Direct Imaging de calcio ER con Targeted-esterasa inducida colorante de carga (TED)

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar la dinámica del calcio directamente en la luz del retículo endoplásmico de las células vivas. Esto se logra transduciendo las células con el colorante inducido por esterasa dirigida o la construcción del vector TED para sobreexpresar la carboxeratasa CS dos en el retículo endoplásmico. A continuación, las células se incuban con el aceto metil éster de calcio indicador flu oh five NA, que se difunde a través de las membranas plasmáticas y del RE.

Luego, la carboxiesterasa se desprende. El grupo éster libera el indicador sensible al calcio en el sistema de emergencias. Se forman complejos de lúmenes y calcio fluorescentes.

Se obtienen resultados que muestran cambios en la concentración de calcio libre en el RE basados en imágenes de células vivas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la regulación de la homeostasis del calcio celular. Las señales de calcio se monitorean con mayor frecuencia en el citosol, por lo tanto, no se puede distinguir fácilmente dónde fluye el calcio hacia el citosol desde el espacio extracelular o desde el almacenamiento de calcio intracelular del RE.

Para superar esta limitación, hemos desarrollado la descarga inducida por esterasa dirigida. Con este método, el calcio liberado por el RE se controla directamente. El enfoque no es disruptivo.

La membrana plasmática permanece intacta y las cascadas de señalización intracelular se conservan. Por lo general, las personas con un método difícil porque necesitan experiencia. En la expresión de vectores TED, hemos desarrollado construcciones vectoriales que expresan una proteína cent fusionada con la carboxilasa CES dos.

Esto nos permite identificar fácilmente las células adecuadas para la obtención de imágenes de calcio AR durante los experimentos, que se caracterizarán por una fuerte fluorescencia roja y solo una fluorescencia indicadora de calcio de moderada a fuerte. Estas etiquetas fluorescentes deben estar distribuidas uniformemente por todo el retículo endoplásmico y están ausentes en la región nuclear. Antes de empezar.

Prepare líquido cefalorraquídeo artificial o A LCR y gripe oh cinco NAM de acuerdo con el protocolo de texto. Precaliente el líquido cefalorraquídeo A a temperatura ambiente y agregue glucosa profunda, airee el líquido cefalorraquídeo A con carbógeno durante cinco minutos. A continuación, añada un molar de cloruro de calcio y cloruro de magnesio hasta concentraciones finales de dos milimolares cada una.

Después de iniciar el microscopio de imágenes en vivo y el programa informático, comience la profusión en una cámara de imágenes ficticia y equilibre el sistema de tubos, precaliente el calentador de solución en línea y la cámara de imágenes en la etapa del microscopio y equilibre el sistema a 32 a 37 grados Celsius. Antes de comenzar el procedimiento de descarga para cargar el tinte en las células, agregue 100 microlitros de LCR A precalentado a una alícuota de 0,5 microlitros de cinco milimolares y cinco NAM, y solubilice la solución en un baño de agua sonicateado durante 90 segundos, transfiera 400 microlitros de solución de imagen precalentada a un pocillo de una placa de cuatro o 24 pocillos. Agregue la solución D al mismo pocillo para producir 500 microlitros de una solución de cinco micromolares.

A continuación, coloque cuidadosamente un cubreobjetos con células en el pocillo incubar durante un período de tiempo adecuado En una incubadora de cultivo celular a 37 grados Celsius, el tiempo de carga de DI y la concentración de D dependen del tipo de célula, la densidad celular y las necesidades específicas de los experimentos. Los tiempos de incubación prolongados pueden dañar las células, especialmente las células primarias y gliales, y esto es fundamental para la respuesta a los estímulos fisiológicos. La incubación de más de 30 minutos solo será útil para los experimentos de localización de calcio del RE para investigar la distribución del calcio del RE en microdominios pequeños, por ejemplo, MUEs de espinas Inmediatamente después de la incubación, transfiera el cubreobjetos a otro pocillo de cultivo celular que contenga una solución de imagen.

Para prepararse para el montaje de las celdas en la cámara de imágenes, utilice un pincel para aplicar grasa de alto vacío a la cámara de imágenes. Utilizamos cámaras de imagen de fabricación propia para cubreobjetos de 10 a 12 milímetros con un volumen pequeño, lo que permite altas velocidades de perfusión de hasta 15 veces el intercambio de tampón por minuto. Recoja la hoja de cubierta con la gripe oh cinco y las celdas cargadas y agregue una pequeña gota de solución de imágenes para mantenerla húmeda.

A continuación, dé la vuelta al cubreobjetos y monte las células en la cámara de imágenes. Use un hisopo de algodón para presionar el cubreobjetos en el pegamento de silicona y para limpiar los residuos de tampón de la parte inferior del cubreobjetos de vidrio. A continuación, cambie la cámara de imágenes ficticias por la cámara de imágenes experimentales.

Lavar las células durante cinco a 10 minutos por perfusión continua para la selección de células. Utilice una cantidad mínima de iluminación láser para evitar el fotoblanqueo rápido de la gripe oh cinco y el calcio dos en la sala de emergencias, una alta velocidad de escaneo de dos a cuatro hercios, un tamaño de imagen pequeño y una configuración de alta ganancia en el microscopio. De acuerdo con el experimento de la planta.

Al comienzo del experimento, documente la distribución celular de la etiqueta de gripe oh cinco y calcio y la etiqueta fluorescente roja de la construcción de cel esterasa de carbox rojo. En su celda de interés aquí, las neuronas representativas por pilas de imágenes X, YZ de alta resolución realizan imágenes XYT para monitorear la dinámica del calcio ER en las condiciones experimentales específicas. Los ajustes típicos de nuestro sistema se enumeran en la tabla dos del protocolo de texto: Monitorizar los cambios en el calcio del RE bajo perfusión continua con solución de imagen, las tasas de intercambio del tampón son de 1,5 mililitros por minuto para el lavado celular y el agotamiento del almacén mediante el bloqueo del calcio del retículo endoplásmico sarco, dos TPAs y tres mililitros por minuto para la estimulación por un TP y DHPG, y un agonista para el receptor de glutamato metabotrópico.

Aquí, las células gliales se estimulan con 200 micromolares A TP durante 10 segundos. Para procesar las imágenes, abra la pila de imágenes en el programa Image J para imágenes multicolor. Divida los canales RBG cuando el software lo solicite.

Identifique las regiones de interés. Dependiendo del propósito, dibuje regiones de interés alrededor del RE completo o regiones pequeñas del RE. Utilice el complemento del analizador de series temporales para leer la intensidad media de píxeles en una región de interés.

Calcule los cambios relativos corregidos de fondo en la fluorescencia por delta F sobre F cero usando esta fórmula. Presentan cambios relativos en la fluorescencia como una traza con delta F sobre F cero para el eje Y y tiempo para el eje x. En esta figura, los astrocitos corticales y las neuronas del hipocampo de las células A expresan un vector TED fluorescente rojo y están marcados con el indicador de calcio de baja afinidad.

El complejo indicador de calcio fluorescente se localiza en el retículo endoplásmico de todos los tipos de células. Esta figura muestra las células gliales marcadas con cinco N de la gripe. Durante el tratamiento con NIC, se observa un marcaje citosólico brillante si la membrana plasmática de una célula está dañada antes y después del tratamiento con NIC.

Esto revela que la gripe oh cinco N también es liberada en el citosol por las esterasas endógenas. En este experimento, después del marcaje de TED con gripe oh cinco N, la depleción de calcio de las neuronas del hipocampo cultivadas es causada por el ácido ciclónico circa bloqueante. Nótese que el enorme cambio en la densidad de fluorescencia media por región de interés que se observa aquí es una serie de lapso de tiempo con células GL cortico de ratón que se estimulan con un TP. La fluorescencia cae bruscamente y se recupera, lo que representa la liberación y el rellenado de calcio del RE. Al mismo tiempo, la fluorescencia de la proteína fluorescente roja disminuye marginalmente como consecuencia de los diagramas de blanqueo de pizarra que muestran el cambio en la intensidad de la fluorescencia a lo largo del tiempo en algunos experimentos, pero no en todos.

Los valores de fluorescencia no vuelven a los niveles iniciales de intensidad de fluorescencia porque algunos complejos de gripe de cinco N se pierden durante la estimulación. Esta película muestra una célula BHK 21 infectada con carboxilasa a alta resolución marcada por complejos de calcio de cinco N y estimulada con un TP. Obsérvese que en las estructuras finas de los túbulos del RE se visualiza una liberación de calcio inducida por TP y una recarga de las reservas de calcio del RE. Al asistir a este procedimiento, es importante recordar que solo las células perfectamente sanas muestran respuestas fisiológicas de calcio.

Por lo tanto, recomendamos realizar una serie de experimentos de homeostasis de calcio interrelacionados en un día con el mismo lote de células. Según nuestra experiencia, el tinte gripe de cinco N funciona mejor, pero este indicador de calcio no es muy resistente a la ruptura. Por lo tanto, este método se beneficiará del desarrollo de indicadores de calcio de baja afinidad más resistentes a la lejía.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo obtener imágenes transitorias de calcio E con indicadores sintéticos de calcio de baja afinidad. Estos indicadores permiten monitorizar la dinámica del calcio con una alta resolución temporal. Por esta razón, nuestro método puede ser beneficioso para la investigación de las cascadas de señalización de calcio involucradas en la plasticidad sináptica y para monitorear los cambios en la homeostasis del calcio en modelos celulares para enfermedades neurodegenerativas.