Evaluación de la función sensoriomotora en modelos de ratón de la enfermedad de Parkinson

El objetivo general de estos procedimientos es evaluar cuantitativamente la función del motor del sensor. En ratones. Logramos esto mediante el uso de una batería de pruebas de comportamiento sensibles.

Estos incluyen la actividad espontánea del recorrido desafiante de la viga en el cilindro y la prueba de eliminación de adhesivo, que también se conoce como prueba DOT. Después de las pruebas, se pueden anotar las grabaciones de video del recorrido del haz y la actividad espontánea. En última instancia, estas pruebas se pueden utilizar para caracterizar la función sensora o motora en nuevos modelos genéticos de ratón, así como en estudios preclínicos de fármacos que estudian posibles terapias para la enfermedad.

Por lo tanto, la principal ventaja de estas pruebas sobre otras pruebas, especialmente las automatizadas, es que encontramos que son altamente sensibles a la disfunción motora, más sensibles que pruebas como la del vástago del rotor. Sin embargo, además, estas pruebas son realmente muy rentables, especialmente en comparación con las automatizadas, que pueden costar hasta miles de dólares. Estas pruebas pueden responder preguntas clave en el campo de los trastornos del movimiento en general, y son medidas de resultado muy útiles.

Al probar posibles terapias, el haz se configura invirtiendo tres jaulas de ratón limpias sobre una mesa o en una jaula de ratón. Al cambiar la campana extractora, alinee las jaulas de manera uniforme para que puedan soportar la longitud de una viga de un metro. A continuación, ensamble las cuatro secciones de la viga desde la sección más ancha hasta la más estrecha y colóquelas encima de las jaulas de ratones invertidas.

Coloca la jaula de los ratones que planeas probar de lado en el extremo del haz de modo que el extremo más estrecho del haz conduzca directamente a la jaula de inicio. Para comenzar la prueba asistida, levante al primer ratón por la base de su cola y sostenga sus extremidades traseras con la palma de su mano. Coloque el mouse en el extremo ancho de la viga y suelte su cola y retire la mano.

Deje que el ratón olfatee y se mueva para orientarse mejor hacia el aparato. Si el ratón gira suavemente, rediríjalo a la dirección deseada. Para animar al ratón por el camino, levante la jaula de inicio, manteniéndola en la misma posición de lado, y acérquela al ratón de prueba.

A medida que el ratón comience a intentar entrar en la jaula de inicio, muévalo hacia atrás para que el ratón no entre, sino que dé un paso adelante. Finalmente, permita que el mouse ingrese a la jaula de la casa. Realice el mismo procedimiento con cada ratón de la jaula.

Limpie a fondo la viga entre jaulas con una solución de limpieza de habitaciones para animales dentro de una jaula. Es importante limpiar la orina o los gránulos fecales del haz antes de ejecutar el siguiente ratón, ya que esto distraerá al siguiente. Una vez que todos los ratones de la jaula hayan pasado por una prueba asistida, vuelva a coger el primer ratón y colóquelo en el extremo ancho del haz si es necesario.

Oriente suavemente el ratón en la dirección deseada y toque ligeramente su parte trasera para animarlo a moverse a lo largo del haz hacia su jaula de origen, corrija al ratón si deja de olfatear o se aleja del haz. Ten tu mano cerca para guiar al ratón hasta el final del haz. Minimice las paradas y la exploración mientras está en la viga.

Cuanto más se hace esto durante el entrenamiento, menos tiende a hacerlo el ratón. Durante la prueba, la prueba termina cuando el ratón coloca una de sus cuatro extremidades en la jaula de inicio, el siguiente ratón puede recibir su segunda prueba. Los ratones reciben un total de cinco ensayos en el primer día de entrenamiento, alternando entre ratones, de modo que cada ratón tiene un intervalo entre ensayos de 30 segundos o más.

El segundo día, realice cinco pruebas más para cada ratón utilizando la misma configuración de haz que en el primer día, los ratones no deberían necesitar ninguna ayuda, pero es posible que deban corregirse o tocarse en la parte trasera para evitar detenerse o explorar. 24 horas después, comience el día de la prueba. Coloque la viga de manera similar a los dos días de entrenamiento anteriores.

Sin embargo, coloque una rejilla de malla que corresponda a cada ancho de viga en la parte superior de cada sección de viga. Utilice una cámara de video para grabar todas las pruebas de recorrido del haz antes de que comience cada prueba. Etiquete una tarjeta con la información esencial del experimento, como la fecha, el número de ratón y el número de prueba, y colóquela frente a la cámara.

Grabe durante dos o tres segundos antes de cada prueba para que quede claro qué ratón se está probando y en qué prueba se encuentra. Para cada prueba, coloque el ratón sobre la superficie de la cuadrícula en la sección más ancha y registre a medida que se mueve a lo largo del registro del haz para que toda la longitud del cuerpo del ratón sea visible. La cámara debe colocarse de manera que la cuadrícula esté en el centro del visor.

Ejecute cada mouse a través de la prueba cinco veces en el haz de superficie de la cuadrícula, limpiándolo entre cada mouse. Para montar el experimento de actividad espontánea, coloque dos jaulas una al lado de la otra a unos 18 centímetros de distancia para que los frentes de las jaulas queden mirando hacia el experimentador. Si es necesario, coloque una jaula adicional detrás de las otras dos jaulas para que sirva de soporte para el espejo.

A continuación, coloque un trozo de vidrio encima de las dos jaulas y colóquelo de modo que el vidrio quede apoyado en el borde exterior de las dos primeras jaulas. Luego coloque un cilindro encima del vidrio y un espejo en ángulo debajo del vidrio. Apoyado en la tercera jaula de espaldas.

El ángulo puede oscilar entre 30 y 45 grados, pero lo que es más importante, la vista desde la cámara debe incluir el diámetro completo del cilindro. Una vez que el experimento esté configurado, coloque la cámara de video frente al espejo y ajuste tanto el espejo como la cámara de video hasta que pueda ver todo el diámetro de la parte inferior del cilindro. A continuación, pon un temporizador durante tres minutos y etiqueta una tarjeta con los detalles importantes del experimento como en el vídeo del experimento anterior.

Graba la etiqueta durante dos o tres segundos. Entonces detente. Para realizar el experimento, coloque un ratón en el cilindro.

Presione grabar e inicie el temporizador. Graba el ratón durante tres minutos. Es importante que el área de prueba esté en silencio, ya que los ruidos fuertes y la conversación pueden distraer al mouse y potencialmente causar un comportamiento de congelación.

Durante el experimento, use un contador de mano para contar el número de traseros que hace el mouse mientras está en el cilindro. Un trasero se define como un movimiento vertical con ambas extremidades caídas del suelo, de modo que el ratón está parado solo sobre sus extremidades traseras. Una vez que expire el temporizador, retire el mouse y vuelva a colocarlo en su jaula de casa.

Limpie el cilindro y el vidrio con una solución de limpieza para habitaciones de animales entre cada mouse. Deje que la solución de limpieza se seque antes de pasar al siguiente mouse. Comience la prueba de eliminación de adhesivo colocando al ratón en su jaula de casa.

Una vez retirado el contenedor de alimentación, permita que los ratones se habitúen a la sala de pruebas y a la jaula sin el comedero. Durante una hora para la prueba, use una jaula limpia para colocar a los compañeros de jaula de modo que el ratón de prueba sea el único en la jaula doméstica. Retire tres cuartas partes de la ropa de cama y colóquela en la jaula limpia con los compañeros de jaula en la jaula de casa.

Frote el ratón de prueba para sujetarlo con un par de pinzas pequeñas, coloque una etiqueta adhesiva en el sslt del ratón. Presione suavemente la etiqueta en el hocico con las pinzas y suelte el ratón. Coloque la tapa en la jaula y ponga en marcha un cronómetro cuando el ratón intente quitar las etiquetas con sus cuatro poros.

Registre la hora si el mouse hace contacto, pero no quita la etiqueta. Registre la hora, pero mantenga el temporizador en marcha hasta que lo haga. Retíralo por completo.

Si el ratón no entra en contacto con la pegatina ni la retira en un plazo de 60 segundos, finalice la prueba y retire la pegatina manualmente. Después de cada prueba, coloque el ratón de prueba en la jaula de retención y comience a probar el siguiente ratón. Todos los ratones reciben tres ensayos alternos entre ratones.

En lugar de hacer las tres pruebas en un ratón a la vez, no se cuentan las pruebas en las que la etiqueta se cae o no es segura en los hocicos. La desafiante actividad espontánea del haz en el cilindro y las pruebas de eliminación de adhesivo son ensayos muy útiles de la función motora del sensor en ratones en la desafiante prueba del haz, los ratones TH uno alfa-sinucleína cometen significativamente más errores por paso que los ratones de tipo salvaje. El número de errores aumentó en los ratones alfa-sinucleína a medida que el haz se hacía más estrecho.

Este no fue el caso de los ratones de tipo salvaje. Esta misma línea de ratones también muestra una fuerte disminución en los pasos de las extremidades traseras en la prueba del cilindro. Estos resultados muestran que la sobreexpresión de alfa humano en el núcleo de los ratones mutados conduce al desarrollo de déficits motores sensorales detectables.

Finalmente, en la prueba de eliminación de adhesivo, PITX tres ratones akia con una profunda disminución de las neuronas dopaminérgicas nigrostriatal muestran un aumento significativo del tiempo de contacto en comparación con los controles de tipo salvaje. Nosotros y otros usamos estas pruebas de forma rutinaria para evaluar el potencial terapéutico de los tratamientos para la enfermedad de Parkinson. Estas pruebas también se pueden utilizar para caracterizar modelos genéticos de ratón y para determinar las consecuencias de mutaciones específicas en la función sensoriomotora.