiac+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Variant of SCN5A sodium channel implicated in risk of cardiac arrhythmia.</a> Science. 297, 1333-1336 (2002).</li>
<li>Zhou, Y., Wang, S., Zhu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+adenoviral+infection+of+adult+mouse+cardiac+myocytes%3A+methods+for+cellular+genetic+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279 (1), 429-436 (2000).</li>
<li>Sussman, M., Lim, H., Gude, N., Taigen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+cardiac+hypertrophy+in+mice+by+calcineurin+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition.</a> Science. , (1998).</li>
<li>Heinzel, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+diazoxide-induced+formation+of+reactive+oxygen+species+and+loss+of+cardioprotection+in+connexin+43+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Impairment of diazoxide-induced formation of reactive oxygen species and loss of cardioprotection in connexin 43 deficient mice.</a> Circ. Res. 97, 583-586 (2005).</li>
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<li>Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J., Chein, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+atrial-specific+and+inducible+expression+of+an+atrial+natriuretic+factor+transgene+in+an+in+vivo+murine+model+of+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).</li>
<li>Nakamura, A., Rokosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LV+systolic+performance+improves+with+development+of+hypertrophy+after+transverse+aortic+constriction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">LV systolic performance improves with development of hypertrophy after transverse aortic constriction in mice.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281 (3), 1104-1112 (2001).</li>
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<li>Liao, R., Jain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+analysis+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional analysis of adult mouse cardiomyocytes.</a> Methods Mol. Med. 139, 251-262 (2007).</li>
<li>Volz, A., Piper, H. M., Siegmund, B., Schwartz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+of+adult+ventricular+rat+heart+muscle+cells+in+serum-free+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Longevity of adult ventricular rat heart muscle cells in serum-free primary culture.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 161-173 (1991).</li>
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<li>Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+Clamp+and+Perfusion+Techniques+for+Studying+Ion+Channels+Expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes.</a> J. Vis. Exp. (47), e2269(2011).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+Clamp+Recording+of+Ion+Channels+Expressed+in+Xenopus+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes.</a> J. Vis. Exp. (20), e936(2008).</li>
<li>Arman, A. C., Sampath, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+Clamp+Recordings+from+Mouse+Retinal+Neurons+in+a+Dark-adapted+Slice+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation.</a> J. Vis. Exp. (43), e2107(2010).</li>
<li>Wen, H., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+patch+clamp+recordings+from+motor-neuron+and+target+skeletal+muscle+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Paired patch clamp recordings from motor-neuron and target skeletal muscle in zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (45), e2351(2010).</li>
<li>Maier, S., Westenbroek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpected+role+for+brain-type+sodium+channels+in+coupling+of+cell+surface+depolarization+to+contraction+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An unexpected role for brain-type sodium channels in coupling of cell surface depolarization to contraction in the heart.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (6), 4073-4078 (2002).</li>
<li>Shroff, S. G., Saner, D. R., Lal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+micromechanical+properties+of+cultured+rat+atrial+myocytes+measured+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic micromechanical properties of cultured rat atrial myocytes measured by atomic force microscopy.</a> Am. J. Physiol. 269, 286-292 (1995).</li>
<li>Domke, J., Parak, W. J., George, M., Gaub, H. E., Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+mechanical+pulse+of+single+cardiomyocytes+with+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope.</a> European Biophysics Journal. 28, 179-186 (1999).</li>
<li>Smith, B. A., Tolloczko, B., Martin, J. G., Grütter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+Viscoelastic+Behavior+of+Cultured+Airway+Smooth+Muscle+Cells+with+Atomic+Force+Microscopy%3A+Stiffening+Induced+by+Contractile+Agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Probing the Viscoelastic Behavior of Cultured Airway Smooth Muscle Cells with Atomic Force Microscopy: Stiffening Induced by Contractile Agonist.</a> Biophysical Journal. 88, 2994-3007 (2005).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

En este informe, hemos descrito las técnicas necesarias para el éxito en el aislamiento y la cultura de los adultos los CM del corazón de ratón. Nuestra técnica permite para el estudio posterior de la función de CM y la excitabilidad usando los métodos descritos anteriormente. El parámetro crítico para el estudio de la funcionalidad de adultos CM es la salud y la calidad de los CM aislado. Como se describió anteriormente, nuestras técnicas permiten un alto rendimiento de células funcionales que son susceptibles a la man...

Los modelos murinos de enfermedad cardiovascular han servido como herramientas eficaces para la aclaración de los mecanismos fundamentales de la enfermedad 1,2, así como para la identificación de dianas terapéuticas potenciales 1,3. En particular, el uso de ambos modelos murinos de enfermedad cardíaca adquirida (tales como presión de la sobrecarga) 4,5 y modelos de ratones transgénicos han avanzado nuestra comprensión de la enfermedad cardíaca 6-8. El uso de técnicas de cultivo celular para estudiar las cascadas de señalización 3,9,10 y alteraciones en las proteínas individuales que subyacen en la excitabilidad celular y el acoplamiento excitación-contracción en el corazón 11-13 en el nivel de la célula individual han complementado los in vivo en modelos de ratón. Sin embargo, la falta de líneas celulares adecuadas que reflejan la estructura y función CM adultos ha sido una limitación significativa. Los investigadores han intentado superar esta mediante el estudio de proteínas individuales, tales como canales de iones, en sistemas de expresión heterólogos <sup&gt; 14, y si bien estos estudios nos han proporcionado información útil en términos de la biofísica de los canales iónicos o el tráfico de proteínas, la representación inadecuada del microambiente natural de los CM es una limitación importante. En segundo lugar, ya que la mayoría de estas células heterólogas no tienen un aparato contráctil madura, no ha sido posible estudiar la función contráctil y la compleja interacción entre la excitabilidad celular y la contracción. Por esta razón, los investigadores han recurrido a los cultivos de células cardíacas primarias para muchos de sus estudios funcionales in vitro. Por último, los estudios de cardiomiocitos aislados permiten la evaluación de la función contráctil sin los factores de confusión de preparación multicelular, incluyendo el efecto de la cicatriz o fibrosis y orientación de la fibra. Cardiomiocitos ventriculares de rata neonatales primarios (NRVMs) son relativamente fáciles de cultivar, pueden ser infectados con adenovirus y lentivirus de manipular la expresión génica 15, unapor lo tanto, ND se han utilizado con éxito 1, pero tienen limitaciones de su propia. A pesar de que proporcionan un microambiente fisiológico 1 y han sido el caballo de batalla del campo de la señalización, las diferencias sustanciales entre la morfología y la organización subcelular de NRVMs y cardiomyoctyes adultos les hacen un modelo inadecuado para la investigación de los flujos iónicos y acoplamiento excitación-contracción en el corazón adulto . Más notablemente NRVMs carecen de un-t tubular subsistema definitiva 4. Desde Ca 2 + flujo y la dinámica son críticamente dependientes madura t-tubular y retículo sarcoplásmico (SR) Estructura 6, Ca 2 + y la dinámica de los estudios funcionales de la contractilidad cardíaca en NRVMs no son un reflejo exacto de estos procesos críticos en cardiomiocitos adultos. Además, algunos componentes de las vías de señalización diferentes entre ratones recién nacidos y adultos 9, proporcionando así otra limitación para el estudio de los procesos de enfermedad y de su impact en la excitabilidad celular y la contractilidad en NRVMs. Finalmente, la distribución de la maquinaria contráctil conduce a multidireccional y no uniforme acortamiento celular limitar la exactitud de las mediciones contráctiles. El uso de aislados cardiomiocitos adultos ofrece, por tanto, un sistema de modelado más preciso in vitro. El extraordinario crecimiento del conocimiento posible gracias a la manipulación genética de los ratones subraya la importancia de la obtención de cardiomiocitos aislados funcionales de los ratones. De hecho, la caracterización de los CM adultas aisladas de modelos de ratón ha arrojado luz sobre muchos eventos biológicos y patológicos. CM aisladas de modelos de ratones transgénicos han permitido estudios de la ganancia o pérdida de la función de las proteínas en las propiedades contráctiles de las células individuales 2,16, y la viabilidad de modelos de enfermedades, como la isquemia / reperfusión 17,18, complementando así la información obtenida a partir de Estudios in vivo sobre lalos ratones se. El uso de aislados adultos CM de modelos murinos de enfermedad cardiaca adquirida 3,19,20 (como transversal sobrecarga de presión inducida por la constricción aórtica, que imita la hipertensión o estenosis de la válvula aórtica) o el ejercicio 5,21 (para el modelado de la hipertrofia fisiológica) permite un examen de la interacción de las cascadas de señalización implicadas en estos procesos con la excitabilidad celular y el acoplamiento excitación-contracción en el nivel de la célula individual. Además, la capacidad de manipular la expresión génica utilizando la expresión génica adenoviral impulsada en adultos CM nos proporciona la oportunidad de diseccionar los componentes de las vías de señalización complejos. Desde una perspectiva electrofisiológico, voltaje de células enteras y los experimentos de fijación actuales en aislados adulto CM han sido fundamentales en el esclarecimiento de la naturaleza de los flujos iónicos al inicio del estudio y en varios estados de la enfermedad. Debido a la compleja estructura de la membrana celular y la protección de bi diferencialen las estructuras de andamiaje entre el adulto y los CM NRVMs o líneas celulares heterólogos, la capacidad para reparar las células adultas da una mejor representación de los efectos de ciertas proteínas de membrana, proteínas estructurales, y socios de canales iónicos que interactúan sobre los componentes electrofisiológicas del corazón adulto. A pesar de estas ventajas importantes en el estudio de adultos cardiomiocitos murinos, aislamiento y cultivo de cardiomiocitos ratones adultos ha sido un reto, instando a la necesidad de una descripción sistemática y precisa de la metodología para aislar cardiomiocitos viables de ratón y de mantenerlas en cultivo para permitir su posterior manipulación genética utilizando viral vectores. Estudios previos han utilizado ya sea de forma aguda aislada de ratón adulto CM o cultivados de rata adulta CM. Estos últimos son más fáciles de cultivar que los CM ratón adulto, y la mayoría de los experimentos de manipulación de la expresión génica in vitro han utilizado ratas adultas CM. Pocos estudios se han alterado con éxito e investigado functila expresión de genes onal en ratón adulto CM, presentando una gran limitación en el alcance de los experimentos. Por lo tanto, aquí presentamos en detalle tales metodologías, modificado a partir de investigaciones anteriores, para el aislamiento 7,8,22, cultura 3,10,15,23, infección adenoviral 11-13,15, y el análisis funcional de cardiomyoctyes ventriculares de ratón adulto. Este protocolo de aislamiento resultados en Ca 2 +, cardiomiocitos excitables tolerantes que tenemos cultivadas con éxito durante un máximo de 72 horas y transitoriamente transfectadas con adenovirus. La funcionalidad de estas células aisladas se puede evaluar utilizando el sistema de imágenes MMSYS 14,24 y de patch clamp, que también será discutido.

<table><tbody><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa mínima</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Monóxido de 2,3-butanediona</td><td>Sigma</td><td>B0752</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa B</td><td>Roche Ciencia Aplicada</td><td>11088807001</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa D</td><td>Roche Ciencias Aplicadas</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Proteasa XIV de Streptomyces griseus</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de Suero Bovino</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Medios esenciales mínimos</td><td>Sigma</td><td>51411C</td><td></td></tr><tr><td>Solución de albúmina de suero bovino</td><td></td><td>Sigma A8412</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Medios de insulina-transferrina-selenito de sodio suplemento</td><td>Sigma</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de cesio</td><td>Sigma</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/289329?lang=en&amp; region=US" target="_blank">289329</a></td><td></td></tr><tr><td>Glutamato</td><td>Sigma</td><td>G3291</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5'-trifosfato sal de magnesio</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Etilenglicol-bis(2-amin&#8211; thylether)-N,N,N',N'-ácido tetraacético</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Solución de hidróxido de cesio</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>solución de hidróxido de tetraetilamonio</td><td>Sigma</td><td>86643</td><td></td></tr><tr><td>OptiVisor visera binocular de vidrio óptico</td><td>Dohegan Optical Company Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de tejido, 5.5", 1x2 dientes</td><td>Pinza Roboz Scientific</td><td>RS-8164</td><td></td></tr><tr><td>Moloney - 4.5" (11.5 cm) de largo ligera curva, dentada </td><td>Pinzas Roboz Scientific</td><td>RS-8254</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3, Dumostar, tamaño de la punta 0.17 x 0.10mm</td> Pinza para mosquitos <td>Roboz Scientific</td><td>RS-4966</td><td></td></tr><tr><td>Packer 5" recta plana</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-7114</td><td></td></tr><tr><td>Micro tijeras de disección 4.5" curvadas afiladas/afiladas </td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-5917</td><td></td></tr><tr><td>Micro tijeras de disección 3.5" rectas afiladas/afiladas20mm</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-5907</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento, cultivo y caracterización funcional de ratón adulto cardiomyoctyes

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

El uso de los cardiomiocitos primarios (CM) en la cultura ha proporcionado un poderoso complemento de los modelos murinos de enfermedad cardíaca en el avance de nuestra comprensión de las enfermedades del corazón. En particular, la capacidad para estudiar la homeostasis de iones, la función del canal de iones, la excitabilidad celular y el acoplamiento excitación-contracción y sus alteraciones en condiciones de enfermedad y por mutaciones causantes de enfermedades han conducido a una mejor aproximación a las enfermedades cardíacas. Por otra parte, la falta de una línea celular inmortalizada adecuada para imitar adultos CM, y las limitaciones de los CM neonatal (que carecen de muchas de las biomecánica característica estructural y funcional de los adultos CM) en la cultura han dificultado la comprensión de la compleja interacción entre las vías de señalización, canales iónicos y las propiedades contráctiles del corazón adulto fortalecer la importancia del estudio de cardiomiocitos adultos aislados. A continuación, presentamos los métodos para el aislamiento, cultivo, manipulación de la expresión génica mediante adenovirus-expreproteínas ssed, y posterior análisis funcional de los cardiomiocitos de ratón adulto. El uso de estas técnicas ayudará a desarrollar una visión mecanicista en las vías de señalización que regulan la excitabilidad celular, Ca 2 + dinámica y la contractilidad y ofrecer una caracterización mucho más fisiológicamente relevantes de la enfermedad cardiovascular.

El aislamiento de los adultos cardiomyoctyes resultados en las células en forma de barra, estriados y de reposo (no de forma espontánea de latir) (Figura 5A). Las células muertas se verá redondeado y sin estrías estarán presentes. Las células quiescentes pueden ser cultivadas y transfectadas con adenovirus para manipular la expresión génica (figuras 5B y 5C). Después de 24 horas de cultivo, la morfología de las células vivas no cambia, siguen siendo Ca 2 +-tolerant...

Aquí se describe el aislamiento de cardiomyoctyes adultas de ratón utilizando un sistema de perfusión Langendorff. Las células resultantes son de Ca2 +-tolerante, eléctricamente en reposo y pueden ser cultivadas y transfectadas con adeno-o lentivirus para manipular la expresión génica. Su funcionalidad también puede ser analizado usando el sistema de MMSYS y técnicas de patch clamp.

Aislamiento, cultivo y caracterización funcional de ratón adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar, cultivar y visualizar la contracción y el manejo del calcio en cardiomiocitos adultos. Esto se logra primero extrayendo el corazón murino y colocándolo en tampón salino fosfato (PBS) a temperatura ambiente. El corazón puede ser canulado en el recipiente como se muestra en el dibujo, o directamente sobre la aguja conectada al sistema de perfusión, como se observa en la película.El tercer paso consiste en lavar y digerir el corazón mediante la perfusión de tampón y luego tampón enzimático a través del sistema. El paso final es cortar los ventrículos en un recipiente con tampón de transferencia y picar suavemente el tejido con pinzas. En última instancia, los resultados pueden mostrar la contracción celular y el manejo del calcio en cardiomiocitos individuales mediante mediciones de toda la célula y/o de la longitud del sarcómero y mediciones ratiométricas.Indicadores de calcio como RO 2:00 AM con el sistema óptico iónico. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque puede ser complicado colgar rápidamente el corazón a través de la aorta sin dañar el vaso o el propio corazón. Inyecte ratones adultos

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Los cultivos primarios de cardiomiocitos de ratón son una de las herramientas fundamentales para la investigación de la organización miofibrilar y la función. El siguiente protocolo describe el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos primarios de corazones de ratón neonatales. Los cultivos de cardiomiocitos resultantes pueden usarse posteriormente para una variedad de ensayos biomecánicos, bioquímicos y de células biológica.

Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales Ratón

Se pueden aislar del corazón cardiomiocitos individuales de ratones de tipo salvaje y mutantes para estudiar su contractilidad y transitorios de calcio. Esto permite caracterizar la contribución de la disfunción celular a la disfunción cardíaca por cualquier causa.

Aislamiento y fisiológica Análisis de Ratón cardiomiocitos

Se describe un método fiable para el aislamiento de cardiomiocitos de ratón adulto. Este protocolo se obtiene un resultado coherente para el cultivo de cardiomiocitos adultos funcionales a partir de una variedad de ratones modificados genéticamente.

Aislamiento y cultivo de ratón adulto cardiomiocitos de Señalización Celular y<em&gt; In vitro</em&gt; Hipertrofia Cardíaca

Este protocolo describe un método paso a paso para el aislamiento reproducible y el cultivo a largo plazo de cardiomiocitos de ratón adultos con alto rendimiento, pureza y viabilidad.

Aislamiento, cultivo y la transducción de cardiomiocitos de ratones adultos

Métodos se demuestran para el aislamiento de miocitos nódulo sinoauricular (SAMs) de ratones adultos para estudios de electrofisiología de pinzamiento zonal o de formación de imágenes. Las células aisladas se pueden utilizar directamente o se pueden mantener en cultivo para permitir la expresión de proteínas de interés, tales como la prensa codificados genéticamente.

Los métodos para el aislamiento, cultivo y caracterización funcional de los miocitos del nodo sinusal ratones adultos

El objetivo general de este artículo es estandarizar el protocolo para el aislamiento, caracterización y diferenciación de células madre cardiacas (CSCs) desde el corazón de ratón adulto. Aquí, describimos un método de centrifugación del gradiente de densidad para aislar las CMC murinas y métodos elaborados por la cultura, la proliferación y la diferenciación en cardiomiocitos de CSC.

Aislamiento, caracterización y diferenciación de células cardiacas desde el corazón de ratón adulto

Este protocolo se utiliza para aislar cardiomiocitos auriculares individuales del corazón adulto del ratón utilizando un enfoque de digestión de trozos. Este enfoque se utiliza para aislar los miocitos auriculares derecho o izquierdo que se pueden utilizar para caracterizar la electrofisiología de miocitos auriculares en estudios de abrazaderas de parches.

Aislamiento de miocitos auriculares de ratones adultos

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento, la transfección y el cultivo a largo plazo de los cardiomiocitos adultos de ratón y rata.

Aislamiento, Transfección y Cultura a Largo Plazo de Cardiomiocitos adultos de ratón y rata

Se describe un método para el aislamiento simultáneo de micocitos y no miocitos tanto de las adriículas como de los ventrículos de un solo corazón de ratón adulto. Este protocolo da como resultado rendimientos consistentes de micocitos cardíacos altamente viables y no miocitos y detalla condiciones óptimas de cultivo específicos de células para fenotipado y análisis in vitro.

Aislamiento simultáneo y cultura de los miocitos atriales, los miocitos ventriculares y los no miocitos de un corazón de ratón adulto

El estándar de oro en cardiología para experimentos funcionales celulares y moleculares son los cardiomiocitos. Este artículo describe adaptaciones a la técnica no Langendorff para aislar cardiomiocitos de ratón.

Un método simple y efectivo para aislar consistentemente cardiomiocitos de ratón

Aprenda a aislar cardiomiocitos de ratón adulto mediante perfusión Langendorff para estudios de contracción y manejo de calcio. Este método permite el cultivo y análisis funcional de células cardíacas viables.

Aislamiento, cultivo y caracterización funcional de ratón adulto Cardiomyoctyes

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